Methodenartikel

Lebend-/Totfärbung zur Quantifizierung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen in mit Manuka-Honig behandelten wundverursachenden Bakterien

DOI:

10.3791/67398

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25. April 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen (VBNC) in mit Manuka-Honig behandelten Bakterienkulturen.

Zusammenfassung

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Antibiotikaresistenz und -toleranz bei Bakterien stellen eine erhebliche Bedrohung für die globale Gesundheit dar. Zu den Mechanismen, die zur Antibiotikaresistenz und -toleranz beitragen, gehören genetische Mutationen und, der Erwerb von Resistenzgenen sowie der Übergang zu lebensfähig, aber nicht kultivierbar (VBNC) bzw. anderen Ruhezuständen. Obwohl sie genetisch identisch mit ihren nicht-antibiotikatoleranten Gegenstücken sind, entziehen sich VBNC-Zellen der antibiotischen Wirkung, indem sie metabolisch inaktiv bleiben. Antibiotika sind nur dann wirksam, wenn ihre Zielprozesse wie DNA-Replikation oder Transkription aktiv sind. Da Umweltstressoren, insbesondere Antibiotika, Bakterien in die Ruhephase treiben können, werden alternative antimikrobielle Mittel benötigt, um diese Reaktion zu minimieren oder zu verhindern. Das antimikrobielle Manuka-Honig (MH) ist gegen viele Bakterien wirksam, wobei sich selten Resistenzen entwickeln. Seine vielseitigen antimikrobiellen Mechanismen machen es zu einem wertvollen Mittel zur Behandlung von bakteriellen Infektionen. Diese Studie untersuchte die Widerspenstigkeit von MH gegenüber der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen, indem sie die Hypothese testete, dass MH weniger VBNC-Zellen induziert als herkömmliche Antibiotika. Um dies zu untersuchen, wurde ein Protokoll entwickelt, um die wundverursachenden Bakterien Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa mit minimalen Hemmkonzentrationen von MH oder den konventionellen Antibiotika Tobramycin oder Meropenem zu behandeln, das dann die Anzahl der lebensfähigen Platten zur Identifizierung metabolisch aktiver kultivierbarer Zellen und die Lebend-/Totfärbung zur Identifizierung aller lebensfähigen Zellen verwendete. Die Anzahl der VBNC-Zellen entsprach der Anzahl lebensfähiger Zellen abzüglich der Anzahl der kultivierbaren Zellen. In einigen Experimenten war die Anzahl der kultivierbaren Zellen höher als die Anzahl der lebensfähigen Zellen, was zu einer negativen Anzahl von VBNC-Zellen führte. daher wurden die VBNC-Zellnummern nicht direkt verglichen. Stattdessen wurden für jede Behandlung die Anzahl der kultivierbaren und lebensfähigen Zellen verglichen. Nur P. aeruginosa , das mit Tobramycin behandelt wurde, wies signifikant weniger kultivierbare Zellen als lebensfähige Zellen auf, was auf eine höhere Anzahl von VBNC-Zellen hinweist. Dieses Protokoll ist schnell und einfach und kann verwendet werden, um die MH-Induktion von VBNC-Zellen in anderen pathogenen Bakterien zu bewerten.

