Nicht-invasive Quantifizierung der Skelettmuskulatur bei Kleintieren mittels Mikro-Computertomographie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet Mikro-Computertomographie, um eine kostengünstige Quantifizierung der fettfreien Masse zu ermöglichen, einschließlich Skelettmuskel- und Viszeralgewebe, Fettgewebe und Skelettgewebe bei Kleintieren. Sie unterscheidet zwischen magerem und fettem Gewebe, was für die biomedizinische Forschung, insbesondere in der translationalen Forschung an Kleintieren, erhebliche Vorteile bietet.

Zusammenfassung

Größe, Masse und Zusammensetzung der Skelettmuskulatur sind entscheidende Eigenschaften für die Untersuchung von Stoffwechsel- und Muskelerkrankungen, da sie sich direkt auf das Verständnis des Krankheitsverlaufs und der Behandlungsergebnisse auswirken. Die Quantifizierung der mageren, Fett- und Skelettmasse eines lebenden Tieres ist wichtig für metabolische, physiologische, pharmakologische und gerowissenschaftliche Studien. Genaue Messungen der Körperzusammensetzung, insbesondere der fettfreien Masse, bleiben jedoch aufgrund der inhärenten Einschränkungen herkömmlicher Bewertungstechniken eine Herausforderung. Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein nicht-invasives radiologisches Verfahren, das eine hochauflösende Visualisierung innerer Strukturen in Kleintiermodellen ermöglicht. Eine standardisierte Mikro-CT-Methode kann die translationale Forschung mit zuverlässigeren und aussagekräftigeren Ergebnissen erheblich verbessern, insbesondere bei Alterungsstudien oder zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb desselben Tieres. Trotz ihres Potenzials behindert die mangelnde Standardisierung der Bildaufnahme- und Analysemethoden die Vergleichbarkeit der Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg erheblich. Darin stellen wir ein umfassendes und detailliertes kostengünstiges Protokoll für die Magermassenanalyse mittels Mikro-CT vor, um diese Herausforderungen zu bewältigen und die Konsistenz in der Forschung mit Kleintiermodellen zu fördern.

Einleitung

Größe, Masse und Zusammensetzung sind entscheidende Eigenschaften der Skelettmuskulatur für die Untersuchung muskelbezogener und metabolischer Krankheitsmechanismen¹. Sarkopenie, Kachexie, Atrophie und Myopathien haben gemeinsame Phänotypen: Verringerung der Masse, Veränderung der Zusammensetzung und Beeinträchtigung der Muskelfunktion 2,3,4,5. Die Quantifizierung der Körperzusammensetzung eines lebenden Tieres bleibt jedoch nach wie vor hochkomplex und technisch anspruchsvoll⁶.

Die primären Methoden für die In-vivo-Bildgebung und die Analyse der Körperzusammensetzung sind die Dual-Energy-Röntgen-Absorptiometrie (DXA), die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT). Diese Methoden werden hauptsächlich zum Screening und zur Überwachung von Krankheiten eingesetzt, die zu einer Verringerung der fettfreien Masse führen 7,8,9,10,11. DXA ist aufgrund seiner geringeren Kosten der Goldstandard für die Analyse der Körperzusammensetzung. Allerdings hat die DXA im Vergleich zu MRT und CT einen wesentlichen Nachteil: Sie ist nicht in der Lage, Muskel- und Fettgewebe räumlich aufzulösen¹.

Die MRT verwendet starke Magnetfelder und Radiowellen, um detaillierte Bilder der inneren Strukturen des Körpers zu erzeugen¹². Einer der Hauptvorteile gegenüber der CT ist die überlegene Kontrastauflösung, die eine hervorragende Unterscheidung zwischen verschiedenen Weichteiltypen ermöglicht ^1,13,14. Im Gegensatz zur CT kommt bei der MRT keine ionisierende Strahlung zum Einsatz, was sie bei wiederholter Anwendung sicherer macht^15,16. Die MRT ist jedoch teurer und weniger zugänglich, mit längeren Scanzeiten und höheren Wartungskosten^13,17. Daher sind MRT-Instrumente, die für die Kleintieranalyse geeignet sind, in der Regel nicht verfügbar.

