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Methodenartikel

Eine Multi-Elektroden-Array-Plattform zur Modellierung von Epilepsie unter Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Gehirnassembloiden

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DOI:

10.3791/67396

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27. September 2024

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1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Michigan Medicine, Ann Arbor, 2Michigan Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.

Zusammenfassung

Organoide des menschlichen Gehirns sind dreidimensionale (3D) Strukturen, die von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) abgeleitet sind und Aspekte der Entwicklung des fetalen Gehirns rekapitulieren. Die Fusion von dorsalen mit ventral regional spezifizierten Hirnorganoiden in vitro erzeugt Assembloide, die funktionell integrierte Mikroschaltkreise mit exzitatorischen und inhibitorischen Neuronen aufweisen. Aufgrund ihrer strukturellen Komplexität und der vielfältigen Population von Neuronen sind Assembloide zu einem nützlichen In-vitro-Werkzeug für die Untersuchung aberranter Netzwerkaktivität geworden. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen (MEA) dienen als Methode zur Erfassung von elektrischen Feldpotentialen, Spitzen und longitudinaler Netzwerkdynamik von einer Population von Neuronen, ohne die Integrität der Zellmembran zu beeinträchtigen. Das Aufkleben von Assembloiden auf die Elektroden für Langzeitaufzeichnungen kann jedoch aufgrund ihrer Größe und der begrenzten Kontaktfläche mit den Elektroden eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir eine Methode zur Platte von Assembloiden auf MEA-Platten zur Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität über einen Zeitraum von 2 Monaten. Obwohl das derzeitige Protokoll menschliche kortikale Organoide verwendet, kann es weitgehend an Organoide angepasst werden, die differenziert werden, um andere Gehirnregionen zu modellieren. Dieses Protokoll etabliert einen robusten, longitudinalen, elektrophysiologischen Assay zur Untersuchung der Entwicklung eines neuronalen Netzwerks, und diese Plattform hat das Potenzial, im Wirkstoffscreening für die therapeutische Entwicklung bei Epilepsie eingesetzt zu werden.

Einleitung

Aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnene Hirnorganoide sind räumlich selbstorganisierte 3D-Strukturen, die die Gewebearchitektur und Entwicklungsverläufe in vivo widerspiegeln. Sie setzen sich aus mehreren Zelltypen zusammen, darunter Vorläuferzellen (Neuroepithelzellen, radiale Gliazellen, neuronale Vorläuferzellen, gliale Vorläuferzellen), Neuronen (kortikal-ähnliche exzitatorische Neuronen und inhibitorische Interneuronen) und Gliazellen (Astrozyten und Oligodendrozyten)1,2. Assembloide stellen die nächste Generation von Gehirn-Organoiden dar, die in der Lage sind, mehrere Gehirnregionen und/oder Zelllinien in eine 3D-Kultur zu integrieren. Sie bieten ein nützliches Werkzeug für die Modellierung von Verbindungen zwischen verschiedenen Gehirnregionen, die den In-vivo-Gegenstücken ähneln, für die Erfassung von Interaktionen zwischen Neuronen und Astrozyten, um ausgereifte und komplexe neuronale Netzwerke besser nachzuahmen, und für die Untersuchung des Aufbaus neuronaler Schaltkreise. Daher werden Assembloide zu einem weit verbreiteten Werkzeug zur Rekapitulation von Kennzeichen der Epilepsie-Pathophysiologie, bei der funktionelle Maßnahmen erforderlich sind, um aberrante neuronale Netzwerke zu untersuchen, die der Ursache der Krankheit zugrunde liegen können 3,4,5,6.

Um die Wechselwirkungen zwischen kortikalen glutamatergen Neuronen und GABAergen Interneuronen zu modellieren, entwickelten mehrere Gruppen separate Organoide, die dem dorsalen und ventralen Gehirn ähneln, und verschmolzen sie dann zu einem Multiregionen-Assembloid 7,8,9,10. Hier wurde ein zuvor beschriebenes Assembloid-Kulturprotokoll mit regional spezifischen neuronalen Subtypen angewendet9. Ein wesentliches Hindernis ist jedoch der Mangel an reproduzierbaren funktionellen Assays zur Überwachung der Aktivität neuronaler Netzwerke während der Neuroentwicklung. Viele Funktionstests der Netzwerke in Organoiden liefern Ergebnisse, die eine hohe Variabilität zwischen Chargen von Differenzierungen und Zelllinien aufweisen. Techniken, bei denen Organoide in Scheiben geschnitten oder dissoziiert werden, verändern ihre inhärenten Netzwerke, indem sie die synaptische Konnektivität unterbrechen8.

Multi-Elektroden-Arrays (MEA) bieten einen großräumigen Überblick über die Netzwerkaktivität im Zeitverlauf mit hoher zeitlicher Auflösung, um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Organoiden zu charakterisieren, ohne die Kulturbedingungen oder die Integrität der Zellmembran zu stören11. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Elektrophysiologie ermöglicht MEA eine Hochdurchsatz-Datenerfassung auf der Grundlage großer Populationen von Neuronen anstelle einzelner Zellen. MEA-Plattformen variieren in ihrer Elektrodendichte und decken unterschiedliche Bedürfnisse in der Hirnorganoidforschung ab12. Die weit verbreiteten Systeme, wie in diesem Protokoll gezeigt, zeichnen zwischen 8 und 64 Elektroden pro Vertiefungauf 13,14,15. MEAs mit hoher Dichte und bis zu 26.400 Elektroden pro Vertiefung ermöglichen eine erhöhte räumliche und zeitliche Auflösung, die Quantifizierung der Ausbreitungsgeschwindigkeit des Aktionspotentials und die Kombination mit optogenetischer Stimulation 14,16,17. Daher dient MEA als leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung von Epilepsie in vitro und als translationales Paradigma für das Screening von Medikamenten gegen Krampfanfälle.

