Trotz erheblicher Anstrengungen zur Behandlung chronischer Wunden ist der Erfolg begrenzt. Die zellulären und molekularen Prozesse, die die normale Heilung stören und zur Entstehung und Entwicklung chronischer Wunden beitragen, sind nicht gut verstanden. Daher hat sich die Entwicklung wirksamer Behandlungen für diese Wunden als Herausforderung erwiesen. Dies liegt vor allem daran, dass es an Tiermodellen mangelt, die chronische Wunden beim Menschen nachahmen, und daran, dass Experimente an Menschen mit chronischen Wunden begrenzt sind. Zuvor haben wir ein Mausmodell zur Untersuchung chronischer Wunden veröffentlicht, die viele Merkmale mit diabetischen chronischen Wunden beim Menschen teilen. Dieses Modell beinhaltet das Vorhandensein von Biofilmen, die auf natürliche Weise aus Bakterien gebildet werden, die in der Hautmikrobiota und der Umwelt vorkommen, ohne dass externe Bakterien in die Wunden eingebracht werden müssen. Daher kann dieses Modell möglicherweise das grundlegende Verständnis dafür verbessern, wie Wunden chronisch werden. Hier stellen wir Ihnen ein Update des ursprünglichen Protokolls zur Entwicklung dieses Mausmodells vor. Wir haben uns darauf konzentriert, die Sterblichkeit von Mäusen von ~30% auf ~5% zu senken. Wir beschreiben auch, wie dieses Modell verwendet wurde, um die Initiierung und das Fortschreiten der Wundchronizität zu verstehen, indem wir transkriptomische Ansätze der nächsten Generation verwendeten, die bakterielle Populationsdynamik während der Infektions- und Biofilmentwicklung aufklärten und den Wert der Prüfung der Wirksamkeit von Behandlungen, einschließlich kleiner Moleküle, demonstrierten. Bisher ist dies das einzige chronische Wundmodell, das nicht ohne Eingriff abheilt.
Methodenartikel
Protokoll zur Schaffung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen - eine Aktualisierung des veröffentlichten Protokolls
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Einleitung
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Protokoll
AKTUALISIERUNGEN:
Dies ist eine Aktualisierung des zuvor vorgestellten Protokolls1
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesvorschriften und den Richtlinien und Verfahren der University of California von der University of California, Riverside IACUC, genehmigt.
1. Tier
Fügen Sie Schritt 1.1 den folgenden Hinweis hinzu:
HINWEIS: Wenn homozygote diabetische Mäuse direkt von Lieferanten gekauft werden, halten Sie die Mäuse in einem herkömmlichen Vivarium, um eine Besiedlung der Haut mit normaler Hautflora zu ermöglichen. Es können sowohl Rüden als auch Hündinnen verwendet werden.
Fügen Sie nach Schritt 1.3 den folgenden Abschnitt hinzu:
1.4.Durchführung der Genotypisierung
HINWEIS: Nach der Zucht des Tieres ist die Genotypisierung wie zuvor beschrieben bis Schritt 1.31 durchzuführen. Das folgende Protokoll wurde gegenüber einer zuvor veröffentlichten Prozedur2 modifiziert. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse können bereits 14-21 Tage nach der Entwöhnung genotypisiert werden.
1.4.1. Extraktion von Roh-DNA
1.4.1.1. Die Ohrstanzbiopsie der Maus wird entnommen und die Gewebeprobe in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
1.4.1.2. 180 μl 50 mM NaOH zugeben, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe untergetaucht ist.
1.4.1.3. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 95 ΰC inkubiert, das Röhrchen wird drucklos gemacht und alle 5 Minuten vortexiert.
1.4.1.4. Die Probe wird mindestens 1 Min. auf Eis abgekühlt.
1.4.1.5. 20 μl 1 M Tris HCl bei einem pH-Wert von 8,0 zugeben und vortexen.
1.4.1.6. Die Proben sind bis zur Verwendung bei -20 °C zu lagern.
1.4.2. Polymerase-Kettenreaktion
1.4.2.1 Die folgende Primermischung wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben (Tabelle der Primer).
HINWEIS: Die Primer amplifizieren die Region um die Punktmutation von LepR.