Die Mikro-CT ähnelt der konventionellen CT, ist jedoch auf kleine Strukturen und die biomedizinische Forschung zugeschnitten¹⁸. Die Mikro-CT ist eine fortschrittliche, nicht-invasive radiologische Bestimmungstechnik, die eine detaillierte Visualisierung der inneren Strukturen in Kleintiermodellen ermöglicht. Die Mikro-CT verwendet Röntgenstrahlen, um detaillierte Bilder der inneren Strukturen des Körpers zu erstellen, wobei sie sich auf die unterschiedliche Abschwächung der Röntgenstrahlen durch verschiedene Gewebetypen stützt. Bei einer Mikro-CT-Untersuchung liegt die Maus auf einem Tisch, der sich langsam durch eine kreisförmige Gantry bewegt. Im Inneren der Gantry dreht sich eine Röntgenröhre um die Maus und sendet Röntgenstrahlen aus verschiedenen Winkeln aus. Detektoren auf der gegenüberliegenden Seite fangen diese Röntgenstrahlen ein, nachdem sie den Körper passiert^{haben 18}.

Die Software des Mikro-CT-Scanners verarbeitet die Daten aus diesen verschiedenen Blickwinkeln, um zweidimensionale Schnittbilder (Schnitte) des Körpers zu rekonstruieren. Durch die Rekonstruktion können diese Schnitte kombiniert werden, um die innere Anatomie umfassend darzustellen¹⁹. Die Bilder, die durch Mikro-CT-Scans erzeugt werden, basieren auf dem unterschiedlichen Grad der Röntgenabschwächung durch verschiedene Gewebe im Körper. Diese Dämpfung wird mit Hilfe der Hounsfield Units (HU) quantifiziert, einer Skala, die die Radiodichte ^20,21 standardisiert. Die HU-Skala ist für die Segmentierung von grundlegender Bedeutung, da jede Struktur einen leicht unterschiedlichen Wert hat.

In diesem Artikel haben wir HU-Werte verwendet, um genau zwischen Knochen, magerem Gewebe und Fettgewebe zu unterscheiden¹. Durch den Verweis auf etablierte HU-Bereiche stellten wir eine genaue Analyse und einen Vergleich der Körperzusammensetzung sicher. Darin zeigen wir, wie Bilder mit Mikro-CT aufgenommen werden und wie sie bei der Visualisierung und Quantifizierung von Mager-, Fett- und Skelettmasse angewendet wird.

Protokoll

Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Die Scans wurden an männlichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 6 und 22 Monaten durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Betäuben Sie Mäuse mit 2 % Isofluran in einem Gemisch aus Sauerstoff, das durch Verdampfung abgegeben wird. Verwenden Sie einen Präzisionsverdampfer sowohl für die Induktion als auch für die Wartung mit einer Mischung aus 100% Sauerstoff unter Verwendung eines Präzisionsverdampfers.
2. Positionieren Sie das anästhesierte Tier in Rückenlage mit einem Mausbett auf dem Mikro-CT-Scan. Sichern Sie die Maus mit Klebeband, um Bewegungen während des Scans zu minimieren, und setzen Sie sie dann in das Portal ein.
3. Stellen Sie während des gesamten Versuchs, der etwa 10 Minuten dauert, sicher, dass das Tier eine Maske trägt, um es unter der Narkoseebene zu halten, während es die Erhaltungsdosis nach Bedarf erhält.

2. Bilderfassung und -rekonstruktion

1. Erfassen Sie Mikro-CT-Scans des Körpers mit einem hochauflösenden präklinischen Bildgebungssystem. Erfassen Sie insgesamt 1.024 Projektionen mit einer Belichtungszeit von jeweils 470 ms mit einer Rotation im Fly-Modus bei einer Spannung von 60 kV und einem Strom von 480 μA. Stellen Sie das System auf eine Vergrößerung von 1,25 ein, was zu einem Sichtfeld (FOV) von 94,72 mm für eine Gesamterfassungszeit von 8,02 Minuten führt. Erfassen Sie Bilder mit einem Binning von 1 x 1, was zu einer Auflösung von 2.368 x 2.240 Pixeln führt.
   HINWEIS: Die in diesem Manuskript verwendete Ausrüstung für Mikro-CT-Bilder weist aufgrund der Überlappung mit der Anästhesiemaske Einschränkungen bei der Erstellung von Kopfbildern auf. Außerdem wird nicht die gesamte Schwanzlänge erfasst. Daher schlossen wir die Kopf- und Schwanzanalyse aus (siehe Abschnitt 3).
2. Führen Sie einen Scan mit den gleichen Parametern an einem zylindrischen Phantom aus Acryl (Durchmesser: 2,5 cm, Länge: 11,5 cm) durch, das zur Hälfte mit destilliertem Wasser gefüllt ist, um die HU für Luft und Wasser zu bestimmen. Rekonstruieren Sie nach Abschluss der Aufnahmen die Bilder mit der Aufnahmesoftware mit den für die Rauschunterdrückung optimierten Einstellungen und dem FBP-Algorithmus (Filtered Back Projection). Rekonstruktion von Tier- und Phantombildern mit einer isotropen Voxelgröße von 147 μm und einer 640er Matrix.
3. Extrahieren Sie Luft- und Wasser-HU aus dem Phantom (Rohdaten) mit der referenzierten Software. Konvertieren Sie die Bilder in DICOM-Dateien und korrigieren Sie die HU-Werte.

