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Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

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DOI:

10.3791/67400

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25. Oktober 2024

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Zusammenfassung

Neuere Forschungen haben das Verständnis der Atherosklerose als transmurale chronische Entzündungserkrankung vorangetrieben, an der alle drei Schichten der Arterienwand beteiligt sind, einschließlich der Intima-Plaque, der Medien und der Adventitia, die die äußere Bindegewebsschicht der Arterien bildet. Unsere jüngsten Studien deuten darauf hin, dass die Adventitia vom peripheren Nervensystem als Kanal genutzt wird, um alle Gewebezellen zu erreichen. Wir fanden auch heraus, dass das periphere Nervensystem, d.h. das sensorische und sympathische Nervensystem, große Umbauprozesse durchläuft, die die Neogenese von Axonnetzwerken in der Nähe von atherosklerotischen Plaques beinhalten. In diesem Zusammenhang verspricht das Verständnis der Struktur des neuronalen Netzwerks und seiner Wechselwirkungen mit den vaskulären Komponenten erkrankter Arterien ein besseres Verständnis der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Um diese Ziele zu erreichen, sind Methoden erforderlich, um die subzelluläre Architektur der intakten gesunden und erkrankten Arterien zusammen mit ihren umgebenden perivaskulären Kompartimenten sichtbar zu machen. Die Gewebereinigung ermöglicht die intakte Tiefengewebsbildgebung von größeren Gewebekompartimenten, die sonst nicht zugänglich wären. Es ermöglicht die volumetrische Bildgebung intakter Arterien durch die Integration von Markierungs-, Clearing-, fortschrittlichen mikroskopischen Bildgebungs- und Bildverarbeitungswerkzeugen. Hier beschreiben wir zwei unterschiedliche, aber komplementäre passive Gewebe-Clearing-Ansätze, nämlich das wässrige 2,2-Thiodiethanol (TDE)-Clearing und das lösungsmittelbasierte Immunmarkierungs-ermöglichte dreidimensionale Imaging von solvent-cleared organ (iDISCO) Clearing, um isolierte Aortensegmente oder ganze Aorta in-situ in der gesamten Maus abzubilden.

Einleitung

Histologische Techniken vermitteln ein grundlegendes Verständnis biologischer Proben durch das Schneiden von Geweben/Organen. Die Abgrenzung komplexer anatomischer Zell-Zell- und Gewebe-Gewebe-Wechselwirkungen in drei Dimensionen (3D) war jedoch - bis vor kurzem - schwierig zu erreichen. Dieser ungedeckte Bedarf zeigte sich besonders deutlich im Zusammenhang mit dem Herz-Kreislauf-System bei gesunden und kranken Zuständen. Die Bildgebung von intaktem Gewebe war in der Vergangenheit aufgrund der Lichtabsorption und Lichtstreuung eine Herausforderung, wodurch sie von Natur aus undurchsichtig sind. Das Tissue Clearing macht die intakte biologische Probe transparent, indem es diese Einschränkungen minimiert. Jüngste Entwicklungen in der Gewebereinigungstechnik ermöglichen eine hochauflösende 3D-Bildgebung von ungeschnittenen transparenten Geweben, um einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre und strukturelle Mikroarchitektur ganzer Organe mit Mikrometerauflösung zu erhalten und so die Definition anatomischer Konnektivitätsnetzwerke zu ermöglichen.

Die Atherosklerose umfasst drei Schichten der Arterienwand, darunter die innere Intimaschicht, die mittlere Medienschicht und die äußere Bindegewebsschicht, die als Adventitia bezeichnet wird. Atherosklerotische Plaques in der inneren Schicht der Arterien sind seit Jahrzehnten ein konventionelles Ziel der Forschung 1,2. Die Adventitia-Schicht enthält jedoch Blutgefäße, Lymphgefäße und Nervenfasern des peripheren Nervensystems. Darüber hinaus ist die Adventitia mit dem perivaskulären Fettgewebe und den neuronalen Gewebekomponenten, einschließlich der peripheren Nerven und der perivaskulären Ganglien, verbunden 3,4. Es ist bekannt, dass periphere Nerven die Adventitia als Kanäle nutzen, um entfernte Zielgewebe und sogar Zellen zu erreichen5. Unsere jüngsten Studien haben den Fortschritt im Verständnis der vielschichtigen Wechselwirkungen der wichtigsten biologischen Systeme, zu denen das Immunsystem, das Nervensystem und das Herz-Kreislauf-System gehören, vorangetrieben. Wir haben diese Wechselwirkungen als Neuroimmun-Herz-Kreislauf-Schnittstellen bezeichnet 6,7. Während der Atherogenese werden arterielle Wandkomponenten einer robusten Umstrukturierung und einem Umbau unterzogen. Zum Beispiel bilden sich neben der atherosklerotischen Plaqueprogression in der Intima Immunzellaggregate, und die neuronale Axonneogenese tritt in der murinen Aorta adventitia auf 6,8,9. Mit fortschreitender Atherosklerose entwickeln sich Immunzellaggregate zu gut strukturierten tertiären lymphatischen Organen (ATLOs) der Arterie mit unterschiedlichen T-Zell-, B-Zell- und Plasmazellbereichen10. Um diese Veränderungen in 3D abzugrenzen, war die hochauflösende Bildgebung des intakten Gewebes jedoch aufgrund unzureichender Membranpermeabilisierung und inhärenter Lichtstreuung eine Herausforderung11. Tissue-Clearing-Ansätze haben die großen Einschränkungen herkömmlicher histologischer Ansätze überwunden 11,12,13,14,15 mit einer verbesserten Penetration von Antikörpern, um durch gleichmäßige Anpassung des Brechungsindex (RI) tief in intakte Gewebe oder Organe vorzudringen, was zu Bildern mit einer Auflösung im Mikrometerbereich mit höherer Bildgebungstiefe in Voxeln führt. RIs von Proben können entweder mit Glycerin (RI 1,46) oder Immersionsöl (RI 1,52) abgeglichen werden, wodurch Lichtstreuung und sphärische Aberrationen stark reduziert und eine hohe Auflösung ermöglicht werden. Jüngste Fortschritte bei der Reinigung von Ganzorgan- oder Ganzkörpergewebe, wie z. B. wässriges 2,2-Thiodiethanol (TDE) und immunmarkierungsgestützte 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreigeschalteten Organen (iDISCO), zusammen mit volumetrischen Bildgebungsverfahren (einschließlich konfokaler, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie) haben die Rekonstruktion der Mikroanatomie der Gefäßarchitektur ermöglicht, indem sie ihren Konnektivitätsatlas konstruierthaben 11,16. Die Visualisierung dieser zellulären und strukturellen Zusammenhänge in 3D kann neue Erkenntnisse liefern, um bisher unbeantwortete biologische Fragen zu beantworten.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde nach den Richtlinien des lokalen und nationalen Ausschusses für Tierverwendung und -pflege durchgeführt. In der vorliegenden Studie wurden hyperlipidämische männliche Apoe-/- Mäuse auf C57BL/6J-Hintergrund verwendet, die unter einer Standard-Nagetiernahrung gehalten wurden und während des Alterns spontan Atherosklerose entwickeln.