Eine große Herausforderung besteht darin, die großformatigen Assembloide auf einer hydrophoben Metalloberfläche für Langzeitaufnahmen zu stabilisieren. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methodik für die Beschichtung intakter Assembloide auf MEA-Platten für die Langzeit-Längsschnittaufzeichnung zusammen mit pharmakologischen Assays. Zu den einzigartigen Vorteilen des Protokolls gehören die stabile Befestigung von Assembloiden an der Elektrodenoberfläche ohne Verlust der elektrischen Aktivität, die Verwendung kommerziell erhältlicher neurophysiologischer Basalmedien zur Beschleunigung der Reifung des funktionellen Netzwerks nach der Beschichtung, die Machbarkeit der Durchführung nachgelagerter funktioneller Assays wie der Arzneimittelbehandlung und die breite Anwendung auf Organoide, die mit anderen regionenspezifischen Protokollen erzeugt wurden.

Ziel ist es, einen funktionellen Assay mit hoher zeitlicher Auflösung zur Verfügung zu stellen, um die Netzwerkaktivität zu untersuchen, krankheitsspezifische Veränderungen zu untersuchen und Medikamente mit therapeutischem Potenzial bei Epilepsie zu testen. Für die anspruchsvollsten Schritte dieses Protokolls werden Videoanweisungen bereitgestellt, die die Techniken zum Plattieren von Assembloiden auf MEA-Platten sowie repräsentative Aufnahmen aus diesen Kulturen zeigen.

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Protokoll

Alle unten gezeigten experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Institutional Review Board der University of Michigan Medical School und des Human Pluripotent Stem Cell Research Oversight Committee durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten iPS-Linien und die repräsentativen Experimente wurden aus menschlichen Vorhautfibroblasten gewonnen, die aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden. Die Details zu den Zelllinien, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ableitung schicksalsspezifischer Hirnorganoide aus iPSCs

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält Informationen zur Vorbereitung von 3 Wells in der Mikrotiterkulturplatte aus 5 konfluenten (~85%) Wells einer 6-Well-Platte. Das iPSC-Wartungsprotokoll variiert je nach Zelllinie.

  1. Bereiten Sie die einzelnen Zellkulturmedien unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Zusammensetzung vor. Lichtgeschützt bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
  2. Spülen Sie alle Wells, die in der Mikrotiterkulturplatte verwendet werden sollen, einmal mit 1 mL DMEM/F-12. Fügen Sie 1 ml/Vertiefung mTeSR plus + 50 μM Y-27632 hinzu und drehen Sie die Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2000 x g , um Luftblasen aus den Mikrovertiefungen zu entfernen. Lagern Sie die Platte in einem 37 °C 5 % CO2 -Inkubator.
  3. Reinigen Sie Regionen von differenzierten iPS-Zellen mit einer sterilen P10-Pipettenspitze unter dem Mikroskop in einer Laminar-Flow-Reinbank. Waschen Sie Zelltrümmer von der Monoschicht mit 1 ml/Well PBS ohne Kalzium oder Magnesium ab.
  4. Dissoziieren Sie die Monoschicht in einzelne Zellen, indem Sie 1 ml/Vertiefung vorgewärmtes Zelldissoziationsreagenz hinzufügen und die Platte für 4-7 min (abhängig von den Eigenschaften und der Konfluenz der Zelllinien) in einen 37 °C 5% CO2 -Inkubator legen, bis die meisten Zellen abheben, wobei alle 2-3 Minuten vorsichtig gerührt wird.
  5. Geben Sie 4 ml DMEM/F-12 in jede Vertiefung, um das Zelldissoziationsreagenz zu verdünnen, und zerreiben Sie es mäßig mit einer serologischen 10-ml-Pipette. Sammeln Sie die Zellsuspension aus allen Vertiefungen derselben Linie in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
  6. Bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur schleudern, den Überstand mit einer serologischen 10-ml-Pipette aspirieren und die Zellen in 2 mL mTeSR plus + 50 μM Y-27632 resuspendieren. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension, 1:1 (v/v) Mischung mit Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
  7. Platte 3 x 106 lebende Zellen pro Well, 3 Wells pro Linie. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliches mTeSR plus + 50 μM Y-27632 hinzu, um das Gesamtvolumen auf 2 mL/Vertiefung zu bringen. Schleudern Sie die Platte bei 100 x g für 3 min bei Raumtemperatur und stellen Sie sie wieder in den Inkubator.
    HINWEIS: Die hier verwendete Mikrotiterplattenplatte enthält 300 Mikrowells pro Well, so dass eine Beschichtung von 3 x 106 Zellen 10.000 Zellen/Mikrotiterling ergibt.
  8. Führen Sie am nächsten Tag einen Medienwechsel mit halbem Volumen durch, indem Sie vorsichtig 1 ml Medium entfernen und langsam 1 mL mTeSR plus Medium (ohne Y-27632) mit einer P1000-Pipettenspitze hinzufügen. Halten Sie die Spitze in der Nähe der Medienoberfläche und saugen Sie so langsam wie möglich ab, um die aggregierenden Zellen am Boden nicht zu stören.
  9. Einen Tag nach dem Medienwechsel unter einem inversen Mikroskop prüfend, ist ein klarer Umriss jedes Aggregats zu sehen. Entfernen Sie das Originalmedium mit P1000 Pipettenspitzen aus jeder Vertiefung.
  10. Sprühen Sie mit sterilen, geschnittenen P1000-Spitzen mäßig 0,5 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) mit Dorsomorphin (DM) und SB-4321542 (SB) in jede Vertiefung. In Medien suspendierte Aggregate sofort vorsichtig pipettieren und in eine sterile 10-cm-Suspensionskulturschale überführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Aggregate übertragen sind. Zerreiben Sie NICHT.
  11. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche NIM + SB/DM hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 ml/Schale zu bringen. Stellen Sie das Gericht auf einen Orbitalschüttler in einem 37 °C 5 % CO2 -Inkubator, um eine spontane Verschmelzung der Zuschlagstoffe zu verhindern. Markieren Sie das Übertragungsdatum als Tag 0 der Organoidkultur.
  12. Befolgen Sie von Tag 1 bis Ende das Medienrezept in Tabelle 1 und die Zeitachse für den Medienwechsel9 in Abbildung 1. Bemerkenswert ist, dass die Organoide an Tag 4 in zwei Suspensionskulturschalen unterteilt werden, die als "dorsal" und "ventral" bezeichnet werden.
    HINWEIS: Einige wichtige Zeitpunkte, die Sie im Auge behalten sollten: Die Organoid-Expansion beginnt an Tag 6, wenn das Medium auf neuronales Differenzierungsmedium (NDM) mit EGF/FGF umgestellt wird. Die neuronale Differenzierung wird ab Tag 25 durch NDM + BDNF/NT3 unterstützt, und Organoide bleiben in NDM ohne Wachstumsfaktoren ab Tag 46 erhalten.