3. Bildanalyse

1. Hochladen einer Datei
   HINWEIS: Micro-CT ist eine Technik, bei der Bilder zeitlich und räumlich erfasst und eine Bildsequenz erzeugt werden. Daher ist es notwendig, den gesamten Ordner und nicht ein einzelnes Bild zu öffnen.
   1. Suchen Sie im oberen linken Bereich der Benutzeroberfläche das Menü 3D-Slicer , das in einer graublauen Farbe hervorgehoben ist. Klicken Sie auf Daten hinzufügen ().
   2. Wenn ein Fenster mit zwei Optionen angezeigt wird, wählen Sie die erste Option aus: Verzeichnis zum Hinzufügen auswählen.
   3. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die DICOM-Bilderserie für das Zieltier enthält, und klicken Sie darauf. Diese Aktion öffnet den Ordner in der Software, so dass alle Bilder gleichzeitig angezeigt werden können.
   4. Beobachten Sie die Bilder, die auf drei Bildschirmen angezeigt werden. Jeder Bildschirm repräsentiert eine andere anatomische Ebene: koronal, sagittal und quer, gekennzeichnet durch die Farben Grün, Gelb und Rot.
2. Segmentierung
   1. Suchen Sie den Segment-Editor () auf der oberen Registerkarte (Module) und klicken Sie darauf.
   2. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche + Hinzufügen , um Segmente zu erstellen und den HU-Bereich zu definieren.
   3. Erstellen Sie Segmente für Knochen, mageres Gewebe und Fettgewebe, indem Sie jeweils 3x klicken.
   4. Doppelklicken Sie auf jedes Segment, um es entsprechend den gewünschten Einstellungen zu benennen und einzufärben.
   5. Legen Sie den HU-Bereich für jedes Segment mit der Funktion Schwellenwert fest, die sich auf der linken Seite des Fensters befindet. Suchen Sie dazu die Funktion Schwellenwertbereich und geben Sie die HU-Werte für jeden Gewebetyp ein: Mageres Gewebe (-29 bis 225 HE), Fettgewebe (-190 bis -30 HE), Knochen (500 bis 5.000 HU). Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen.
      HINWEIS: Siehe Ergänzende Abbildung S1 für HU-Wertvergleiche.
   6. Wiederholen Sie den Segmentierungsprozess für jeden Gewebetyp.
   7. Klicken Sie auf 3D anzeigen , um ein 3D-Rendering zu generieren.
      HINWEIS: Das Rendering wird im blauen Quadranten des Displays angezeigt.
3. Reinigen des Bildes
   HINWEIS: Nach der Segmentierung und dem 3D-Rendering müssen Fremdelemente ausgeschlossen werden, um sicherzustellen, dass sie nicht in die volumetrischen Messungen von magerem Gewebe, Fettgewebe und Knochen einbezogen werden. Das Entfernen dieser Artefakte ist wichtig, um eine genaue Analyse zu gewährleisten.
   1. Suchen Sie das Werkzeug "Schere" () im Menü Segmentierung .
   2. Wählen Sie entweder die anatomische Ebene oder das 3D-Rendering, um eine klarere Ansicht des zu entfernenden Objekts zu erhalten.
      1. Wenn Sie eine anatomische Ebene verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ansicht maximieren " () auf dem farbigen Balken der Ebene. Verwenden Sie im Fenster der anatomischen Ebene die Mausscrolltaste, um vorwärts oder rückwärts durch den CT-Scan zu navigieren.
         HINWEIS: Jedes Fenster kann unabhängig voneinander gescrollt werden.
      2. Verwenden Sie zum 3D-Rendern die linke Maustaste, um um eine beliebige Achse zu drehen, und die rechte Maustaste, um die Ansicht zu vergrößern.
         HINWEIS: Mit den Pfeiltasten auf der Tastatur kann das Bild auch gedreht werden.
   3. Wenn das Scherenwerkzeug ausgewählt ist, markieren Sie die Segmentierung um das unerwünschte Objekt und kreisen Sie es ein, um es aus dem Bild zu entfernen. Die Software löscht das Objekt automatisch.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Vorgang "Innen löschen " ausgewählt ist. Wenn das verwendete Gerät Bilder für ein nichtbiologisches Bild erzeugt, wie z. B. die Perle, das Anästhetikum oder das chirurgische Gerät, ist es wichtig, es zu entfernen. Wenn ein anatomischer Bereich nicht vollständig erhalten wird, ist es außerdem von grundlegender Bedeutung, eine anatomische Referenz zu erstellen, um diese Bereiche zu entfernen, die nicht vollständig erhalten wurden, um die Wiederholbarkeit zwischen den Experimenten zu gewährleisten. Unerwünschte Objekte müssen in jeder Ebene entfernt werden.
   4. Klicken Sie auf das Symbol für das Layout der Wiederherstellungsansicht (), um unabhängig vom ausgewählten Fenster zum Bildschirm mit den vier Fenstern zurückzukehren.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Fenster, in denen das Objekt entfernt werden muss.
4. Volumen der Segmentierung