1. Whole-Mount-Bildgebung der isolierten Aorta und TDE-Clearing

  1. Vorbereitung des Gewebes
    1. Bereiten Sie das Anästhetikum mit 150 mg/kg Ketamin und 30 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle) pro Maus vor. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion tief und bestätigen Sie dies durch die fehlende Reaktion auf den Tiefenschmerztest.
      HINWEIS: Die Konzentration und das Volumen der Injektion sind wie folgt: Ketamin 100 mg/ml; Xylazin 20 mg/ml; Injektionsvolumen 50:50 Vol.-% Mischung aus Ketamin und Xylazin bei 3 μL/g.
    2. Legen Sie die Maus auf eine mit chirurgischen Papiertüchern bedeckte Schaumstoffplatte und fixieren Sie Arme und Beine mit Klebeband in Rückenlage. Desinfizieren Sie den Brustkorb mit 75%igem Ethanol (siehe Materialtabelle) und entnehmen Sie Blut über den linken Ventrikel mit einer 1-ml-Einwegspritze, um das Blut für eine bessere Durchblutung zu entfernen.
      HINWEIS: Eine kardiale Blutentnahme mittels Thorakotomie kann ebenfalls verwendet werden.
    3. Machen Sie einen Mittellinienschnitt an der Brust, um das Herz freizulegen, und einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof, um eine transkardiale Perfusion zu ermöglichen. Perfundieren Sie die Maus über den linken Ventrikel für 5 min mit 10 mL 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; siehe Materialtabelle) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 20 mL PBS für 5-10 min, bis das Blut ausgespült ist. Zum Schluss 20 min lang mit 10 mL 4% Paraformaldehyd (PFA) perfundieren.
      HINWEIS: Alle Eingriffe können mit einer peristaltischen Perfusionspumpe mit einem Druck von 100-125 mm Hg bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden. Die Perfusionsnadel wird durch das gleiche Loch in das Mausherz eingeführt wie die Blutentnahme.
    4. Entferne innere Organe, einschließlich Milz, Leber, Lunge sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane, mit chirurgischen Instrumenten. Halten Sie das Herz, die Aorta und die Nieren in situ intakt.
      HINWEIS: Chirurgische Instrumente, die zum Sezieren und Entfernen von Organen verwendet werden, sind eine Präparierschere, eine feine Irisschere, eine Federschere, eine stumpfe Pinzette, eine gebogene Pinzette und eine gebogene feine Pinzette.
    5. Die gesamte Aorta von der aufsteigenden Aorta bis zur Beckenbifurkation wird unter dem Präparierstereomikroskop (30-40-fache Vergrößerung) exponiert. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Fettgewebe, ohne die Aorta zu verletzen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu durchtrennen. Bei Apoe-/- Mäusen ist das minimal umgebende perivaskuläre Fettgewebe der Aorta für eine zusammenhängende Struktur aufzubewahren.
    6. Ernten Sie die gesamte Aorta in eine Petrischale, die mit PBS gefüllt ist. Teilen Sie die Aorta in verschiedene Segmente und teilen Sie die gesamte Aorta in Längsrichtung mit einer Iris oder einer Federschere, um die Intimaoberfläche freizulegen, und zwar in der Reihenfolge und Richtung, die in Abbildung 1A für die TDE-Reinigung angegeben ist.
    7. Stecken Sie die vordere Aorta in Y-Form auf die flache schwarze Wachsplatte, wie in Abbildung 1A gezeigt. Postfixieren Sie es in 4 % PFA über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Stecken Sie die Aorta vor der Fixierung an die Wachsplatte, um ein Falten und Kräuseln in den folgenden Schritten zu vermeiden.
    8. Löse die Aorta und übertrage sie in PBS. Waschen Sie die Aorta 5 Mal lang 5 Minuten lang gründlich.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta zum Waschen jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind.
  2. Antikörperfärbung für die Aorta en-face
    HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 2-ml-Safe-Lock-Röhrchen mit sanfter Drehung oder Schütteln bei RT durchgeführt.
    1. Übertragen Sie die fixierte Aorta für 2 h in eine Blockierungslösung zur Blockierung und Permeabilisierung.
      HINWEIS: Die Blockierungslösung variiert je nach Primär- und Sekundärantikörper. Zum Beispiel Blockierungslösung: 0,5 mg/ml CD16/32 (1:100), 10% normales Eselserum, 2% Triton X-100 in PBS (siehe Materialtabelle)
    2. Inkubieren Sie die Aorta mit Primärantikörpern in der oben genannten Blockierungslösung (Schritt 1.2.1), z. B. CD3e (1:100 Verdünnung), NF200 (1:200 Verdünnung) und B220 (1:200 Verdünnung) für 24 Stunden (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Aorta 5 Mal 5 Minuten lang in PBS.