Einleitung

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Bakterien im Zustand der lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Ruhephase überleben die Antibiotikabehandlung und verursachen wiederkehrende und manchmal tödliche Infektionskrankheiten 1,2,3. Bekannter ist uns die Antibiotikaresistenz, die über eine vererbbare genetische Veränderung auftritt4. Die genetische Veränderung sorgt durch mehrere Mechanismen für Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum, darunter die Begrenzung der Aufnahme eines Antibiotikums, die Erhöhung des Ausflusses des Antibiotikums, die Modifikation des Antibiotikaziels oder die Inaktivierung des Antibiotikums4. Im Gegensatz dazu weisen Bakterien im Ruhezustand eine breitere und nicht vererbbare Antibiotikatoleranz auf, indem sie ihren Stoffwechsel reduzieren 2,3. Antibiotika zielen auf spezifische Stoffwechselprozesse ab, einschließlich DNA-Replikation und Zellwandsynthese, und sind gegen metabolisch inaktive VBNC-Zellen unwirksam4. VBNC-Zellen existieren stochastisch in geringer Zahl neben ihren genetisch identischen Antibiotika-anfälligen Geschwistern in den meisten Bakterienpopulationen5. Umweltstressoren, einschließlich der Exposition gegenüber Antibiotika, veranlassen jedoch anfällige Bakterienzellen, in den antibiotikatoleranten VBNC-Zustand überzugehen 3,6. Eine Antibiotikabehandlung tötet antibiotikaanfällige Zellen in der Population ab, während ruhende VBNC-Zellen verbleiben. Wie der Name schon sagt, können VBNC-Zellen nicht auf Medien kultiviert werden, die für das Wachstum ihrer stoffwechselaktiven Geschwister geeignet sind. Ihre Membranen und ihr genetisches Material sind jedoch unbeschädigt und sie können sich vermehren 7,8. Wenn Antibiotika entfernt werden, sind spezifische Reize wie Nährstoffe, Temperatur oder Wirtsfaktoren erforderlich, um VBNC-Zellen aus ihrem Ruhezustand zu wecken und das Wachstum wiederherzustellen 3,9. VBNC-Zellen wurden in vielen pathogenen Bakterienarten dokumentiert, darunter P. aeruginosa und S. aureus, die wichtigsten ätiologischen Erreger von Wundinfektionen10,11.

Honig wird aufgrund seiner antibakteriellen Eigenschaften seit langem in medizinischen Anwendungen, einschließlich der Wundbehandlung, verwendet12. Manuka-Honig (MH), der aus den Blüten des Manuka-Busches (Leptospermum scoparium) gewonnen wird, ist für seine bakterizide Wirkung mit breitem Spektrum bekannt (überprüft in 13,14,15). Es tötet erfolgreich die Mehrheit der getesteten infektionsverursachenden Bakterien beim Menschen ab, einschließlich Bakterienstämme wie Methicillin-resistente Staphylococcus aureus und Vancomycin-resistente Enterokokken, die eine vererbbare Resistenz gegen herkömmliche Antibiotika aufweisen16,17. Darüber hinaus ist eine induzierte bakterielle Resistenz gegen MH selten und wird nur in honigexponierten P. aeruginosa-Biofilmen und Escherichia coli nachgewiesen, die in steigenden Konzentrationen einer Untergruppe des getesteten Honigs kultiviert wurden 18,19,20,21. Dies deutet darauf hin, dass sich die antimikrobiellen Mechanismen von MH von herkömmlichen Antibiotika unterscheiden und möglicherweise weniger oder keine VBNC-Zellen induzieren. Diese Hypothese wurde getestet, indem festgestellt wurde, wie sich MH im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika auf VBNC-Populationen auswirkt.

VBNC-Zellen müssen von ihren stoffwechselaktiven kultivierbaren Geschwistern und toten Zellen unterschieden werden. Kultivierbare Zellen werden mit der lebensfähigen Plattenzähltechnik gezählt, bei der die Zellen auf routinemäßige Kulturmedien übertragen und für einen Zeitraum inkubiert werden, der ausreicht, damit genügend Zellteilungen entstehen, um beobachtbare Kolonien zu bilden. Es wurden mehrere Methoden zur Unterscheidung von VBNC-Zellen von toten Zellen entwickelt, die auf ihren intakten Membranen und ihrer Low-Level-Transkription basieren. Die Aufnahme von Substrat und Fluoreszenzfarbstoffen in Kombination mit Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglicht eine direkte Zählung von Zellen durch Mikroskopie oder Durchflusszytometrie mit einer Farbe, die intakte Membranen anzeigt22,23. Atmungsassays, bei denen die Elektronentransportkette in einer intakten Zellmembran vorhanden sein muss, wurden auch zur Unterscheidung zwischen lebensfähigen und toten Zellen verwendet24. Quantitative PCR-Methoden (qPCR) in Kombination mit DNA-modifizierenden Farbstoffen, die eine Amplifikation verhindern, wurden ebenfalls entwickelt. Es wird nur DNA aus lebensfähigen Zellen amplifiziert, da die intakten Membranen den Farbstoff25 ausschließen. Obwohl VBNC-Zellen inaktiv sind, transkribieren sie Gene immer noch auf einem niedrigen Niveau, was auch zur Unterscheidung von toten Zellen mit Hilfe der reversen Transkriptions-PCR26 verwendet werden kann.