   1. Quantifizieren Sie nach der Segmentierung die Volumina der Segmente mit der Quantifizierungsfunktion im Dropdown-Menü.
      HINWEIS: Für diese Aktion müssen alle Segmentierungen sichtbar sein.
   2. Navigieren Sie zu Quantifizierung | Segment-Statistiken. Klicken Sie auf Übernehmen und warten Sie, bis die Software eine Tabelle mit den Werten für jede Segmentierung erstellt hat. Die Software stellt für jede Segmentierung zwei Volumenwerte zur Verfügung: Labelmap (LM) und Closed Surface (CS).
      HINWEIS: Der LM-Wert eignet sich im Allgemeinen für die Berechnung von Segmentvolumen, wobei die Anzahl der Voxel multipliziert mit dem Volumen eines einzelnen Voxels verwendet wird. CS Value verwendet ein geglättetes Oberflächenmodell und integriert das Volumen basierend auf dreieckigen Oberflächenelementen. CS orientiert sich stärker an den anatomischen Konturen und wird für genaue Messungen empfohlen.
   3. Um Daten von einem neuen Tier hochzuladen, speichern und schließen Sie die Szene im Dateimenü .
5. Analyse der körperlichen Zusammensetzung
   1. Verwenden Sie die von der Software bereitgestellten Volumenmessungen in cm³ , um diese Volumina in Gewebemasse umzurechnen und die entsprechende Dichte für jeden Gewebetyp anzuwenden. Es sind die folgenden Gewebedichten zu verwenden, die von der Internationalen Kommission für Strahlungseinheiten und -messungen²² festgelegt wurden: 0,95 g/cm³ (Fettgewebe), 1,05 g/cm³ (mageres Gewebe) und 1,92 g/cm³ (Skelettgewebe)².
      1. Um die Gewebemasse zu berechnen, multiplizieren Sie das von der Software erhaltene Volumen (cm³) mit der jeweiligen Gewebedichte (g/cm³):
         Fettgewebsmasse:_{Volumensegmentierung} x 0,95 = Masse_Fett
         Magere Gewebemasse:_{Volumensegmentierung} x 1,05 =_Magere Masse
         Skelettgewebemasse:_{Volumensegmentierung} x 1,92 = Masse_Skelett
         Gesamtmasse: Masse_Fett + Masse_mager + Masse_Skelett = Masse_Gesamt
6. Messung der Knochenlänge
   HINWEIS: Um die Gewebemasse nach Knochenlänge für bestimmte Analysen zu korrigieren, ist es notwendig, bestimmte Knochenlängen zu erhalten.
   1. Kehren Sie zum Menü "Segment-Editor " zurück. Blenden Sie die Segmentierungen von Fettgewebe und magerem Gewebe aus, indem Sie auf das Augensymbol () neben jedem Segment klicken.
      HINWEIS: Nur die Segmentierung, die dem Skelettgewebe entspricht, sollte sichtbar bleiben.
   2. Wählen Sie die Option Markups/Symbolleiste umschalten () in der oberen Ecke des Hauptmenüs. Dadurch wird ein sekundäres Menü direkt unter dem Hauptmenü geöffnet. Suchen Sie die Schaltfläche Neue Zeile erstellen ().
   3. Navigieren Sie nach dem Klick auf den Button Neue Linie erstellen zur 3D-Rekonstruktion und identifizieren Sie den zu vermessenden Knochen.
      HINWEIS: Die empfohlenen Knochen sind die Tibia oder Femur²².
   4. Sobald der Knochen identifiziert ist, klicken Sie mit der linken Maustaste auf ein Ende des Knochens und erneut auf das andere Ende des Gewebes. Diese Aktion ermöglicht es der Software, die Knochengröße zu berechnen.
      HINWEIS: Um konsistente Messungen zu erzielen, wählen Sie für jedes Tier die gleiche anatomische Region des Knochens aus. So wird beispielsweise der Hüftkopf als ein Ende und der laterale Kondylus als anderes Ende des Femurs verwendet.
7. Datenanalyse und Normalisierung
   HINWEIS: Die Massendaten können wie in Abschnitt 3.5 beschrieben abgerufen und so verwendet werden, wie sie sind. Alternativ können die Mager-, Fett- und Knochenmasse auf zwei Arten normalisiert werden.
   1. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Gewebemasse und dem Gewicht des Tieres am Tag der Bildaufnahme.
      Normalisierung auf Gewicht:_Magermasse ÷ Körpergewicht
   2. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen Masse und Knochengröße (z. B. Oberschenkelknochen oder Schienbein).
      Normalisierung auf den Femur:_Massemager ÷_{Größe des Femurs}
      Normalisierung auf Tibia:_Magere Masse ÷ Größe_Tibia
      HINWEIS: Die Normalisierungsparameter werden basierend auf der experimentellen Fragestellung ausgewählt. Wenn Veränderungen der Knochengröße zu erwarten sind (z. B. beim Vergleich des Knochenumbaus), wird die Normalisierung nach Körpergewicht empfohlen (Punkt 3.7.1). Wenn in Ihrer experimentellen Fragestellung Änderungen des Körpergewichts zu erwarten sind, ist die Größe des langen Knochens der vorgeschlagene Normalisierungsparameter (Punkt 3.7.2).