2. Virale Markierung und Erzeugung von Assembloiden

HINWEIS: Die Virusmarkierung 7,9 wird empfohlen, um die Identität jedes regionsspezifischen Organoids in einem Assembloid zu erkennen und die elektrophysiologische Aktivität von spezifischen Elektroden den Assembloidregionen zuzuordnen. Es ist optimal, wenn für jede MEA-Vertiefung nur ein einzelnes Organoid plattiert wird. Dieses Protokoll kann auch für die einzelne Organoid-Platingierung angewendet werden.

  1. Berechnen Sie das Volumen des zu verwendenden Virusmaterials und des zu verwendenden Verdünnungsmediums: Für jedes zu markierende Organoid werden 200 μl Medium mit Virus benötigt. Dorsale Organoide werden mit pAAV1-CAG-tdTomato markiert, typischerweise bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:1000 (v/v) oder etwa 2 x 1010 vg/ml. Für ventrale Organoide wird 1:300 (v/v) oder 2 x 1011 vg/ml pAAV1-mDLX-GFP-Virus verwendet.
    HINWEIS: Die Verdünnungen sollten bis zum gewünschten Effekt titriert werden und werden durch den Virustiter beeinflusst.
  2. Erwärmen Sie die entsprechende Menge des Mediums auf 37 °C. Tauen Sie den Virusbestand auf, der bei -80 °C auf Eis gelagert wird. Beschriften Sie genügend 48-Well-Platten, um alle markierten Organoide aufzunehmen.
  3. Legen Sie einen Becher mit 10 % Bleichmittel in die Haube. Scheiden Sie alle Materialien, die mit Viren in Berührung kommen, in das Becherglas aus. Verdünnen Sie die vollständig aufgetauten Viren in Nährmedien in separaten konischen 15-ml-Röhrchen, die als "dorsal" und "ventral" gekennzeichnet sind.
  4. Verschieben Sie die Organoide an Tag 56 aus Kulturschalen auf 48-Well-Platten. Es wird empfohlen, ein Organoid pro Vertiefung zu verwenden, um eine spontane Fusion in statischer Kultur zu verhindern. Entfernen Sie so viele Reste des Nährmediums wie möglich.
  5. Geben Sie jeweils 200 μl Virus-Medien-Gemisch in jede Vertiefung. Legen Sie die Platten wieder in den 37 °C 5 % CO2 -Inkubator. Kippen Sie die Platten auf eine sterile leere Platte, um die Viruspartikel auf den Boden der Vertiefung zu konzentrieren und die Transduktionseffizienz zu optimieren.
    HINWEIS: Virale Partikel neigen dazu, auf den Boden des konischen 15-ml-Röhrchens zu sinken, daher ist es sehr wichtig, das Röhrchen häufig umzudrehen, um Viren mit Medien zu mischen, bevor sie in jede Vertiefung gegeben werden, um eine gleichmäßige Transduktionseffizienz für alle Organoide zu gewährleisten.
  6. Geben Sie am nächsten Tag (Tag 57) weitere 800 μl Nährmedien in jede Vertiefung, um das Gesamtvolumen auf 1 ml/Vertiefung zu bringen.
  7. Führen Sie drei Tage später (Tag 60) einen vollständigen Medienwechsel an den markierten Organoiden durch. Bleichen Sie alle Materialien, die mit Viruspartikeln in Berührung kommen.
  8. Drei Tage später (Tag 63) überprüfen Sie die Fluoreszenzexpression unter einem inversen Epifluoreszenzmikroskop. Wenn das Signal stark ist, beginnen Sie mit der Generierung von Assembloiden (siehe Schritt 2.9).
  9. Spülen Sie alle markierten Organoide zweimal mit 1 ml/Well PBS, um eine Kreuzkontamination durch verbleibende Viruspartikel während der Organoidfusion zu vermeiden. Verwenden Sie eine geschnittene P1000-Pipettenspitze, um ein ventrales Organoid in jede dorsale Vertiefung (oder umgekehrt) zu übertragen, und beschriften Sie die Assembloidplatte entsprechend neu. Kippen Sie die Platten wie in Schritt 2.5 für eine bessere Verschmelzung.
  10. Führen Sie 3 Tage nach dem Fusionsverfahren (Tag 66) vorsichtig einen Medienwechsel mit halbem Volumen durch, ohne die Assembloide zu unterbrechen. In der Regel dauert es etwa eine Woche, bis sich stabile Assembloide gebildet haben (Tag 70).