In dieser Arbeit wurde ein Assay zur Quantifizierung von VBNC-Zellen in zwei wundverursachenden pathogenen Bakterien, S. aureus und P. aeruginosa, entwickelt, die mit MH behandelt wurden. Sie beschreibt die Behandlung der Bakterien mit MH und herkömmlichen Antibiotika und die Verwendung der lebensfähigen Keimzelle und der Lebend-/Totfärbung zum Nachweis kultivierbarer und lebensfähiger Zellen. Dieses einfache und kostengünstige Protokoll ermöglicht die Analyse der Fähigkeit von MH, antibiotikaresistente VBNC-Zellen in vielen bakteriellen Krankheitserregern zu induzieren.

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Protokoll

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Da P. aeruginosa (ATCC9721) und S. aureus (ATCC29213) als Wirkstoffe der Biosicherheitsstufe 2 eingestuft sind, müssen die Räume, in denen die Arbeiten durchgeführt werden, nur eingeschränkt zugänglich sein und mit einer Biosicherheitswerkbank für Manipulationen ausgestattet sein, die Spritzer oder Aerosole erzeugen können, wie z. B. Rühren und Zentrifugen von Kulturen. Tragen Sie in allen Schritten dieses Protokolls persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich eines Laborkittels, einer Schutzbrille und Handschuhen. Alle Reagenzien und Geräte, die bei den Versuchen verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von steriler Bouillon und Agar-Nährmedien

  1. Bereiten Sie Luria Bertani und Mueller Hinton, NaCl (0,85 %), Antibiotika und Glaswaren vor.
    1. Bereiten Sie das Brühemedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und fügen Sie Agarpulver zu 1,5 % für das Agarmedium hinzu. Fügen Sie 0,85 g NaCl zu 100 mL dH20 hinzu, um 0,85 % NaCl herzustellen. Bringen Sie Autoklavenband auf den Gefäßen an, legen Sie sie in einen autoklavensicheren Behälter und autoklavieren Sie sie in einem Flüssigkeitskreislauf, der für die verwendeten Volumina geeignet ist.
    2. Wenn der Autoklavenzyklus abgeschlossen ist, kühlen Sie den Agar auf ca. 60 °C ab, bevor Sie ihn in sterile Petrischalen gießen.
  2. 100 μg/ml Stammlösungen der Antibiotika Tobramycin und Meropenem in dH2O zur Verdünnung und Behandlung von Bakterien herstellen. Sterilisieren Sie die Antibiotika-Brühen mit einer sterilen 5-ml-Spritze, die mit einem 0,2-μm-Sterilfilter verbunden ist.
    1. Lagern Sie die sterilisierten Antibiotika-Brühen bei -20 °C in mehreren kleinen Aliquoten, um einen Aktivitätsverlust durch mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.

2. Abrufen der archivierten Staphylococcus aureus - und Pseudomonas aeruginosa-Stämme von -80 °C (Tag 1)

  1. Sammeln Sie die Materialien für das Streifen eines kleinen Aliquots der gefrorenen Bakterienstämme aus ihren 80 °C Gefrierfläschchen auf Luria Bertani (LB)-Agar. Dazu gehören mehrere sterile Holzstäbchen und eine LB-Agarplatte, die mit dem Organismus und dem Datum beschriftet ist.
  2. Öffnen Sie den Gefrierschrank bei -80 °C, entfernen Sie schnell die gewünschten Fläschchen und schließen Sie die Gefrierschranktür. Öffnen Sie jedes Fläschchen nacheinander und kratzen Sie mit einem sterilen Stäbchen eine kleine Menge gefrorener Bakterien auf die entsprechend beschriftete LB-Agarplatte. Setzen Sie die Kappe des Fläschchens wieder auf und stellen Sie es schnell wieder in den -80 °C-Gefrierschrank.
  3. Die beimpften LB-Agarplatten werden mit der Agarseite nach oben bei 37 °C unter aeroben (atmosphärischen) Bedingungen für 18-24 h inkubiert. Nach der Inkubationszeit verschließen Sie die inokulierten LB-Agarplatten mit Veredelungsband und lagern Sie sie nicht länger als eine Woche bei 4 °C. Beimpfen Sie bei Bedarf wöchentlich frische Bakterienkulturen aus der -80 °C tiefgekühlten Brühe.