Ergebnisse

Die richtige anatomische Positionierung des sedierten Tieres auf dem Bildgebungstisch gewährleistet konsistente und reproduzierbare Scanergebnisse und unterstreicht die Effektivität der Datenerfassung bei der Erzielung zuverlässiger Ergebnisse. Die richtige Sedierung von Tieren während der gesamten Bildgebung, einschließlich spezieller Gasabgabesysteme und Verdampfer, ist für eine präzise anatomische Beurteilung von grundlegender Bedeutung (Abbildung 1).

Abbildung 2 veranschaulicht die Segmentierung und das Rendering in verschiedenen anatomischen Ebenen und zeigt sequentielle Bilder in der koronalen, sagittalen und transversalen Ebene. Diese Bilder zeigen die allmähliche Segmentierung von Skelett-, Fettgewebe- und magerem Gewebe, die in einer gründlich segmentierten Darstellung gipfelt, die alle Gewebetypen integriert, eine klare Unterscheidung zwischen den Geweben hervorhebt und regionenspezifische Markierungen auf der Grundlage der identifizierten Gewebetypen zeigt. Trotz der Einschränkungen der Ausrüstung, die eine Ganzkörpererfassung ausschließen, liefert die Methode detaillierte Informationen über die Gewebeverteilung und -zusammensetzung über verschiedene anatomische Ebenen hinweg.

Abbildung 3 zeigt 3D-Renderings, die die Gewebetypen Knochen (blau), Fettgewebe (gelb) und mageres Gewebe (rot) hervorheben und eine umfassende Visualisierung anatomischer Strukturen bieten. Diese Visualisierung unterstreicht die Wirksamkeit des Protokolls bei der Erstellung detaillierter 3D-Modelle, die für anatomische Studien unerlässlich sind.

Tabelle 1 zeigt die normalisierten Gewebemassen (Magermasse, Körperfett und Skelettmasse) im Verhältnis zum Gewicht des Tieres am Tag der Bildgebung. Die dargestellten Werte ergeben sich aus der Multiplikation des Gewebevolumens (in cm³) mit der entsprechenden Gewebedichte, wie in Schritt 3.5.1.1 der Methodik beschrieben.