3. Platzieren von Assembloiden auf vorbehandelten MEA-Platten

HINWEIS: Es dauert mindestens 4 Tage, bis die Oberflächenvorbereitung von MEA-Platten abgeschlossen ist, bevor Assembloide beschichtet werden. Um Zeit zu sparen, können die Fusion von dorsalen und ventralen Organoiden (d.h. Schritt 2.9) und die MEA-Vorbehandlung parallel durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie Reagenzien für die Oberflächenvorbehandlung und -beschichtung vor.
    1. Zur Herstellung einer 1%igen Waschmittel-/Enzymlösung lösen Sie 0,5 g Enzym-/Waschmittelpulver in 50 ml entionisiertem Wasser auf. Gründlich vortexen, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem sterilen Vakuumfilter in der Biosicherheitswerkbank, bevor Sie sie in die MEA-Vertiefungen geben. Vor jedem Gebrauch frisch machen.
      HINWEIS: Das Reinigungsmittel/Enzym sterilisiert die MEA-Oberfläche, entfernt alle Ölrückstände aus dem MEA-Herstellungsprozess und stellt sicher, dass die Oberfläche hydrophil genug ist, um Wechselwirkungen mit der hydrophilen Verbindung Polyethylenimin (PEI)18 zu fördern.
    2. Um eine 0,07%ige PEI-Lösung19 herzustellen, beginnen Sie mit der Herstellung einer 7%igen PEI-Stammlösung, indem Sie 1 ml 50%ige PEI-Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 6 ml 1x Boratpuffer mischen. 1 ml 7%ige PEI-Lösung in 99 ml 1x Boratpuffer verdünnen, um die endgültige Arbeitskonzentration zu erreichen. Zur Sterilisation vor Gebrauch durch eine 0,22 μm Filtereinheit in der Biosicherheitswerkbank filtrieren.
      HINWEIS: PEI, ein positiv geladenes Polymer, wird im Primärbeschichtungsprozess verwendet, um das Anbringen einer negativ geladenen Sekundärbeschichtung mit der Basalmembranmatrix (BMM) und den Assembloiden20 zu erleichtern. Entnehmen Sie 1 ml 50% PEI, indem Sie es in das konische Röhrchen gießen, anstatt es zu pipettieren, da die Stammlösung sehr viskos ist. Die benötigte Menge kann leichter abgemessen werden, indem sie in ein konisches Röhrchen gewogen wird, und die 50%ige PEI-Lösung hat eine Dichte von 1,08 g/ml. Die 7%ige PEI-Stammlösung kann in 1 mL Aliquots bei -20 °C bis zu einem Monat gelagert werden. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Biosicherheitswerkbank durch.
  2. Unter Berücksichtigung der Größe jedes Assembloids werden 6-Well-MEA-Platten mit 64 Elektroden pro Well verwendet, um ein Assembloid pro Well aufzunehmen. Berechnen Sie die Anzahl der MEA-Platten, die für die Experimente benötigt werden, um sicherzustellen, dass genügend biologische Replikate vorhanden sind.
  3. Geben Sie 1 ml 1%ige Waschmittel-/Enzymlösung in jede Vertiefung einer sterilen MEA-Platte. Achten Sie darauf, die Elektroden mit der Pipettenspitze nicht zu beschädigen. Wenn Sie einen Vakuumsauger zum Waschen verwenden, lassen Sie die Spitze nicht den Elektrodenträger berühren. In einem 37 °C heißen Inkubator für 2 h inkubieren.
  4. Entfernen Sie das Reinigungsmittel/Enzym und waschen Sie jede Vertiefung fünfmal mit 1,5 ml sterilem entionisiertem Wasser. Da Waschmittel/Enzyme nicht biokompatibel sind, ist es wichtig sicherzustellen, dass die restlichen Chemikalien vollständig abgewaschen werden.
  5. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml Nährmedium zur Vorkonditionierung. Stellen Sie die Platten für 2 Tage wieder auf 37 °C 5 % CO2 -Inkubator. Die Exposition der MEA-Oberfläche gegenüber Zellkulturbedingungen fördert die Zelladhäsion.
  6. Entfernen Sie das Nährmedium und bedecken Sie die MEA-Elektroden in jeder Vertiefung mit 50 μl 0,07 % PEI-Lösung für die Primärbeschichtung. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