3. Vorbereitung von S. aureus und P. aeruginosa für die Behandlung mit Manuka-Honig (MH) und dem Antibiotikum (Tag 2)

  1. Sammeln Sie die Materialien, die für den Start einer LB-Bouillon-Kultur jedes Stammes erforderlich sind, einschließlich kleiner steriler Reagenzgläser, serologischer 5-ml-Pipetten, steriler LB-Brühe und einer Impfschlaufe. Besorgen Sie sich außerdem eine manuelle oder elektrische Pipette für serologische Pipetten, einen Bunsenbrenner und einen Schüttelinkubator.
  2. Arbeiten Sie neben der Bunsenbrennerflamme und geben Sie mit einer serologischen Pipette 2 mL LB-Bouillon in zwei sterile Reagenzgläser. Sterilisieren Sie die Impfschlaufe in der Bunsenbrennerflamme und übertragen Sie dann eine Viertelschlaufe voller Bakterien von den LB-Agarplatten in das entsprechend beschriftete Reagenzglas mit LB-Brühe.
    1. Inkubieren Sie das Reagenzglas unter aeroben Bedingungen in einem Schüttel-Inkubator (~250 U/min) bei 37 °C für 18-24 h.

4. Vorbereitung der MH und Vorbereitung der MH und Antibiotikabehandlungen von S. aureus und P. aeruginosa (T = 0) (Tag 3)

  1. Sammeln Sie die für das Experiment benötigten Materialien, einschließlich Mueller-Hinton-Bouillon und Agarplatten, die LB-Bouillon-Bakterienkulturen von Tag 2, sterile Reagenzgläser, die Antibiotika-Vorräte auf Eis, Pipetten (P20, P200 und P1000) und Spitzen, 15-ml-Röhrchen, serologische Pipetten und eine Pipette sowie Mikrofuge-Röhrchen.
    1. Die 25%igen und 50%igen MH-Stammlösungen werden am Tag des Versuchsaufbaus frisch zubereitet. Basierend auf der MH-Dichte (1,47 g/ml) wiegen Sie die entsprechende Menge MH in einem sterilen 15-ml-Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Menge steriler Mueller-Hinton-Brühe hinzu. Suspendieren Sie das MH, indem Sie die Schläuche in warmes Wasser legen und bei Bedarf umdrehen.
  2. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:1000 (ca. 106 KBE/ml) der Bakterienkulturen über Nacht in sterilen 15-ml-Röhrchen vor, indem Sie 10 μl der Bakterienkultur zu 10 ml Müller-Hinton-Brühe hinzufügen.
    1. Verwenden Sie die verdünnten Kulturen, um drei Proben für jede Bakterienart vorzubereiten: eine unbehandelte Kontrolle, eine MH-behandelte Probe (in der minimalen Hemmkonzentration, MIC) und eine mit Antibiotika behandelte Probe (Tobramycin für S. aureus oder Meropenem für P. aeruginosa, bei der MHK).
    2. Die verdünnte Bakterienkultur, MH und das geeignete Antibiotikum werden den Proben in den in Tabelle 1 und Tabelle 2 angegebenen Volumina zugesetzt.
  3. 0,1 ml und 0,5 ml der unbehandelten Probe werden in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt, um die lebensfähige Keimzelle (Schritt 5) bzw. die Lebend-/Totfärbung (Schritt 6) für die T = 0-Proben durchzuführen.
    1. Die unbehandelten, MH-behandelten und mit Antibiotika behandelten Proben (Tobramycin oder Meropenem) werden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (250 U/min) für 24 Stunden inkubiert. Führen Sie die Techniken der Zählung lebensfähiger Keimzellen (Schritt 5) und der Lebend-/Totfärbung (Schritt 6) an den unbehandelten Proben T= 0 durch.