Tabelle 2 enthält absolute Werte für die Körperzusammensetzung, die die Massenverteilung und den Anteil an Magergewebe, Körperfett und Skelettgewebe jedes Tieres zeigen. Es ermöglicht uns, die Gesamtmenge jedes Gewebetyps zu beurteilen und zu beurteilen, wie sie zur Gesamtkörperzusammensetzung jeder Probe beiträgt.

Die ergänzende Tabelle S1 zeigt die Zeit, die jeder Analytiker benötigt, um die Analyse der Körperzusammensetzung für jedes Tier abzuschließen, und die Variabilität der Ergebnisse zwischen den Analytikern. Es wird bewertet, ob es bei der Messung von Körperzusammensetzungsmetriken wie Magermasse, Körperfettmasse und Skelettmasse eine signifikante Variabilität zwischen erfahrenen (Analysten 1, 2 und 5) und unerfahrenen Bedienern (Analysten 3 und 4) gibt.

Abbildung 4 zeigt eine vergleichende Analyse der Körperzusammensetzung zwischen erwachsenen und älteren Probanden. Es zeigt eine Verringerung des Anteils an fettfreier Masse und eine Zunahme des Körperfetts, was mit typischen Alterungsmustern übereinstimmt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Robustheit und Präzision des Bildgebungsprotokolls bei der Bereitstellung kritischer anatomischer Daten, die für die Weiterentwicklung präklinischer Forschungsmethoden unerlässlich sind.

Abbildung 1: Präparation von Tieren. (A) Die für die Sedierung von Tieren während des gesamten bildgebenden Prozesses verwendete Vorrichtung, wie z. B. Gaszuführsysteme und Verdampfer; (B) das Mikro-CT-Scansystem. (C) Das betäubte Tier liegt in Rückenlage auf einem Mäusebett. Die richtige Positionierung ist entscheidend, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Segmentierung und Visualisierung von Schnitten in verschiedenen anatomischen Ebenen. (A) Koronale Ebene, (B) Sagittalebene und (C) Transversalebene. Von links nach rechts zeigen die Bilder einen unsegmentierten Scan (grau), eine Knochensegmentierung (blau), eine Körperfettsegmentierung (gelb), eine Segmentierung von magerem Gewebe (rot) und schließlich eine vollständige Segmentierung, einschließlich aller Segmentierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: 3D-Renderings. Von links nach rechts zeigen die Bilder das 3D-Rendering des Motivs, wobei verschiedene Gewebetypen hervorgehoben werden: Knochen in Blau, Körperfett in Gelb, mageres Gewebe in Rot, und das endgültige Bild zeigt eine umfassende Ansicht, die Knochen, Fettgewebe und mageres Gewebe kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich der Körperzusammensetzung zwischen adulten und älteren Mäusen. Das Balkendiagramm zeigt die prozentuale Körperzusammensetzung des Skelettgewebes (Erwachsene: 10,5 ± 0,5 %; ältere Menschen: 9,9 ± 1,0 %, p = 0,19), des Körperfetts (Erwachsene: 17,2 ± 5,7 %; ältere Menschen: 27,9 ± 4,4 %, p = 0,03) und der fettfreien Masse (Erwachsene: 72,3 ± 5,7 %; ältere Menschen: 62,3 ± 3,6 %, p = 0,03). Die Daten werden als MEAN ± SD der Tiere dargestellt (Erwachsene: n = 3; ältere Menschen: n = 3). Die Statistik wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests mit einem One-Tail-p-Wert (* p < 0,05) berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MAGER
Tier-ID	Magere Masse (g)	Gewicht (g)	Normalisierung (Gewichtung)
Ältere Menschen 1	15.1	37.4	0.4
Ältere Menschen 2	14.4	44.4	0.3
Ältere Menschen 3	14.3	37.7	0.4
Erwachsener 1	12.3	29.1	0.4
Erwachsener 2	16.5	30.4	0.5
Erwachsener 3	16.1	31.7	0.5
KÖRPERFETT
Tier-ID	Körperfettmasse (g)	Gewicht (g)	Normalisierung (Gewichtung)
Ältere Menschen 1	6.4	37.4	0.2
Ältere Menschen 2	8.2	44.4	0.2
Ältere Menschen 3	5.3	37.7	0.1
Erwachsener 1	4.4	29.1	0.2
Erwachsener 2	2.7	30.4	0.1
Erwachsener 3	3.4	31.7	0.1
SKELETT
Tier-ID	Skelettmasse (g)	Gewicht (g)	Normalisierung (Gewichtung)
Ältere Menschen 1	2.3	37.4	0.06
Ältere Menschen 2	2.3	44.4	0.05
Ältere Menschen 3	2.4	37.7	0.06
Erwachsener 1	2.0	29.1	0.07
Erwachsener 2	2.3	30.4	0.08
Erwachsener 3	2.2	31.7	0.07