  7. PEI-Lösung vollständig absaugen. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml sterilem entionisiertem Wasser. Führen Sie insgesamt 3 schnelle Wäschen durch. Trocknen Sie die Platten bei Raumtemperatur 15 Minuten lang in der Biosicherheitswerkbank mit abgenommenem Deckel.
  8. Decken Sie den Elektrodenbereich in jeder Vertiefung mit 50 μl 1:20 (v/v) BMM ab, verdünnt in Nährmedium für die Sekundärbeschichtung. Legen Sie die MEA-Platten über Nacht wieder in den 37 °C heißen Inkubator. Geben Sie steriles Wasser in die Fächer, die die Brunnen umgeben, um während des gesamten Beschichtungsprozesses eine ausreichende Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten.
  9. Am nächsten Tag aspirieren Sie verdünntes BMM mit einem Vakuum und hinterlassen eine dünne Schicht auf der Oberfläche. Wenn sich eine dicke Schicht gebildet hat, besprühen Sie die Kontaktfläche der Elektrode mit einer P1000-Pipettenspitze kräftig mit Nährmedien. Waschen Sie so oft wie nötig, um dicke Stücke zu entfernen.
    HINWEIS: Reste von dickem BMM können den Elektrodenkontakt mit den Zellen beeinträchtigen.
  10. Sammeln Sie ein Assembloid mit einer weit geschnittenen P1000-Spitze und platzieren Sie es auf den Elektroden in einer Vertiefung, während Sie so wenig Medien wie möglich übertragen.
  11. In einer Laminar-Flow-Haube unter einem Präparierskop wird das Assembloid vorsichtig mit einer sterilen Dissektionsnadel oder P20-Spitze an die gewünschte Stelle geschoben, wo sowohl dorsale als auch ventrale Organoide größtenteils mit Elektroden bedeckt werden können. Verwenden Sie eine P20-Spitze, um Flüssigkeit um das Assembloid herum zu entfernen. Wiederholen Sie dies für alle Assembloide oder eine Teilmenge, was innerhalb weniger Minuten erledigt werden kann.
    HINWEIS: Versuchen Sie, die MEA-Oberfläche NICHT mit der Pipettenspitze und/oder der Nadel zu berühren oder zu zerkratzen. Versuchen Sie, das Assembloid NICHT mit Pipettenspitzen zu stechen oder zu zerreißen. Beenden Sie die Beschichtung so schnell wie möglich, um ein vollständiges Austrocknen des Organoids zu vermeiden.
  12. Inkubieren Sie die Assembloide bei 37 °C für 10 min (ohne Medium). Übertragen Sie die Platten aus dem Inkubator in eine Laminar-Flow-Haube und tragen Sie 2-3 kleine Tropfen 1:50 BMM in Nährmedien verdünnt auf die Assembloide unter einem Dissektionsbereich auf. Bei 37 °C weitere 30 min inkubieren.
  13. Geben Sie vorsichtig 3 Tropfen Nährmedium in die Nähe der Assembloide unter einem Präparierzielfernrohr. Dadurch bleiben die Organoide hydratisiert. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
    HINWEIS: Wenn sich das Assembloid in einem der nachfolgenden Schritte bewegt oder schwebt, sollte die Beschichtung ab Schritt 3.11 neu gestartet werden.
  14. Geben Sie stündlich vorsichtig 20-50 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung unter einem Präparierzielfernrohr. Dies kann im Laufe eines Tages erfolgen. Ziel ist es, am Ende des Tages ein Gesamtvolumen von mindestens 250 μl zu erreichen.
  15. Prüfen Sie am nächsten Tag, ob alle Assembloide unter dem Präparierbereich abgesetzt und stabilisiert sind. Fügen Sie weitere 750 μl Nährmedien hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1 ml/Vertiefung zu erreichen. Lassen Sie die Platten mindestens 2 Tage ungestört.
  16. Führen Sie wöchentliche Medienwechsel sorgfältig durch, indem Sie 500 μl Nährmedien herausnehmen und 700 μl neurophysiologische Basalmedien hinzufügen. Das zusätzliche Volumen des hinzugefügten Mediums berücksichtigt die Verdunstung und kann je nach Verdunstung der verwendeten MEA-Platte angepasst werden. Fügen Sie bei Bedarf steriles Wasser um die Vertiefungen hinzu, um die Verdunstung aus den MEA-Vertiefungen zu minimieren.