    3. Inkubieren Sie die Aorta mit Sekundärantikörpern in 10 % normalem Eselsserum (1:300 Verdünnung) und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 mg/ml) für die Kernfärbung über Nacht (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Aorta 5 Mal 5 Minuten lang in PBS und lagern Sie die Aorta in PBS bei 4 °C bis zum Gewebereinigungsverfahren.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta zum Waschen jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind. Decken Sie die Tuben mit Alufolie ab, um sie für Schritt 1.2.3 im Dunkeln zu halten.
  3. TDE-Gewebereinigung
    HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 2-ml-Safe-Lock-Röhrchen durchgeführt, die sich sanft bei RT drehen und im Dunkeln mit Aluminiumfolie abgedeckt werden. TDE-Arbeitslösungen (siehe Materialtabelle) sind hochpermeabel und sollten vorsichtig in einem Abzug gehandhabt werden. Sammeln und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
    1. Die gefärbte Aorta in 20%ige TDE-Arbeitslösungen überführen und 1 h inkubieren.
    2. Die Aorta in 47%ige TDE-Arbeitslösungen überführen und 12 Stunden inkubieren. Übertragen Sie die Aorta in 60%ige TDE-Arbeitslösungen und inkubieren Sie sie 24-36 Stunden lang, bis die Proben im sichtbaren Licht transparent werden, um der RI zu entsprechen.
    3. Lagern Sie die Aorta in 60 % TDE bei RT im Dunkeln bis zur Bildgebung.
      HINWEIS: Aktualisieren Sie die Arbeitslösungen alle 30 Minuten für die kurze Inkubationsdauer (z. B. Schritt 1.3.1) und alle 4 Stunden für die langfristige Inkubation (z. B. Schritt 1.3.2). Die Inkubationszeit für jeden Schritt kann je nach Gewebegröße angepasst werden, um eine bessere Antikörperpenetration oder Reinigungstransparenz zu erzielen. Bei Apoe-/- Maus-Aorta, die von Fettgewebe umgeben sind, sollte die Inkubationszeit entsprechend verlängert werden.
  4. Bildgebung der TDE-reinigenden Aorta mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)
    1. Verwenden Sie handelsübliche doppelseitige, klebrige, rechteckige Abstandshalter-Wells mit einer Dicke von 0,2 mm (siehe Materialtabelle). Kleben Sie die Vertiefung auf einen sauberen Objektträger und übertragen Sie die gereinigte Aorta. Achten Sie darauf, dass die Aorten-Adventitia en face dem Deckglas zugewandt ist.
      HINWEIS: Klopfen Sie die Aorta mit der abluminalen Seite der Aorta mit einer abgewinkelten Pinzette vorsichtig flach mit der abluminalen Seite der Aorta auf die Oberseite. Stapeln Sie bei Bedarf mehrere Imaging-Spacer-Wells, um sie an die Gewebegröße anzupassen.
    2. Montieren Sie die Aorta mit Tropfen 60%iger TDE-Lösung. Befestigen Sie vorsichtig ein Deckglas an der Vertiefung und vermeiden Sie dabei Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas.
      HINWEIS: Entfernen Sie vorsichtig die Blasen mit einer Nadel vor dem Deckglas. Verwenden Sie nicht zu viel Einbettlösung, da die Probe herumschwimmen kann.
    3. Verwenden Sie ein invertiertes CLSM-Gerät (siehe Materialtabelle), das mit einem 20-fach Immersionsobjektiv (NA: 0,75) ausgestattet ist.
      HINWEIS: CLSM ermöglicht volumetrische Bildgebung bis zu einer Tiefe von 70 μm mit einer höheren Auflösung, die für die Analyse des Nervendurchmessers und der Nerven-Immunzell-Interaktion in der Aortenadventitia benötigt wird.
    4. Wählen Sie das 20x/0,75 Immersionsobjektiv (Öl). Stimmen Sie die Hybrid-Diodendetektoren auf Basis der gefärbten Farbstoffe ab. Passen Sie die Anzeigeeinstellungen an und wählen Sie für die Bildgebung das XY-Format mit 1024 x 1024 Pixel.
      HINWEIS: Ein Öl-Immersionsobjektiv erfasst Signale besser als Wasser.
    5. Immersionsöl (mit Glycerin) gleichmäßig entlang der Aorta auf das Deckglas tropfen. Bewegen Sie das 63x-Objektiv grob in Richtung der Probe, bis es das Immersionsöl/Deckglas berührt.
    6. Bewegen Sie das 63x-Objektiv fein unter das Mikroskop, um den interessierenden Bereich zu lokalisieren. Erfassen Sie den Z-Stack von der Adventitia-Seite der Aorta en face in Schritten von 2-4 μm bis zu einer Tiefe von 60 μm für die 3D-Bildgebung.
    7. Benennen Sie die Datei mit Beispieldetails, Scandetails, und speichern Sie die Daten.
  5. Bildgebung der TDE-reinigenden Aorta mit einem Multiphotonenmikroskop
    1. Befolgen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.2, um die Aorta en face auf dem Objektträger zu montieren.
    2. Verwenden Sie ein aufrechtes Multiphotonenmikroskop (siehe Materialtabelle), das mit einem 20-fach-Objektiv (Wasserimmersion, NA: 1,00, Arbeitsabstand = 2 mm) ausgestattet ist und volumetrische Bildgebung bis zu einer Tiefe von 1,5 mm ermöglicht.
    3. Erfassen Sie Z-Stacks von der abluminalen Seite in Schritten von 10-15 μm bis zu einer Tiefe von 700 μm. Benennen Sie die Datei und speichern Sie die Daten wie in Schritt 1.4.7 beschrieben.