5. Bestimmung der kultivierbaren Zellen in Proben mit der Methode der lebensfähigen Keimzelle (Tag 3 - 5)

  1. Sammeln Sie an Tag 4 nach der 24-stündigen Probeninkubation 0,1 ml bzw. 0,5 ml jeder Probe in Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung der lebensfähigen Platten bzw. die Lebend-/Totfärbung (Schritt 6). Dies sind die T = 24 h Samples.
  2. Führen Sie die Zählung lebensfähiger Platten bei T = 0 und T = 24 h Proben am Tag ihrer Entnahme durch, indem Sie 10-fache Verdünnungen der lebensfähigen Plattenzählproben in LB-Bouillon vorbereiten, um eine zählbare Anzahl von Zellen (~25-150) zu erhalten.
    1. Verteilen Sie 50 μl jeder verdünnten Probe auf 1/2 einer LB-Agarplatte. Die LB-Agarplatten werden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C für 24 h inkubiert.
  3. Nehmen Sie am nächsten Tag die LB-Agarplatten aus dem Inkubator und identifizieren Sie die Verdünnungsplatte mit ~25-150 Kolonien. Zählen Sie die genaue Anzahl der Kolonien auf der Platte und verwenden Sie die Formel für koloniebildende Einheiten (KBE/ml= # gezählte Kolonien/ (volumenplattiert, ml) (verwendete Verdünnung)), um die Anzahl der kultivierbaren Zellen pro ml zu bestimmen.
    HINWEIS: Die Probe mit T = 0 wird an Tag 3 plattiert und an Tag 4 analysiert. Die Proben von T = 24 h werden an Tag 4 plattiert und an Tag 5 analysiert.

6. Bestimmung der lebensfähigen Zellen in den Proben mittels Lebend-/Totfärbung und Fluoreszenzmikroskopie (Tag 3 oder 4)

  1. Sammeln Sie die Materialien, die für die Lebend-/Totfärbung erforderlich sind, einschließlich 0,85 % sterilem NaCl zur Aufrechterhaltung einer günstigen osmotischen Umgebung für Zellen, Pipetten (P20, P200 und P1000) und sterilen Pipettenspitzen, einem Lebend-/Totfärbekit für Bakterien und einem Einweg-Hämozytometer. Erhalten Sie Zugang zu einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Fluorescein-Isothiocyanat-Filterset (FITC) zum Nachweis des Farbstoffs SYTO 9, der lebende Zellen färbt.
  2. Fügen Sie 0,5 ml 0,85 % NaCl zu 0,5 ml jeder der folgenden lebenden/toten Proben hinzu: alle unverdünnten T = 0 Proben, unverdünnte T = 24 h MH und mit Antibiotika behandelte Proben sowie eine Verdünnung von 1:1000 der unbehandelten T = 24 h Kontrollprobe.
    1. Es ist sicherzustellen, dass die endgültige Anzahl der lebenden Zellen aller Proben mit zwei multipliziert wird und die verdünnte Kontrolle T = 24 h unbehandelt mit 1000 multipliziert wird. Kombinieren Sie 1,5 μl SYTO 9 und 1,5 μl Propidiumiodid pro Probe und fügen Sie dann jeder Probe 3 μl der Mischung hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei 21 °C im Dunkeln für 15 min.
  3. Übertragen Sie 6 μl jeder gefärbten, schonend gemischten Probe in ein Einweg-Hämozytometer und betrachten Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit dem FITC-Filter und der 40-fach-Objektivlinse. Machen Sie ein Foto, das sowohl die Gitterlinien des Hämozytometers als auch die lebenden grünen Blutkörperchen zeigt.
    1. Zählen Sie die grünen Zellen in sechs Feldern pro Probe und notieren Sie sich die Abmessungen des Rasters, damit die Anzahl der grünen Zellen pro Volumen berechnet werden kann.
      HINWEIS: Die Feldabmessungen in den aktuellen Versuchen betragen 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, was 0,063 mm3 oder 6,3 x 10-5 mL entspricht. Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml zu erhalten, dividieren Sie die gezählte Anzahl lebender Zellen durch 6,3 x 10-5 ml und multiplizieren Sie sie dann mit zwei (oder 2000, wenn es sich um die unbehandelte Kontrolle T = 24 h handelt).