4. MEA-Aufzeichnung und Datenanalyse

  1. Beginnen Sie mit der MEA-Aufzeichnung etwa eine Woche nach der Umstellung auf neurophysiologische Basalmedien (in der Regel um den 78. Tag).
  2. Warten Sie, bis die Aufnahmekammer die eingestellte Temperatur (in der Regel 37 °C) erreicht hat. Übertragen Sie eine Platte auf das Gerät und lassen Sie sie vor der Aufnahme mindestens 5 Minuten lang äquilibrieren.
  3. Hardware-Live-Einstellungen
    1. Stellen Sie die Abtastfrequenz ein, d. h. die Rate, mit der die Rohspannungsdaten aufgezeichnet werden. Die Standardeinstellung (12,5 kHz) wird empfohlen.
    2. Geben Sie den analogen Modus an (in der Regel Neural Spikes, wie in diesem Fall), um die Hardwarebandbreite und -verstärkung für bestimmte Anwendungen zu konfigurieren. Für die visuelle Überwachung der Aktivität während der Aufzeichnung verwenden Sie die Module Spike Detector und Burst Detector .
      HINWEIS: Die analogen Einstellungen wirken sich darauf aus, wie die Rohspannungsdaten aufgezeichnet werden, und können nach der Datenaufzeichnung nicht mehr geändert werden.
    3. (Fakultativ) Wenden Sie einen digitalen Hardwarefilter auf die Aufnahmedaten an. Zu den Tiefpassfilteroptionen gehört ein 2 kHz oder 3 kHz Kaiser Window. Die Standardeinstellungen können nach Auswahl der analogen Einstellungen geändert werden.
    4. Legen Sie die Standardeinstellung auf Referenzierung nach Median fest, was für die neuronale Aufzeichnung dringend empfohlen wird, wie in diesem Fall. Die Referenzierung verbessert die Qualität von Signalen mit niedriger Amplitude, indem sie die Rauschstörungen reduziert, die bei Gruppen von Kanälen üblich sind.
      HINWEIS: Die oben genannten Parameter können je nach der in den Assembloiden beobachteten Aktivität nach Bedarf angepasst werden, sollten jedoch für alle Aufzeichnungen in einem bestimmten Experiment konsistent bleiben.
  4. Fügen Sie Tafelkarten und Beschreibungen hinzu (falls erforderlich). Importieren Sie die Plattenzuordnung aus der vorherigen Aufzeichnung für dieselbe Platte, um Konsistenz zu gewährleisten und die Verarbeitung von Batch-Daten zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Dateien richtig benannt sind.
  5. Wenn die Signale gut aussehen (minimales Rauschen und Artefakte), zeichnen Sie die Rohdaten auf. In der Regel reichen 2-5 Minuten Aufnahme für eine repräsentative Stichprobe aus.
  6. Erfassen Sie die elektrische Aktivität ein- bis zweimal pro Woche über einen Zeitraum von 5-15 Minuten, je nach Versuchsdesign, in Längsrichtung. Warten Sie nach jedem Medienwechsel mindestens 24 Stunden, bevor Sie die nächste Aufnahmerunde starten, da die elektrische Aktivität sofort nach jedem Medienwechsel abnimmt.
  7. (Fakultativ) Wenn die elektrische Aktivität lokalisiert und zwischen dorsalen und ventralen Organoiden unterschieden werden muss oder wenn die Aktivität jeder Elektrode separat analysiert werden muss, erhalten Sie nach jeder Aufzeichnung ein Bild jedes Assembloids unter Hellfeld und Epifluoreszenz (Abbildung 2B).
  8. Wenden Sie bei der Analyse der Daten eine Analysekonfiguration an, einschließlich eines Spike-/Burst-Detektors und eines Statistik-Compilers. Verwenden Sie für die Spike-Erkennung einen adaptiven Schwellenwert von 5,5 bis 6 Standardabweichungen vom Ausgangswert. Identifizieren Sie Bursts als Aktivität mit ≥5 Spitzen in 100 ms13. Definieren Sie die Netzwerkaktivität, wenn mehr als 25 % der gesamten aktiven Elektroden innerhalb von 100 ms mit mindestens 50 Spitzen pro Netzwerk-Burstausgelöst werden 13,14.
    HINWEIS: Diese Parameter werden in Abhängigkeit von den Brenneigenschaften eines bestimmten Experiments moduliert. Um die Empfindlichkeit für Spikes mit niedriger Amplitude zu erhöhen, kann der adaptive Schwellenwert für die Spike-Erkennung gesenkt werden. Für die Burst-Erkennung können verschiedene Methoden verwendet werden, und die Parameter können angepasst werden, um Ausbrüche von Spikes zu erkennen, die sich deutlich von der Hintergrundaktivität unterscheiden. Die Parameter der Netzwerkaktivität können auf einen geringeren Prozentsatz der Elektroden moduliert werden, insbesondere wenn die Assembloide nicht das gesamte Feld der Elektroden abdecken. Alle Parameter sollten für die Dauer eines Experiments konsistent bleiben, um Längsschnittvergleiche zu ermöglichen.
  9. Führen Sie das Statistics Compiler-Modul für die Batchverarbeitung aus, während Sie die aufgezeichneten Daten wiedergeben. Exportieren Sie erweiterte Metriken und/oder Spike-Ausgabedateien für erweiterte Analysen.
    HINWEIS: Die Ausgabe erweiterter Metriken enthält .csv Datei mit Elektroden-, Well- und Gruppendurchschnitten für Mean Fireing, Bursting und Synchrony. Die Spike-Ausgabe (.spk-Datei) enthält Wellenform-Traces für alle Spikes, die für erweiterte Analysen, z. B. Spike-Sortierung, auf andere Plattformen importiert werden können.