2. Ganzkörper-Immunfärbung und iDISCO-Gewebereinigung

  1. Vorbereitung des Gewebes
    1. Befolgen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.3 oben für die Anästhesie, das Fixieren der Maus und die Perfusion.
    2. Entfernen Sie die Haut und die inneren Organe, einschließlich Milz, Leber, Lunge sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane, mit chirurgischen Instrumenten. Halten Sie das Herz, die Aorta und die Nieren in situ intakt.
    3. Präparieren Sie den Körperteil oberhalb des Zwerchfells und fixieren Sie den unteren Körperteil mit 4% PFA für 1-2 Tage (e) bei 4 °C.
      HINWEIS: Führen Sie die Fixierung, das Waschen und die Inkubation in 50-ml-Röhrchen auf einem sanft rotierenden Schüttler durch. Frischen Sie die Lösung in neuen Tuben 2-3 Mal auf.
    4. Waschen Sie die Probe 10 Minuten lang 3 Mal gründlich bei RT.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind.
    5. Inkubieren Sie die Probe in 20 % klaren, ungehinderten Cocktails für die Bildgebung von Gehirn und Körper (CUBIC) für 48 Stunden zur Entfärbung.
      HINWEIS: Für eine 20%ige CUBIC-Lösung lösen Sie 25 g Harnstoff in 15 mL Triton X-100 und 28 mL Quadrol und fügen Sie PBS zum Endvolumen von 100 mL hinzu. Bereiten Sie es in der Haube zu, da die Inhaltsstoffe anregend sind (siehe Materialtabelle).
    6. Waschen Sie die Probe 1 h lang fünfmal gründlich in PBS bei RT.
  2. Färbung von Antikörpern
    HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 50-ml-Safe-Lock-Röhrchen mit sanfter Drehung oder Schütteln bei 4 °C durchgeführt.
    1. Inkubieren Sie die Probe über Nacht in PBS-Gelatine-Triton X-100-Serum (PGST)-Lösung zur Permeabilisierung und Blockierung.
      HINWEIS: Die Blockierungslösung variiert je nach Antikörper. Zum Beispiel Blockierungslösung: PBS-Gelatine-Triton X-100-Serum (PGST, siehe Materialtabelle) Lösung: 0,2 % Schweinehautgelatine, 0,5 % Triton X-100 und 5 % Ziegenserum in PBS.
    2. Inkubieren Sie die Probe mit Primärantikörpern in PGST-Lösung, z. B. NF200 (1:200 Verdünnung, siehe Materialtabelle) bei 4 °C und schütteln Sie sie 10-12 Tage lang. Waschen Sie dann die Probe gründlich 1 h 5 Mal bei RT in PGST.
    3. Die Probe wird 7 Tage lang mit einer Sekundärantikörperlösung (1:300 Verdünnung) und DAPI (1 mg/ml) in PGST bei 4 °C inkubiert.
    4. Waschen Sie die Probe gründlich 1 h 5 Mal bei RT in PGST. Übertragen Sie die Probe in PBS und lagern Sie die Aorta in PBS bei 4 °C für weitere Schritte.
      HINWEIS: Decken Sie die Tuben mit Aluminiumfolie ab, um sie für die Schritte 2.2.3-2.2.4 dunkel zu halten.
  3. Modifiziertes iDISCO Gewebe-Clearing
    HINWEIS: Während des Reinigens sollten die Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um ein Signalbleichen/Abschrecken durch direkte natürliche/künstliche Lichteinwirkung zu vermeiden. Alle organischen Reagenzien, die bei der DISCO-Räumung verwendet werden, sind schädlich, und alle Reinigungsschritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Tragen Sie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Maske, wenn Sie mit den Reagenzien umgehen, um ein Einatmen und den Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden. Sammeln Sie den Räumabfall und entleeren Sie ihn in entsprechende Abfallbehälter in der Haube.
    1. Die gefärbten Proben aus Schritt 2.2.4 werden in eine Reihe erhöhter Konzentrationen von Tetrahydrofuran (THF) Arbeitslösungen zur Dehydratisierung überführt, d. h. 50 %, 70 %, 90 % und 100 % (zweimal 100 %). 12 Stunden pro Konzentration inkubieren.
      HINWEIS: Verdünnen Sie das THF-Reagenz (99%-100%) in destilliertem Wasser für Arbeitslösungen unterschiedlicher Konzentrationen in der Haube. Aktualisieren Sie die Arbeitslösungen alle 6 Stunden.
    2. Die Probe wird für 3 Stunden in eine Lösung aus absolutem Dichlormethan (DCM, siehe Materialtabelle) zur Lipidentfernung überführt.
