Etablierung eines Modells für oberflächliches Blasenkarzinom der Maus mittels intravesikaler Zellverabreichungstechnik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zur Konstruktion eines orthotopen Modells des oberflächlichen Blasenkrebses.

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine innovative Methode zur Etablierung eines orthotopen murinen Blasentumormodells mit hoher Effizienz und präziser Tumorlokalisierung vor. Nach der Anästhesie weiblicher C57BL/6J-Mäuse in Rückenlage wird eine intravenöse 24-G-Nadel in die Blase eingeführt, um den Inhalt zu evakuieren. Anschließend wird eine 34-G-Dosiernadel durch den Katheter eingeführt, fünfmal gedreht, um eine fokale Verletzung der Blasendomschleimhaut zu erzeugen, und anschließend entfernt. Die MB49-Zellsuspension wird aspiriert und mit einer 30 G Dosiernadel verbunden, die über den Katheter in die Blase eingeführt wird. Tumorzellen werden unter Druck submukösal in die Blase injiziert. Diese Technik führt zu einem minimalen Trauma der Mäuse, einer hohen Tumoraufnahmerate und einer festen Tumorlokalisation. Es zeichnet sich durch Einfachheit und hervorragende Reproduzierbarkeit aus. Dieses Modell bietet eine ideale experimentelle Plattform für die Entwicklung intravesikaler Therapien für Blasenkrebs und erleichtert die Weiterentwicklung und Optimierung von Behandlungsstrategien für diese Malignität.

Einleitung

Blasenkrebs stellt eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar, mit bemerkenswerten geschlechtsspezifischen Unterschieden in Inzidenz und Prognose. Diese Malignität ist durch unterschiedliche molekulare Subtypen gekennzeichnet, die jeweils mit unterschiedlichen pathogenen Signalwegen assoziiert sind. Die molekularen und pathologischen Merkmale unterscheiden sich signifikant zwischen dem nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC) und dem muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC)^1,2. NMIBC macht etwa 75 % der Fälle aus, wobei Tumoren transitären epithelialen Ursprungs ohne Metastasierung oder Ausbreitung lokalisiert bleiben. Umgekehrt ist MIBC gekennzeichnet durch die Infiltration von Krebszellen in die Muskelschicht der Blase, begleitet von einem hohen Risiko der Verbreitung, was in der klinischen Praxis häufig eine Zystektomie erforderlich macht³.

In der präklinischen Forschung sind Modelle, die das oberflächliche Stadium der Erkrankung genau abbilden, essentiell für die Evaluierung von medikamentösen Therapien. Die Etablierung eines oberflächlichen Blasenkarzinom-in-situ-Modells ist daher von größter Bedeutung und dient als wichtiges Forschungsinstrument für die Entwicklung klinischer Medikamente und innovativer Instillationstherapien.

Die Entwicklung von orthotopen Blasenkrebsmodellen für murine Patienten stand traditionell vor Herausforderungen. Chemisch induzierte Modelle beginnen oft als oberflächliche Tumore, können sich aber zu invasiven Formen entwickeln, mit einer Variabilität, die ihren Nutzen in groß angelegten Experimenten einschränkt⁴. Traditionelle orthotope Implantationsmodelle, die auf der Injektion von Tumorzellen durch die Blasenwand^{beruhen 5}, haben Schwierigkeiten, oberflächlichen Blasenkrebs originalgetreu zu reproduzieren. Alternative Methoden, einschließlich Schleimhautschädigung in Kombination mit Tumorzellinstillation 6,7,8,9,10, wurden versucht, sind aber durch hohe Mortalitätsraten und niedrige Tumorentnahmeraten eingeschränkt, was ihre breitere Anwendung behindert.

Ziel dieser Studie ist es, eine neue Methode zur Konstruktion eines oberflächlichen Blasenkrebsmodells zu entwickeln, das im Vergleich zu bestehenden Modellen eine höhere Stabilität, eine geringere Mortalität und eine fixierte Tumorpositionierung aufweist. Durch eine genauere Darstellung der Krankheit in ihren frühen Stadien ist das aktuelle Modell in der Lage, die strenge Bewertung präventiver und therapeutischer Interventionen zu verbessern und so die Behandlung von Blasenkrebs voranzutreiben.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Protokolle und Verfahren wurden vom Ethical Review Committee for Animal Experimentation der Tianjin Medical University, Tianjin, China, genehmigt (Zulassungsnummer SYXK: 2020-0010). Für diese Studie wurden sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen untergebracht, einschließlich eines 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, Temperaturen zwischen 21 und 25 °C, einstellbarer Luftfeuchtigkeit zwischen 30 % und 70 % und uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser, sofern nicht anders angegeben. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen

1. Kulturieren Sie die murine Blasenkrebszelllinie MB49 in vollständigem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), um ein optimales Wachstum zu unterstützen.
2. Halten Sie die Zellkulturen unter Standardbedingungen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Aktualisieren Sie das Medium alle 2-3 Tage, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
3. Ernten Sie die Zellen mit einem standardisierten Trypsin-Verdauungsverfahren. Die Zellen nach dem Auftragen von Trypsin und einer kurzen Inkubation vorsichtig aus dem Kulturkolben pipettieren.
4. Zählen Sie die geernteten Zellen mit einem Hämozytometer, um die genaue Zelldichte zu bestimmen. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie die Zellen auf 2 x 10³/μl in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis auf, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Die Mäuse (5 Mäuse pro Käfig) werden in Gruppen in individuell belüfteten Polycarbonat-Käfigen untergebracht.
2. Lassen Sie die Mäuse vor Beginn der Studie 7 Tage lang akklimatisieren.

3. Generierung von orthotopen Tumormodellen an Tieren

1. Verabreichen Sie den Mäusen eine Anästhesie durch intraperitoneale Injektion mit einer 2,5%igen Lösung von Avertin (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
2. Warten Sie, bis die Mäuse ein angemessenes Anästhesieniveau für die Operation erreicht haben, was durch eine Abnahme der Atemfrequenz mit zunehmender Tiefe, das Fehlen von Augenlid- und Hornhautreflexen, einen verminderten Muskeltonus und Reflexreaktionen und keine Reaktion auf ein Schwanzkneifen angezeigt wird.
3. Positionieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage, um den Eingriff zu erleichtern.
4. Verwenden Sie einen intravenösen 24-G-Katheter mit entferntem Nadelstilett für die Harnröhrenkatheterisierung. Tragen Sie reichlich Gleitmittel auf den Katheter auf, um Beschwerden zu minimieren und ein reibungsloses Einführen zu erleichtern.
5. Identifizieren Sie die Harnröhre, die sich unmittelbar hinter den Vulvafalten und vor der Vagina befindet, während Sie die Maus in Rückenlage halten.
   1. Beginnen Sie die Katheterisierung, indem Sie sich der Harnröhre in einem 45-Grad-Winkel nähern, um unter dem Schambein zu navigieren. Stellen Sie einen flacheren Winkel ein, um den Katheter durch die Harnröhre und in die Blase zu führen.
6. Vermeiden Sie es, übermäßige Kraft auf den Widerstand auszuüben, da dies zu einer Harnröhren- oder Blasenperforation führen kann. Bestätigen Sie die Position des Katheters im Blasenlumen, indem Sie nach Urin im Katheter suchen.
7. Üben Sie vorsichtig Druck auf den Unterbauch der Maus aus, um den Urinabfluss aus der Blase zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig entleert ist, um sich auf die nachfolgenden Schritte des Eingriffs vorzubereiten.
8. Schieben Sie den intravenösen 24-G-Katheter vorsichtig in Richtung des oberen Teils der Blase. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Katheters die Spitze der Blase berührt.
   1. Sobald der Kontakt bestätigt ist, lassen Sie den Katheter los und lassen Sie ihn leicht zurückziehen. Halten Sie den Katheter in einer festen Position relativ zur Maus, um die Stabilität zu gewährleisten und ein Lösen zu verhindern.
9. Führen Sie die modifizierte 34-G-Dosiernadel entlang des 24-G-Katheters ein. Schieben Sie die Nadel vor, bis sie die Spitze der Blase erreicht.
   1. Sobald die Nadel positioniert ist, drehen Sie sie sechsmal, um eine lokalisierte Schleimhautverletzung an der Spitze der Blase zu erzeugen. Ziehen Sie die Nadel nach Abschluss der Drehung vorsichtig entlang des Katheters zurück.
10. Verbinden Sie die 30-G-Dosiernadel mit der Oberseite einer 1-mL-Spritze. Sorgen Sie für eine sichere Verbindung zwischen Nadel und Spritze.
    1. Nach dem Anschließen ziehen Sie die vorbereitete 2 x 10³/μl MB49-Zellsuspension in die Spritze, indem Sie den Kolben vorsichtig zurückziehen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellsuspension ohne Luftblasen in die Spritze aspiriert wird.
11. Führen Sie die 30-G-Dosiernadel entlang des 24-G-Katheters ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel richtig ausgerichtet und im Katheter befestigt ist.
    1. Sobald sie positioniert ist, üben Sie Druck auf den Kolben der 1-ml-Spritze aus, um den Inhalt zu injizieren (vorbereitet in Schritt 1). Halten Sie den Kolben 60 s lang konstant unter Druck, um sicherzustellen, dass der Inhalt ohne nennenswerte Volumenreduzierung abgegeben wird.
    2. Ziehen Sie nach 60 s die Spritze und die 30 G Dosiernadel vorsichtig aus dem Katheter zurück.