1.4.2.2. 20 μl Polymerase-Kettenreaktionen in PCR-Röhrchen einrichten. Fügen Sie 10 μl 2x Taq-Polymerase-Mastermix (der Taq-DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl 2 und KCI enthält), 1 μl Primer-Mix (siehe Tabelle der Primer), 4 μl Roh-DNA-Extrakt und 5 μl H2O hinzu.
1.4.2.3. Die Parameter für den Thermozyklus sind wie folgt einzustellen: 94 °C für 2 min; 40 Zyklen von 97 °C für 30 s, 52 °C für 45 s und 72 °C für 45 s; gefolgt von 72 °C für 2 min und 10 °C für unendlichen Halt.
1.4.2.4. Nach Abschluss der PCR werden 4 μl 6x DNA Loading Dye zu den PCR-Produkten gegeben und auf einem 2%igen Agarosegel abgetrennt (Abbildung 1).
HINWEIS: Jede PCR-Reaktion erzeugt 3 PCR-Produkte: 610 bp gemeinsames Produkt, 406 bp mutiertes T-Allelprodukt und 264 bp Wildtyp-G-Allel. Der Wildtyp-Genotyp besteht aus den Produkten 610 bp und 264 bp, der heterozygote Genotyp aus allen drei Produkten und der db/db-Genotyp aus den Produkten 610 bp und 406 bp.
2. Vivarium und Haltung
Ersetzen Sie Schritt 2.1 durch den folgenden Schritt und den Hinweis:
2.1 db/db Mäuse in einem konventionellen Vivarium (keine barriere-/spezifisch erregerfreie Einrichtung) unterbringen, damit sich eine Mikroflora auf der Haut von db/db Mäusen etablieren kann. Um Menschen, die an chronischen Wunden leiden, speziell zu modellieren, treffen Sie keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um die Exposition gegenüber natürlichen Krankheitserregern zu verhindern, die in der Mausumgebung vorkommen, da wesentliche Krankheitserreger der Studie unter strengeren Bedingungen für die Reinigung des Vivariums verloren gehen können.
HINWEIS: Da diese Mäuse sehr groß und diabetisch sind, ist es am besten, bis zu 3 db/db Mäuse pro Käfig zu halten, bevor Sie sie für chronische Wundexperimente verwenden.
3. Voraussetzungen für die Entstehung chronischer Wunden
Fügen Sie nach Schritt 3.2 den folgenden Schritt hinzu
3.3. Halten Sie die Wunde immer mit einem transparenten Filmverband bedeckt, um ein Austrocknen des Wundgewebes zu vermeiden.
5. Reagenzien einrichten
Fügen Sie nach 5.2 den folgenden Hinweis hinzu
HINWEIS: Verwenden Sie nur ATZ von der Firma, die in der Materialtabelle aufgeführt ist. ATZ anderer Unternehmen ist mit diesem Modell nicht kompatibel und wird die Sterblichkeit erhöhen.
6. Chirurgie
6.1. Behandlung und Anästhesie
HINWEIS: Im Folgenden wird ein aktualisiertes Anästhesieregime beschrieben.
6.1.5. In einem offenen System werden 5 % Isofluran, das mit O2 abgegeben wird, bei einer Flussrate (2-3,5 l/min) an die Maus verabreicht, um eine Anästhesie einzuleiten. Überwachen Sie kontinuierlich den Status der Maus.
HINWEIS: Sobald die Maus bewusstlos ist oder sich nicht mehr bewegt, legen Sie sie auf ein weißes OP-Pad und setzen Sie den Kopf mit einem Nasenkonus ein, der am Verdampfer befestigt ist, um eine kontinuierliche Verabreichung von Isofluran während der Operation zu ermöglichen.
6.1.6. In einem offenen System wird während der Operation 1 % Isofluran bei gleicher Flussrate verabreicht und der Isofluranfluss so angepasst, dass die Narkosetiefe erhalten bleibt.