    3. Die Probe wird in eine RI-passende Benzylalkohol-Benzylbenzoat-Arbeitslösung (BABB) überführt (siehe Materialtabelle). 3-6 h inkubieren, bis das Gewebe durchscheinend und im sichtbaren Licht weitgehend transparent ist.
      HINWEIS: Zur Herstellung der BABB-Arbeitslösung 1 Teil Benzylalkohol und 2 Teile Benzylbenzoat (1:2) in einer Glasflasche mischen. Schütteln Sie es vorsichtig 5 Minuten lang in der Haube.
  4. Bildgebung von iDISCO bei der Reinigung von Gewebe mit einem Lichtblattmikroskop
    HINWEIS: Bilde die geklärte Probe ab, sobald eine optimale Transparenz erreicht ist. Für die Bildgebung wird ein Lichtblattmikroskop, wie z.B. ein Ultramikroskop-II (siehe Materialtabelle), verwendet. Füllen Sie das bildgebende Reservoir mit der endgültigen Reinigungslösung, der BABB-Lösung. Achten Sie darauf, kein BABB auf das Instrument zu verschütten, um Schäden am Instrument zu vermeiden.
    1. Verwenden Sie ein 1-fach-Luftobjektiv für Bilder mit geringer Vergrößerung, die die gesamte Breite der gesamten Probe abdecken. Die Probe aus der Reinigungslösung vorsichtig auf ein Papiertuch übertragen und kurz trocknen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein Zusammendrücken der Probe zu vermeiden.
    2. Wählen Sie einen Probenhalter in geeigneter Größe basierend auf der Proben-/Gewebegröße aus und befestigen Sie die Rückseite der Probe mit Sekundenkleber am Probenhalter.
      HINWEIS: Warten Sie 1-2 Minuten, bis die Probe fest mit dem Probenhalter verbunden ist.
    3. Füllen Sie das Bildgebungsreservoir des Lichtblattmikroskops mit BABB-Lösung und legen Sie die Probe vorsichtig hinein. Stellen Sie den Probenhalter so ein, dass die Probe senkrecht zum Lichtblatt steht und richtig beleuchtet ist.
    4. Senken Sie das Objektiv, um die Probe zu fokussieren, und passen Sie die Anzeigeeinstellungen an, während Sie fokussieren, um die Probe richtig anzuzeigen. Wählen Sie die richtigen Lichtblätter in der Mikroskopsoftware aus und passen Sie ihre Breite an, um das gesamte Sichtfeld gleichmäßig auszuleuchten.
      HINWEIS: Bei einem Ultramikroskopsystem mit beidseitiger Laserbeleuchtung beginnen Sie damit, den Laser auf einer Seite auszurichten und zu fokussieren. Sobald beide Seiten eingestellt sind, aktivieren Sie beide Seitenlaser, um ein zusammengeführtes Scanbild von beiden Beleuchtungen zu beobachten.
    5. Wählen Sie einen dunkelroten Kanal (680 nm), um NF200-gefärbte neuronale Strukturen abzubilden, und einen Autofluoreszenzkanal (488 nm), um ungefärbte Aorta und Bindegewebe abzubilden. Passen Sie die Laserleistung in Abhängigkeit von der Intensität des Fluoreszenzsignals an, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis, die Belichtungszeit und die Breite der Lichtblätter zu erzielen.
    6. Wählen Sie den X-Y-Z-Scan-Modus. Stellen Sie den Z-Stapel-Scan auf einen Z-Schritt von 2-8 μm ein und wählen Sie eine Überlappung von 25 % bis 60 % entlang der Längs-Y-Achse der Kachelscans (16 Bit), die die ventralen und dorsalen Oberflächen der Proben abdeckt, um das gesamte Probenvolumen (bis zu einer Tiefe von 6-8 mm) abzubilden.
    7. Benennen Sie den Scan mit detaillierten Informationen, einschließlich des Scandatums, des Probennamens, des verwendeten Antikörpers, des Objektivs, des Zoomfaktors, der Z-Schritte und der verwendeten Laser. Speichern Sie die Daten.
    8. Wechseln Sie über die Zoom-In-Funktion zu einer höheren Vergrößerung (2x oder 4x), um bestimmte Körperregionen von Interesse abzubilden.
    9. Führen Sie die Schritte 2.4.4-2.4.7 oben aus, um ein Imaging durchzuführen und die Daten zu speichern.

3. Bildverarbeitung und Analysen

HINWEIS: Für die Verarbeitung wird eine Hochleistungs-Verarbeitungs-Workstation benötigt. Stellen Sie die Datensicherung sofort nach der Verarbeitung aufgrund des hohen Imaging-Volumens (5-100 GB pro Image) sicher.