Tabelle 1: Normalisierung der Massen nach Tiergewicht am Tag der Bildgebung. Wie in Abschnitt 3.7 erläutert, kann die Masse des Gewebes durch das Gewicht des Tieres am Tag der Untersuchung normalisiert werden. Diese Normalisierung wurde auf mageres, Fettgewebe und Knochengewebe basierend auf dem Gewicht des Tieres angewendet.

Körperzusammensetzung (g)
	Segmentierungsvolumen x 1,05	Segmentierungsvolumen x 0,95	Segmentierung Volumen x 1,92	Schlank + Fett + Skelett
Tier-ID	Magere Masse (g)	Körperfettmasse (g)	Skelettmasse (g)	Gesamtmasse (g)
Ältere Menschen 1	15.1	6.4	2.3	23.8
Ältere Menschen 2	14.3	8.2	2.3	24.9
Ältere Menschen 3	14.3	5.3	2.4	22.0
Erwachsener 1	12.3	4.4	2.0	18.6
Erwachsener 2	16.5	2.7	2.3	21.5
Erwachsener 3	16.1	3.4	2.2	21.7
Körperzusammensetzung (%)
Tier-ID	Magere Masse (%)	Körperfettmasse (%)	Skelettmasse (%)	Gesamtmasse (%)
Ältere Menschen 1	63.6	26.8	9.6	100
Ältere Menschen 2	58.1	32.8	9.0	100
Ältere Menschen 3	64.9	24.1	11.0	100
Erwachsener 1	65.9	23.5	10.6	100
Erwachsener 2	76.8	12.4	10.9	100
Erwachsener 3	74.3	15.7	9.9	100

Tabelle 2: Zusammensetzung des Körpers. (A) die Körperzusammensetzung der Tiere in Gramm; (B) der prozentuale Anteil der Körperzusammensetzung.

Ergänzende Tabelle S1: Körperzusammensetzung, die von verschiedenen Operatoren bewertet wurde. Für jede Auswertung wurden die Magermasse, die Körperfettmasse, die Skelettmasse und die für die Analyse benötigte Zeit (in Minuten) aufgezeichnet. Die Analysten 1, 2 und 5 waren erfahrene Bediener, während die Analysten 3 und 4 unerfahren waren und nur das in der Studie beschriebene Protokoll befolgten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Dichtebereich verschiedener biologischer und nicht-biologischer Materialien. Die Abbildung veranschaulicht die Dichtebereiche verschiedener biologischer Gewebe und nicht-biologischer Substanzen. Die Werte wurden aus der Literatur gewonnen und angepasst, um eine optimale Gewebedifferenzierung zu erreichen. Knochen weisen die höchste Dichte auf, gefolgt von magerem Gewebe, während Körperfett eine deutlich geringere Dichte aufweist. Das Gerät wurde mit Wasser als Referenz bei einer Dichte von 0 kalibriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Auswertung durch Tomographie ist eine effektive und nicht-invasive Methode, um detaillierte Informationen über die Körperzusammensetzung zu erhalten. Insbesondere die Mikro-CT bietet wertvolle Outcome-Messungen für präklinische Studien. Im Knochenbereich hat die Mikro-CT unterschiedliche Anwendungen, da die Analyse der Mikroarchitektur²³ und der Knochenumbau²⁴ besonders interessant sind. Die Beurteilung der Morphologie der inneren biologischen Struktur ist auch in der biomedizinischen Forschung relevant, da die Analyse der Dichte des Gefäßsystems in einem bestimmten Gewebe dessen Funktion beurteilen und auf den Stoffwechsel schließen^{kann 25}. Für endokrine und metabolische Untersuchungen der Fettmasse liefert der Einsatz von Mikro-CT grundlegende Informationen bei lebenden Kleintieren^26,27. Darüber hinaus kann die Mikro-CT in anderen Bereichen wie der Zoologie und Botanik eingesetzt werden, wo sie zur Bewertung der Strukturen von kleinen Insekten und Pflanzen eingesetzt wird^28,29.