6.3. Verwundung
6.3.5. Die Verabreichung von 1 % Isofluran an die Maus wird am Ende des Verfahrens beendet.
7. Postoperative Behandlung und Genesung
Ersetzen Sie Schritt 7.1 im ursprünglichen Protokoll durch den folgenden Schritt und beachten Sie:
7.1. Nach dem Auftragen des transparenten Filmverbandes unmittelbar nach der Operation mit einer Insulinspritze MSA topisch auf die Oberseite der Wunde auf dem Rücken der Maus aufbringen, indem Sie mit der Nadel in den transparenten Filmverband eindringen. Verwenden Sie 150 mg/kg MSA in steriler PBS-Lösung innerhalb von 10 Minuten nach der Operation. Diese Konzentration wurde nach einer umfangreichen Literaturrecherche bestimmt, wie bereits erläutert 3,4.
HINWEIS: MSA neigt zu Niederschlag, wenn es nicht ständig bewegt wird. Stellen Sie sicher, dass MSA vollständig in der Lösung aufgelöst ist, bevor Sie es auf die Wunde auftragen, um die berechnete Dosis an die Maus abzugeben.
Ersetzen Sie Schritt 7.4 im ursprünglichen Protokoll durch den folgenden Schritt:
7.4. Die zweite Dosis von Buprenex 6 h nach der Operation verabreichen. Dosieren Sie die Mäuse dann in den ersten 48 Stunden regelmäßig gemäß den lokalen IACUC-Regeln.
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, Formulierungen von Analgetika mit verlängerter Freisetzung zu verwenden, die in diesem Mausmodell subkutan verabreicht werden müssen. Das lipidgebundene Buprenorphin kann in dem mittelkettigen Fettsäuretriglyceridöl (MCT) suspendiert sein. Während die Wirkung von MCT-Öl an sehr jungen db/db-Mäusen getestet wurde, wurden die Auswirkungen von MCT auf ältere oder geriatrische adipöse db/db-Mäuse nicht getestet 5,6. Angesichts des Gewichts der Mäuse können große Mengen an Analgetika, die subkutan in die Nähe der Wunde injiziert werden, die zellulären und molekularen Prozesse der Wundheilung und der chronischen Wundinitiierung und -entwicklung signifikant beeinflussen. Außerdem löst sich dieses Schmerzmittel in den hohen Fettwerten dieser Mäuse auf und ist daher möglicherweise nicht wirksam bei der Schmerzlinderung und könnte giftig werden.
8. Datenerfassung, Umgang mit den Mäusen nach der Verwundung, Überlebensstrategien und weitere Tipps
8.1 Datenerhebung
Fügen Sie nach Schritt 8.1.3 die folgenden Schritte hinzu.
8.1.4. Es ist sicherzustellen, dass das für die Analyse entnommene Gewebe sowohl bei Kontrollwunden als auch bei chronischen Wunden nur Gewebe enthält, das 2 mm vom Wundrand entfernt ist. Wunden können bereits 1-2 h nach der Anwendung von MSA durch Exzision entnommen werden.
8.1.5. Überschüssige Flüssigkeit, die sich aus der Wunde oder dem Wundexsudat ansammelt, wird mit einer sterilen Spritze aufgefangen, indem der transparente Filmverband durchstochen wird. Bei -20 °C für bakterielle Studien oder -80 °C für chemische und molekulare Studien lagern.
8.1.6 Um das gesamte Wundgewebe, einschließlich des Biofilms, nach 10 Tagen zu entnehmen, tragen Sie 4 % PFA in PBS 10 Minuten lang topisch auf die Wunde auf, bevor Sie sie mit Pinzette und Schere herausschneiden. Bei der Entnahme des Gewebes fügen Sie einen zusätzlichen Wundrand von 5-10 mm hinzu, damit das Wundgewebe mit zusätzlichem Normalgewebe gestützt wird. Setzen Sie die Fixierung in 4% PFA in PBS und die anschließenden Wäschen und die Vorbereitung zum Einbetten fort.
HINWEIS: Chronische Wunden 10 Tage nach der Operation können zu zerbrechlich werden, um für die Histologie entnommen zu werden.