5. Pharmakologischer Endpunkt-Assay und Plattenrecycling

HINWEIS: Assays zur medikamentösen Behandlung können durchgeführt werden, nachdem die Assembloide reif genug sind und die elektrische Aktivität ihren Höhepunkt erreicht hat. Die Aufzeichnung der Aktivität zu Studienbeginn/vor der Behandlung und der Aktivität nach der Behandlung muss am selben Tag durchgeführt werden.

  1. Geben Sie 1-10 μl Wirkstofflösung direkt auf das Assembloid und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. In einigen Fällen wird eine längere Inkubationszeit in arzneimittelhaltigen Medien empfohlen, z. B. bei synapsenbezogenen Arzneimittelbehandlungsassays mit Glutamat/GABA-Rezeptor-Agonisten/Antagonisten (Abbildung 2E) (siehe Abschnitt "Ergebnisse" für Details).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine kleine Menge Arzneimittellösung in jede Vertiefung zu geben, um eine endgültige Arbeitskonzentration zu erreichen, da eine große Volumenänderung die elektrische Aktivität im Allgemeinen vorübergehend verringert. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zugabe eines Vehikels, in dem die interessierenden Arzneimittel gelöst sind, keine signifikanten Veränderungen der elektrophysiologischen Parameter hervorruft.
  2. Führen Sie genügend PBS-Waschungen (in der Regel 3) durch und waschen Sie die Medikamente nach der Nachbehandlungsaufnahme aus. Führen Sie am nächsten Tag nach der Auswaschung des Medikaments eine zusätzliche Aufzeichnung durch, um zu sehen, ob die elektrische Aktivität auf das Ausgangsniveau zurückkehrt.
  3. Optional können Sie Medien gewaltsam pipettieren, um die Assembloide am Ende der Aufzeichnungen von der MEA-Platte zu trennen, um weitere Experimente durchzuführen, z. B. Live-Bildgebung, Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd für die Immunfärbung in der gesamten Montierung oder Lyse für die RNA- oder Proteinextraktion.
  4. Verwenden Sie zu Analysezwecken mindestens drei technische und biologische Replikate für jede Erkrankung. Geben Sie elektrophysiologische Daten als Mittelwert von n ≥ 3 Replikationen an.
  5. Um die Platte am Ende der Experimente zu recyceln, aspirieren Sie das restliche Medium, nachdem Sie die beigefügten Assembloide entfernt haben. Einmal mit sterilem PBS waschen. Decken Sie den Metallbereich vollständig mit 200 μl/Vertiefung 0,25 % Trypsin-EDTA ab und stellen Sie die Platte über Nacht wieder in einen 37 °C-Inkubator.
  6. Am nächsten Tag Trypsin aspirieren, zweimal mit 70% sterilem Ethanol und dreimal mit sterilem entionisiertem Wasser waschen.
  7. Trocknen Sie die Platte in der Biosicherheitswerkbank 15 Minuten lang an der Luft mit abgenommenem Deckel oder bis sie vollständig trocken ist. Verschließen Sie die gereinigte Platte in einer Plastiktüte und lagern Sie sie bis zur zukünftigen Verwendung bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Eine gut gereinigte MEA-Platte kann dreimal wiederverwendet werden, ohne dass die Aufnahmequalität wesentlich beeinträchtigt wird.

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Ergebnisse

Humane dorsal-ventrale Assembloide wurden auf einer 6-Well-MEA-Platte (n = 6 pro Differenzierung, 3 Differenzierungen) plattiert, wobei jede Vertiefung 64 Elektroden enthielt (Abbildung 2A). Neun von zehn Assembloiden, die für die Längsschnittaufzeichnung vorgesehen waren, waren über 50 Tage in vitro fest mit den Elektroden verbunden (Abbildung 2D). 6 von 8 Assembloiden, die für pharmakologische Assays bestimmt waren, wu...

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Diskussion

MEA-basierte Methoden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in iPSC-abgeleiteten Assembloiden wurden für die in vitro Modellierung von Epilepsie verwendet22,23. Diese vorgeschlagene Plattform, die exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen integriert, hat das Potenzial, Mechanismen der neuronalen Übererregbarkeit und die Rolle kortikaler Interneurone im Prozess der Epileptogenese z...

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Offenlegungen

Den Autoren liegen keine relevanten Angaben vor.