Eine wesentliche Einschränkung der Mikro-CT sind die hohen Kosten und der eingeschränkte Zugang zu Bildanalysesoftware. Darüber hinaus sind anatomische Vorkenntnisse, insbesondere in der Tieranatomie, für korrekte Messungen unerlässlich. In diesem Manuskript wird die 3D-Slicer-Software vorgestellt, die in der Lage ist, Ergebnisse zu erzielen, die mit kommerziellen Alternativen vergleichbar sind. Dieses System reduziert auch den Bedarf an umfangreichen anatomischen Kenntnissen, da es halbautomatisch³⁰ ist.

Die durch Mikro-CT gewonnenen und von der Software analysierten Bilder zeigten, dass die Körperzusammensetzung von Mäusen während des Alterns einen ähnlichen Verlauf wie der des Menschen nimmt, der durch eine Zunahme des Gesamtfettgewebes und eine gleichzeitige Abnahme der Magermasse gekennzeichnet ist³¹. Diese Ergebnisse zeigten sich beim Vergleich von erwachsenen Mäusen (6 Monate) mit älteren Mäusen (22 Monate).

Aufgrund der Einschränkungen der Geräte blockiert die Anästhesiemaske die Kopferfassung. Daher konnten wir nicht den gesamten Kopf erfassen und genau segmentieren. Als Ergebnis haben wir eine Konvention etabliert, um den Atlasknochen (C1) als anatomischen Referenzpunkt zu verwenden und unsere Analyse auf den Bereich unterhalb dieses Punktes in den hier verwendeten Geräten zu konzentrieren. Daher wurden alle Bilder oberhalb des C1 ausgewählt, um entfernt zu werden. Die Ausrüstung erreichte nicht die volle Hecklänge. Somit wurde bei allen Analysen der Schwanz aus dem basalen Bereich entfernt. Wir empfehlen dem Benutzer, anatomische Punkte für ausgewählte ausgeschlossene Bereiche festzulegen, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu erhalten.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Analyse tomographischer Bilder unter Verwendung eines zugänglichen und kostengünstigen Protokolls vorgestellt. Die Software unterschied erfolgreich zwischen drei Gewebetypen: Magermasse, Fettgewebe und Skelettgewebe. Es war jedoch nicht in der Lage, Skelettmuskeln von viszeralen Organen zu unterscheiden, eine häufige Herausforderung bei der Analyse der Körperzusammensetzung von Mäusen.

Der Mikro-CT fehlt die Fähigkeit, viszerales Gewebe und Skelettmuskelmasse zu unterscheiden. Trotz dieser Einschränkung zeigen unsere Ergebnisse den Wert der Software für die Untersuchung von Krankheiten, die sich auf die Körperzusammensetzung auswirken, insbesondere solche, die sich auf die Skelettmuskulatur auswirken, wie Hypertrophie oder Atrophie. Er kann als nicht-invasiver Test wiederholt werden und ermöglicht eine Längsschnittüberwachung der Körperzusammensetzung. Diese Fähigkeit hilft bei der Evaluierung von Schutzbehandlungen und der Entwicklung von Protokollen zur Modellierung vieler Stoffwechselkrankheiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3DSlicer, Version 5.6.2	3D Slicer platform		Eine kostenlose Open-Source-Software zur Bildanalyse und wissenschaftlichen Visualisierung.
Amide, Version 1.0.1	Amid-Plattform		Eine kostenlose Open-Source-Software zur Korrektur der Hounsfield-Unit-Werte in den verarbeiteten DICOM-Bildern.
Amira, Version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Wird verwendet, um Luft- und Wasserwerte der Hounsfield-Einheit aus den Rohdaten des Phantoms zu extrahieren und Bilder in DICOM-Dateien zu konvertieren.
Isoforin	Cristá lia		Isofluran ist ein nicht brennbares Flüssiganästhetikum zur Verwendung in der allgemeinen Inhalationsanästhesie durch Verdampfung.
Triumph XO-Subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced-Subsystem für die präklinische Bildgebung von Kleintieren mit hochauflösenden CT- und PET-Funktionen für quantitative und qualitative Analysen.