8.5. Überlebensstrategien
8.5.1. Zusätzliche Unterstützung der Flüssigkeitszufuhr: Prüfen Sie, ob Mäuse lethargisch werden und nicht aktiv essen oder trinken, da die Operation und die Entstehung der Chronizität stressig sind. Verabreichen Sie warme (35-38 °C) Kochsalzlösung subkutan oder intraperitoneal in einem Volumen von 0,25 ml pro 10 g Körpergewicht während der ersten 48-72 Stunden nach der Operation. Eine Flüssigkeitszufuhr kann bis zu 2-3 Mal am Tag erforderlich sein, je nachdem, wie lethargisch die Mäuse sind. Außerdem können Futterpellets und Wassergele für einen einfachen Zugang in die Einstreu gelegt werden, obwohl möglicherweise häufigere Käfigwechsel erforderlich sind.
8.5.2. Zusätzliche Wärmeunterstützung: Die Überlebensrate nach der Operation wird erheblich erhöht, wenn die Mäuse unmittelbar nach der Operation und im Vivarium in Käfigen auf einem Pad auf einem Pad untergebracht werden, das durch zirkulierendes Wasser (93 °C) erwärmt wird. Platzieren Sie den Käfig zu 1/2 auf und 1/2 von der Unterlage, damit sich das Tier von der Hitze entfernen kann, wenn es zu heiß wird, und sich auf die Unterlage bewegen kann, wenn es kalt wird.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Genotypisierung zur Identifizierung von Heterozygoten, um Züchter zu erzeugen. Ein Beispielgel zeigt die Ergebnisse von 8 unbekannten Mausproben. Probe 2 und 5 sind heterozygot, da sie 3 Banden (610 bp, 406 bp und 264 bp) enthalten. Die Samples 1, 3, 4, 6, 7 und 8 sind Wildtypen, da sie nur 2 Banden (610 bp und 264 bp) enthalten.
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Diskussion
Befunde mit diesem Modell chronischer Wunden:
Dieses Modell wurde verwendet, um mehrere Studien durchzuführen, um die zellulären und molekularen Mechanismen der chronischen Wundinitiierung und -progression zu verstehen. Es hat sich gezeigt, dass durch die Hemmung antioxidativer Enzyme chronische Wunden bei den db/db-Mäusen entstehen können. Die Wunden enthielten zunächst eine polymikrobielle Gemeinschaft, die im Laufe der Zeit für be...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mm Ohrlocher | Fisherbrand | 13812201 | 2mm Lochdurchmesser |
| 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% Ethanol | |||
| Acu Punch 7mm Hautbiopsie Stanzen | Acuderm Inc. | P750 | |
| Agarose | |||
| B6. BKS(D)-Leprdb/J | Das Jackson Laboratory | 00697 | Homozygote und Heterozygote verfügbar |
| Buprenex (Buprenorphin HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0,3 mg/ml, Klasse 3 |
| Gel Loading Dye, Lila (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Handschuhe | |||
| Haarentferner-Lotion mit beruhigender Aloe und Lanolin | Nair | ein chemisches Enthaarungsmittel | |
| Wärmetherapie (Wasser) Pumpe HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Heizkissen | Conair | Moist Dry Heizkissen | |
| Schlauchadapter | Adroit MedicalSystems | ||
| Insulinspritzen | BD | 329461 | 0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2") |
| Isofluran | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Isofluran-Verdampfer | JA Baulch & Gesellschafter | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermie-Decke | Cincinnati Sub-Zero | Katze Nr. 247 | 22" x30" Wiederverwendbares HeavyDuty-Pad |
| Mercaptosbernsteinsäure (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Mausnasenkonus | |||
| Sauerstofftank | muss mit dem Verdampfungssystem kompatibel sein | ||
| Phosphatpufferlösung (PBS) | Autoklav sterilisiert | ||
| Scharfe chirurgische | |||
| kleine Kunststoffbehälter | |||
| Natriumhydroxid | |||
| Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparenter Filmverband (6 cm x 7 cm) |
| Dünner Metallspatel | |||
| Tri-HCl | |||
| Schlauchpinzette | |||
| Wahl Haarschneider | Wahl | Lithium Ion Pro |
Referenzen
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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