Danksagungen

Dieses Manuskript wurde unterstützt von R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). Abbildung 1 wurde mit biorender.com generiert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm Corning Nicht TC-behandelte KulturschalenCorning08-772-32Für Suspensionskulturen auf dem Shaker
100 mL Becherglas Fisher ScientificFB100100
100% EthanolFisher ScientificBP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)Thermo Fisher 21985023Arbeitskonzentration 100 μ M
48-Well-ZellkulturplatteFisher Scientific50-202-140
6-Well-ZellkulturplatteFisher Scientific07-200-83
Aggrewell 800Fisher Scientific501974754
Allegra X-14R KühlzentrifugeBeckman Coulter BE-AX14R
AllopregnanolonCayman169305 mg in DMSO suspendiert, um 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren und einfrieren bei − 80 °C. Zur Verwendung bei 1:10.000 verdünnen. Arbeitskonzentration 100 nM.
Automatisierter ZellzählerThermo FisherAMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-Well-Platten Axion BiosystemsM384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA-PlattformAxion BiosystemsMaestroMit B-27-Ergänzung zur Temperaturkontrolle
(normal, mit Vitamin A)Thermo Fisher21985023
B-27-Ergänzung (ohne Vitamin A)Thermo Fisher12587010
Basalmembran-Matrix - GeltrexThermo FisherA1569601
Bead bathFisher Scientific10-876-001Isotemp
Inverses TischmikroskopOlympusCKX53In laminarer Strömung gehalten Reinbank
BicucullineSigma-Aldrich14340Arbeitskonzentration 10 μ M
BleachCLOROX67619-26
Boratpuffer 20xThermo Fisher28341Arbeitskonzentration bei 1x
BrainPhys MedienStemCell Technologies5790
Zelldissoziationsreagenz (StemPro Accutase)Thermo FisherA1110501
Celltron OrbitalschüttlerHT-Infors  I69222 
Detergens/Enzym (Terg-A-Zyme)Sigma-AldrichZ273287Arbeitskonzentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-GlutaminThermo Fisher113300
DMSOSigma-Aldrich67685
DorsomorphinSigma-AldrichP5499Lösen Sie 5 mg in DMSO auf, um 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren und einfrieren bei − 20 & °C. Zur Verwendung auf 1:2000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 5 μ M)
D-PBS ohne Calcium oder MagnesiumThermo Fisher14190144
Neurotroph aus Gliazelllinien (GDNF)Peprotech450-10Auflösen 100 μm; g in 1 ml PBS bis 100 μm; g/ml. Aliquotieren und einfrieren bei − 20 & Grad. Zur Verwendung auf 1:5000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 ng/ml).
GlutaMAX ErgänzungThermo Fisher35050061
HämazytometerWahlmikroskopie Sciences63510-20
HEPESThermo Fisher15630080
Heraguard ECO Clean BenchThermo Fisher51029692
Feuchtigkeitskontrollierter Zellkultur-InkubatorThermo Fisher370eingestellt auf 37 ° C, 5% CO2
IWP-2SelleckchemS7085Aliquot und gefrieren bei − 80 °C. Es fällt aus, wenn es bei Raumtemperatur aufgetaut wird. Gefrorene Aliquots sollten direkt in 37 μg eingelegt werden; C vor Gebrauch.
Knockout-Serumersatz (KOSR)Thermo Fisher10828010
mTeSRplus (Medium + Nahrungsergänzungsmittel)StemCell Technologies100-0276cGMP, stabilisiertes Feeder-freies Medium für humane iPSC-Zellen
N2-ErgänzungsmittelThermo Fisher17502048
Neurobasal AThermo Fisher21103049
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)Thermo Fisher11140050
NT3Peprotech450-03Auflösen 100 μ g in 1 ml PBS bis 100 μm; g/ml. Aliquotieren und einfrieren bei − 20 & Grad. Zur Verwendung auf 1:5000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 ng/ml).
NuFF Humane neonatale VorhautfibroblastenMTI-GlobalStemGSC-3002
ParafilmPARAFILM P7793
Penicilin/StreptomycinThermo Fisher15140122
Pipette (P10, P200, P1000)EppendorfEP4926000034Autoklaviergeschnittene P1000-Spitzen für die Organoidensammlung
Poly (Ethylenimin) (PEI)Sigma-AldrichP3143Material in sterilem Boratpuffer verdünnen. Arbeitskonzentration 0,07 %. Siehe Details im Manuskript.
Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)R& D Systems236-EG-200in PBS hängend. Aliquotieren und bei -20 °C einfrieren.
Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-basischPeprotech100-18Bin PBS gefedert. Aliquotieren und bei -20 °C einfrieren.
Rekombinanter human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02Zentrifuge kurz vor der Rekonstitution. Auflösen 100 μ g in 1 mL PBS bis 100 μm; g/ml. Aliquotieren und einfrieren bei − 20 & Grad. Zur Verwendung auf 1:5000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 ng/ml).
Retinsäure (RA)Sigma-AldrichR2625100 mg in 3,3 ml DMSO auflösen, um 100 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Bestand 100 μ L/Tube und frieren bei − 80 °C. Nehmen Sie 200 μ L 100 mM Material und 10x verdünnen (1,8 mL DMSO hinzufügen), um 10 mM Material zu erhalten. Aliquot 50 μ L/Tube und bei &minus lagern; 80 °C. Zur Verwendung bei 1:100.000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 100 nM).
ROCK-Inhibitor Y-27632Tocris12541:200 aus 10 mM Stamm
SAG (geglätteter Agonist)SelleckchemS7779Aliquot und Gefrieren bei − 80 °C. Lagerkonzentration 1 mM. Bei einer Verdünnung von 1:10.000 (Arbeitskonzentration 100 nM) verwenden.
SB-431542Tocris16145 mg in 1,3 mL DMSO auflösen, um 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren und einfrieren bei − 80 °C. Zur Verwendung auf 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 μ M)
Serologischer PipettenfüllerFisher Scientific14-387-166
Steriflip Vakuumröhren-OberfilterSigma-AldrichSE1M179M6
Sterile ZellkulturhaubenBaker CompanySG-600
Trypanblaue Lösung (0,4 %)Thermo Fisher15250061
Trypsin-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher25200056
Zoom StereomikroskopOlympusSZ61/SZ51Gehalten in laminarer Strömung Reinbank

Referenzen

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