  1. Bildverarbeitung von CLSM- und Multiphotonenbildern
    1. Laden Sie die gekachelten Z-Stapel-Bilder von CLSM- und Multiphotonenmikroskopen in die Bildverarbeitungs-Workstation, die mit Las X, Imaris (Bildanalysesoftware) oder Fiji-Software für 3D- und zweidimensionale (2D) Visualisierung, Segmentierung und Quantifizierung ausgestattet ist.
    2. Um die Volumentiefe einer Zelle oder Struktur farblich zu kodieren, verwenden Sie eine Bildwiederherstellungssoftware (siehe Materialtabelle), um das Rohbild zu dekonvolutieren und eine Projektion mit maximaler Intensität der entfalteten Daten unter Verwendung der zeitlichen Farbcodierung in Las X oder Fidschi zu erzeugen.
  2. Bildverarbeitung von Lightsheet-Bildern
    1. Laden Sie die gekachelte TIFF-Bildserie mit Z-Stapel in die Fidschi-Software. Fügen Sie Bilder mit dem Stitching-Plugin von Fidschi zusammen und speichern Sie zusammengefügte Bilder im TIFF-Format.
      HINWEIS: Komprimieren Sie bei Bedarf die zusammengefügten Bilder im LZW-Format, um eine schnelle Verarbeitung mit anderer Software zu ermöglichen.
    2. Laden Sie die zusammengefügten Bilder in eine 3D-Visualisierungssoftware (siehe Materialtabelle), um die Bilder zu segmentieren. Verfolgen Sie manuell die neuronalen und vaskulären Strukturen in der x-y-z-Achse. Für die manuelle Verfolgung kleiner Nervenfasern wählen Sie die NF200+ -Signale Pixel für Pixel in jeder Z-Ebene entlang des gesamten Weges der Nervenfaser zwischen Aorta und Ganglien manuell aus.
    3. Laden Sie vorverarbeitete Bilder in eine Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um Videos zu generieren und die Bilder in 2D und 3D zu visualisieren.
    4. Verwenden Sie die Autofluoreszenz, um die Aorta und das Bindegewebe, einschließlich Lymphknoten und Muskeln, in der Bildanalysesoftware zu segmentieren. Wenden Sie separate Pseudofarben in der Bildanalysesoftware an, um unterschiedliche Aortensegmente wie Aortenwand und Plaque zu visualisieren.
    5. Verwenden Sie die CLAHE-Funktion (Contrast-Limited Adaptive Histogram Equalization) in der Fidschi-Software, um den lokalen Kontrast über dem Hintergrund der verarbeiteten Bilder zu verbessern.

Ergebnisse

Um die Mikroanatomie der intakten gesunden und kranken Aorta zu demonstrieren und die physikalischen Verbindungen zwischen dem Immunsystem, dem Nervensystem und dem Herz-Kreislauf-System in Mausmodellen der Atherosklerose aufzudecken, verwendeten wir zwei komplementäre Gewebe-Clearing-Ansätze: TDE-Clearing der isolierten Aorta und iDISCO-Clearing der gesamten Maus (Abbildung 1). Nach der Immunfärbung des gesamten Mount wurde die Aorta mit einer Reihe von TDE-Arbeitslösungen gereinigt. Die RI wird je nach TDE-Konzentration des letzten Schritts bei 1,4-1,5 angepasst, um eine optimale Transparenz des Aortengewebes zu erreichen, ohne dessen Volumen zu verändern (Abbildung 1A). Im Gegensatz zum TDE-Clearing umfasst das iDISCO-Clearing-Protokoll Entfärbungs- und Permeabilisierungsschritte vor der Immunfärbung auf dem gesamten Mount, gefolgt von Delipidierung und Dehydratisierung mit verschiedenen chemischen Lösungsmitteln und dem RI-Matching bei 1,56 (Abbildung 1B). Das iDISCO-Clearing ermöglicht die Visualisierung von großformatigem Gewebe und aufgrund der Schrumpfung des Gewebes sogar des gesamten Mauskörpers.

Die konfokale und Multiphotonen-3D-Bildgebung der TDE-cleared Whole Mount en face Aorta ermöglicht die Visualisierung von Strukturen, einschließlich Intima-Plaques, Adventitia-Zellularität und neuronalen Adventitia-Projektionen, während die Lichtblatt-Bildgebung der iDISCO-geklärten Maus die Visualisierung und Rekonstruktion des Arterienbaums zusammen mit perivaskulärem Fettgewebe, Nierenlymphknoten und den zugehörigen neuronalen Komponenten einschließlich Nerven und Ganglien ermöglicht (Abbildung 1C). Zum Beispiel wurden bei der konfokalen Bildgebung von TDE-geklärten atherosklerotischen Aorten mehrere CD3e-gefärbte T-Zellen in Plaque und eine ausgedehnte Neogenese von NF200-gefärbten Nervenfasern unterschiedlicher Durchmesser in ATLOs nachgewiesen, während die Multiphotonenbildgebung von TDE-befreiten erkrankten Bauchaorten von gealterten Apoe-/- Mäusen die Territorialität der NF200-exprimierenden Axonsprossung in B220-negativen T-Zellbereichen innerhalb von ATLOs zeigte (Abbildung 2A). Umgekehrt visualisierte die Lichtblatt-Bildgebung des iDISCO-gereinigten gesamten Mausabdomens die räumliche Beziehung zwischen der Aorta und den angrenzenden sympathischen Ganglien. Die 3D-Bildsegmentierung und -verfolgung einzelner Axone von den Ganglien bis zur Aortenoberfläche zeigte eine robuste neuronale Umstrukturierung, einschließlich neu gebildeter NF200-gefärbter Axone in der Aorta adventitia neben atherosklerotischer Plaque (Abbildung 2B).