7. Bestimmung der Anzahl lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen (VBNCs)

HINWEIS: Verwenden Sie die Anzahl der kultivierbaren Zellen, die aus der Anzahl der lebensfähigen Platten und der Anzahl der lebensfähigen Zellen aus der Lebend-/Totfärbung erhalten wurden, um die Anzahl der VBNCs zu bestimmen.

  1. Berechnen Sie VBNCs/ml, indem Sie die Anzahl der kultivierbaren Zellen/ml von der Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml subtrahieren.
  2. Verwenden Sie einen Wilcoxon-Matched-Pairs-Test, um die VBNCs/ml oder die kultivierbaren Zellen/ml mit den lebensfähigen Zellen/ml für jede Behandlung zu vergleichen.

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Ergebnisse

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Lebensfähige, aber nicht kultivierbare (VBNC) bakterielle Lebensformen werden durch Stressfaktoren, einschließlich Antibiotikabehandlung, induziert und verursachen aufgrund ihrer Antibiotikatoleranz wiederkehrende Infektionen. Da MH ein antimikrobielles Breitbandmittel ist, gegen das selten Resistenzen festgestellt wurden, wurde die Hypothese aufgestellt, dass MH weniger VBNCs induziert als herkömmliche Antibiotika. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um VBNCs zu quantifizieren, die von zwei wundenverursachend...

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Diskussion

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Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht den Nachweis von VBNC-Zellpopulationen in wundverursachenden Bakterien, die mit minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) von MH und herkömmlichen Antibiotika behandelt wurden. Zu den kritischen Schritten im Protokoll gehörten die Vorbereitung der MH-Verdünnungen am Tag des Experiments, die Vermeidung von Probenverlusten während der Lebend-/Totfärbung und die korrekte Berechnung des analysierten Volumens. Für diese und andere Studien wurd...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch zwei Stipendien der Eastern Washington University finanziert, den Faculty Research and Creative Works Grant an A.R.C und den Undergraduate Research & Creative Activities Grant an L.T.B. Bill und Connie Cross spendeten Geld an die EWU, um das inverse Fluoreszenzmikroskop Leica DMIL mit einer Digitalkamera zu kaufen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Müller Hinton BouillonFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) Brühe Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
NatriumchloridSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
TobramycinSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
  Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
SchüttelbrutatorEppendorfM13520000
BrutkastenBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL inverses Fluoreszenzmikroskop Leica Microsystems11521265
DigitalkameraLeica Microsystems12730522
15 mL Falcon-RöhrchenGenesee Scientific28-103
serologische PipettenDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipettierhilfe Pipettierhilfe PipettiererDrummond Scientific Company4-000-101
BunsenbrennerFisher ScientificS48108
Rainin-PipettenPipette.comL-20, L-200, L-1000
WaageMettler ToledoXS603S
96-Well-PlatteFalcon351172
ImpföseFisher Scientific13-104-5
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Glas SpreaderhausgemachtNA
Lebendto-Färbeset für BakterienInvitrogenL7012
Mikrofuge-RöhrchenBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
ZinnfolieCostcoNA
Software zur Herstellung von FigurenGraphPadNAGraphPad Prism wurde für die Erstellung von Zahlen und die Durchführung statistischer Analysen verwendet.

Referenzen

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Behandlung mit Manuka HonigAntibiotikaresistenzlebensf hige KeimzahlStaphylococcus aureusPseudomonas aeruginosaFluoreszenzmikroskopiekoloniebildende Einheiten

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