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Abbildung 1: Ablauf der Studie. (A) TDE-Reinigung der vorderen Aorta auf wässriger Basis. (B) Lösungsmittelbasiertes iDISCO-Clearing der gesamten Maus. (C). 3D volumetrische Bildgebung und Bildverarbeitung von optisch geklärten isolierten Aorta oder ganzen Mausproben. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Sun et al.17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Beispiel für 3D-Bilder von TDE- und iDISCO-geklärtem Gewebe. (A) 3D-Bildgebung von TDE-gereinigter Aorta im Gesicht . Oberes Bild: Konfokale Bilder zeigten CD3e+ T-Zellen (rot, Pfeil) in intimalen Plaques und NF200+ Nervenaxone (grün) in atherosklerotischer Aorta adventitia (ATLO); Unteres Bild: Multiphotonenbilder zeigten NF200+ Nervenaxone (grün, Pfeilspitzen), B220+ B-Zellen (rot, offenes Dreieck), kollagenabgeleitete zweite harmonische Generation (SHG, weiß) in ATLOs von 78 Wochen alten männlichen Apoe-/- Mäusen. Sytox (blau) und DAPI (blau) zeigten die Zellkerne. (B) 3D-rekonstruierte und segmentierte Bilder von iDISCO, die den gesamten Abdomen der Maus gereinigt haben. Light-Sheet 3D-Rekonstruktion, Segmentierung und Verfolgung von NF200+ Nerven und Axonen (Pfeile, grün) und ihre räumliche Beziehung zu sympathischen Ganglien (Pfeilspitzen) der intakten Bauchaorta. Das offene Dreieck deutete auf ein neu gebildetes Axon an, das an atherosklerotische Plaques angrenzt. Die Autofluoreszenz (auto) wurde verwendet, um die Aorta und das Bindegewebe, einschließlich Plaque (cyan) und renalen Lymphknoten (RLN, blau), abzubilden. CG, Zöliakieganglien, SycG, sympathische Kettenganglien. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Mohanta et al.6 und Sun et al.17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Atherosklerose kann als transmurale entzündliche Erkrankung der Arterien angesehen werden, an der alle drei Schichten der Arterienwand beteiligt sind. Darüber hinaus sind die Arterien vom perivaskulären Fettgewebe und dem neuronalen Gewebe umgeben. Während des Fortschreitens der Atherosklerose erfährt jedes dieser Gewebe erhebliche zelluläre und strukturelle Veränderungen, die Methoden erfordern, um einen subzellulären optischen Zugang zu den intakten Geweben zu erhalten, die gesunde und kranke Arterien umgeben. Diese Methoden werden hier zur Verfügung gestellt, um Zell-Zell- und Zell-Gewebe-Wechselwirkungen besser zu verstehen und das Verständnis der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu fördern. Die Gewebereinigung und die anschließende 3D-Mikroskopie ermöglichen die Abbildung großflächiger, bisher unzugänglicher intakter Gewebekompartimente, wodurch detaillierte Rekonstruktionen von Arterien möglich werden. Hier stellen wir Protokolle für TDE- und iDISCO-Gewebereinigungstechniken vor und unterstreichen ihre Wirksamkeit und Einfachheit bei der Erzielung einer nahezu vollständigen Gewebetransparenz, einer effizienten Bildgebung mit Konfokal-/Multiphotonen- oder Lichtblattmikroskopie bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität.

Beim TDE-Clearing wird ein wasserlösliches Reagenz verwendet, um durch Anpassung der RI eine Gewebetransparenz zu erreichen und so die Fluoreszenzsignale im Gewebe effektiv zu erhalten. Es stellt eine effiziente Gewebereinigungsmethode für kleinere Blutgefäße dar, d.h. ein mikrometer- bis millimetergroßes Gewebevolumen ohne Gewebeschrumpfung. Für größere Gewebe, also millimeter- bis zentimetergroße Gewebevolumina, ist jedoch eine längere Verarbeitungszeit erforderlich. Wichtig ist, dass das Verfahren an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden kann, indem die Konzentration der Reagenzien und die Inkubationszeit angepasst werden. Auf der anderen Seite verwendet iDISCO eine Reihe von organischen Lösungsmitteln, um Lipide und Wasser zu entfernen, was zu einer besseren Gewebetransparenz für größere Gewebe, ganze Organe oder die ganze Maus oder größere menschliche Gewebe führt. Es bietet die einzigartigen Vorteile kurzer Verarbeitungszeiten und der Eignung für große Gewebevolumina. Es führt jedoch zu einer Schrumpfung der geklärten Proben, zum Löschen der Fluoreszenzsignale und zur Entfernung von Lipiden, was eine große Einschränkung für lipidreiche atherosklerotische Gewebe darstellt. Darüber hinaus kann die Lichtblattmikroskopie im Gegensatz zur konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie keine subzellulären Details auf Mikrometerebene visualisieren und neuronale Projektionen mit kleinem Durchmesser, wie z. B. einzelne Axone und ihre Verbindungen mit anderen Gefäßzellen, sichtbar machen.

Die vaskuläre Innervation spielt eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von Atherosklerose 6,7,18. Die Untersuchung der Verteilung peripherer Nerven entlang des Arterienbaums und ihrer Veränderungen wird helfen, den Krankheitsverlauf zu verstehen. Aufgrund seiner effizienten Verarbeitungsfähigkeit wird iDISCO häufig für die Bildgebung des gesamten Gefäßnetzwerks in Atherosklerosemodellen bei Ratten und Mäusen 12,19,20,21 verwendet und liefert hochauflösende dreidimensionale Bilder. TDE hingegen eignet sich für Studien, die die Konservierung von Fluoreszenzmarkierungen erfordern, wie z. B. die Beobachtung spezifischer neuronaler Marker, wodurch die Feinstruktur und die Veränderungen der vaskulären Innervation genau sichtbar gemacht werden6. Beide Gewebe-Clearing-Protokolle sind erforderlich, da das TDE-Clearing keine Schrumpfung beinhaltet und Lipide abbilden kann, während iDISCO zu einer Gewebeschrumpfung aufgrund von Dehydrierung und Delipidierung führt. Darüber hinaus kann das modifizierte iDISCO-Protokoll für die Gewebereinigung von menschlichem kardiovaskulärem Gewebe verwendet werden22,23. Beide Clearing-Techniken bieten komplementäre Vorteile bei der Untersuchung des arteriellen Umbaus bei Atherosklerose. Durch die Kombination der Stärken beider Methoden kann ein umfassenderes und tieferes Verständnis der pathologischen Mechanismen der Atherosklerose erreicht werden.

Offenlegungen

SKM, CJY und AJRH sind Mitbegründer der Easemedcontrol R &D GmbH und Co. KG.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB1123/Z1, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK) DZHK 81X2600282 und ein Corona Foundation Grant (S199/10087/2022) an SKM; und ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 sowie ein staatliches Stipendium an AJRH bei Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,2'-Thiodiethanol (TDE)Sigma 166782Clearing-Reagenz
AmiraThermo Fisher Scientific3D-Visualisierungssoftware; Bildverarbeitungssoftware für die manuelle Segmentierung und Verfolgung in 3D-Bildern
BenzylalkoholSigma W213713Clearing-Reagenz
BenzylbenzoatSigmaB6630Clearing-Reagenz
CD16/32eBioscience14-0161-82Blockierungslösung
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeica MicrosystemsTCS-SP8 3XBildgebungsgerät für die mehrdimensionale, hochauflösende Bildgebung von intakten biologischen Geweben oder Schnitten mit hoher Spezifität bei subzellulärer Auflösung.
DAPIInvitrogenD3571Kernmarker
Dichlormethan (DCM)Sigma 270997Klärendes Reagenz
zum Präparieren von pan-black wax Thermo Scientific S17432Dissektion und Fixierung der Aorta
Präparier-StereomikroskopLeica Microsystems Stemi 2000Maus Organdissektion
Ethanol SigmaE7023Überläufer 
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Roth 8040.1Perfusionspuffer 
Fidschi (ImageJ, NIH)Open-Source-Bildverarbeitungssoftware für 2D- und 3D-Bilder
Ziege Anti-Hamster IgG, Cy3Dianova 127-165-099Sekundärer Antikörper
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Sekundärer Antikörper
Ziege Anti-Ratte IgG, Cy5Dianova712-175-150Sekundärer Antikörper
Hamster Anti-CD3e BD Bioscience145-2C11 Pan-T-Zellmarker
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, NiederlandeVersion 19.10Software zur Bildrestaurierung; Bildverarbeitungssoftware, die hauptsächlich zur Entfaltung von 2D- und 3D-Bildern verwendet wird
BildverarbeitungsarbeitsplatzMIFCOM MIFCOM X5Bildverarbeitungs-Workstation ausgestattet mit der gesamten Bildverarbeitungssoftware, einschließlich Leica Application Suite X, Fiji und Imaris für die Nachbearbeitung von Bildern, die mit Konfokal-, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopen aufgenommen
ImarisBitplaneVersion 8.4Bildanalysesoftware; Bildverarbeitungssoftware für die automatisierte Segmentierung von 3D-Bildern
Inkubator und Rotator Marshall Wissenschaftlich Innova 4230Inkubations- und Rotationsvorrichtung während der Gewebereinigung
iSpacerSunjin LabIS4020Rechteckige Vertiefung sowie der Probenhalter
KetaminLivistoAnästhetikum
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsVersion 3.5Bildverarbeitungssoftware für die mit dem Leica Mikroskop aufgenommenen Bilder
LichtmikroskopLeica MicrosystemsDM LBBildgebungsgerät für die Bildgebung mit hellen Feldern
LichtblattmikroskopLaVision BioTechUltramicroscope IIBildgebendes Verfahren für die schnelle, hochauflösende Bildgebung großer biologischer Proben oder ganzer Mäuse bei geringer Lichteinwirkung durch schnelle Aufnahme von Bildern dünner optischer Schnitte.
MultiphotonenmikroskopieLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Bildgebungsmodalität für die mehrdimensionale, hochauflösende Bildgebung von intakten und lebensfähigen biologischen Geweben auf subzellulärer und molekularer Ebene über längere Zeiträume, tief in der Probe und mit minimaler Invasion.
Normales ZiegenserumSigmaG9023Blockierungslösung
Paraformaldehyd (PFA)Sigma P-6148 Fixierung 
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma P4417-100TAB Puffer zum Waschen
Gelatine aus SchweinehautSigma G1890Inkubationspuffer
QuadrolSigma 122262CUBIC Clearing-Reagenz
Kaninchen Anti-NF200SigmaN4142Panneuronaler Marker
Ratte Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Pan-B-Zellmarker
SaccharoseSigma 90M003524V Dehydrierung 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Kernmarker
TetrahydrofuranSigma 401757Clearing-Reagenz 
Triton X-100Roth 3051.1Durchdringung
HarnstoffSigma U5128CUBIC Clearing-Reagenz
Xylol Fisher Chemical x/0250/17 Anästhetikum 
wurden

Referenzen

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  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Bildgebung von AortengewebeAtherosklerose ProgressionGewebeaufhellungKonfokalmikroskopieMultiphoton ImagingImmunmarkierungAdventitia RemodelingVisualisierung neuronaler NetzwerkeBildsegmentierung
Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose
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