4. Postoperative Überwachung

1. Legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen, bis der Aufrichtreflex zurückkehrt.
2. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht unbeaufsichtigt gelassen wird, bis es wieder ausreichend bei Bewusstsein ist.
3. Geben Sie das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Die Wirksamkeit submuköser Injektionen wurde zunächst durch die Verabreichung von Trypanblau beurteilt. Nach der Injektion wurde die Verteilung des Farbstoffs in der submukösen Schicht deutlich sichtbar gemacht, was die präzise und kontrollierte Abgabe der injizierten Substanzen bestätigt (Abbildung 1).

Die Tumorentwicklung wurde akribisch verfolgt. Etwa 14 Tage nach der Implantation wurde eine bemerkenswerte Inzidenz von Hämaturie beobachtet, ein kritisches Symptom, das auf eine Blasenneoplasie hinweist. Es wurde festgestellt, dass die Tumoren fest in der submukösen Schicht der Blase verankert sind. Das frühe Wachstumsmuster dieser Tumoren war durch eine expansive, nicht-invasive Expansion gekennzeichnet, die mit der Klassifikation von NMIBC übereinstimmt. Die histologische Untersuchung bestätigte das Fehlen einer Muskelinvasion, wobei die Tumoren auf die submuköse Schicht beschränkt waren und damit den Kriterien für NMIBC entsprachen (Abbildung 2).

Makroskopische Beobachtungen bestätigten den Prozess der Tumorbildung zusätzlich. Die Tumoren waren visuell unterscheidbar und zeigten ein papilläres Wachstum mit unterschiedlichen Größen und Formen (Abbildung 3). Zudem wuchsen die Tumore relativ langsam, so dass ausreichend Zeit für die Forschung im Experiment blieb (Abbildung 4).

In dieser Studie verwendeten wir zur Überprüfung der Tumorlokalisation und des Fehlens von Harnröhrenaussaat MB49-luc-Zellen für die Implantation, gefolgt von einer Bildgebung bei Kleintieren. Abbildung 5 zeigt die In-vivo-Biolumineszenzbilder , die 35 Tage nach der Injektion von Tumorzellen aufgenommen wurden, was eindeutig zeigt, dass sich der Tumor in der Blase ohne Anzeichen von Eileiteraussaat, wie z. B. in der Harnröhre, befindet.

Tumorgewebe wird in der Regel 14 Tage nach der Implantation nachweisbar. Nach unserer Erfahrung zeigen 70% oder mehr der Mäuse am 14. Tag eine Hämaturie. Das Verfahren führt in der Regel zu keiner Mortalität. Ohne Intervention wird eine Euthanasie am 60. Tag notwendig. Zu den Euthanasiekriterien gehören Lethargie, Kachexie, zerzaustes Fell, Buckeln, nicht reagierendes Verhalten oder ein Verlust von ≥20 % des anfänglichen Körpergewichts.

Abbildung 1: Wirksamkeit der submukösen Injektion mit Trypanblau. Nachweis der Wirksamkeit der submukösen Injektion mit Trypanblau. Pfeile zeigen die Injektionsstellen an, an denen auch nach drei Wäschen mit PBS noch Rest-Trypanblau sichtbar ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Histologische Bestätigung der Tumorimplantation. Histologische Bestätigung der Tumorimplantation in der Submukosa mittels H&E-Färbung. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Direkte Visualisierung von Blasentumoren. Direkte Visualisierung von Blasentumoren, wobei die offensichtliche Gefäßproliferation an der Tumorbasis hervorgehoben wird. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Tumorstatus am Tag 35 nach der Implantation. Beurteilung des Tumorstatus am Tag 35 nach der Implantation. Die Blasenwand an der Tumorbasis weist vergrößerte und desorganisierte Blutgefäße auf, begleitet von einer breit angelegten Tumorbasis. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: In vivo Biolumineszenz-Bildgebung von Blasenkrebs. In vivo Biolumineszenz-Bilder von Mäusen 35 Tage nach der Implantation mit MB49-LUC-Blasenkrebszellen. Die Bilder sind farbcodiert, um die Fluoreszenzintensität darzustellen: Rot steht für eine hohe Fluoreszenz (hohe Tumoraktivität) und Blau für eine niedrige Fluoreszenz (geringe Tumoraktivität). Im Blasenbereich wurden Regions of Interest (ROI) ausgewählt, um das tumorspezifische Biolumineszenzsignal zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass Tumore in der Blase lokalisiert sind, ohne dass es Anzeichen für eine ektopische Aussaat gibt, wie z. B. in der Harnröhre. Niedrige Signalregionen können auf gestreute Signale aus hochintensiven Bereichen zurückzuführen sein, die das Gewebe durchdringen, und weisen nicht unbedingt auf das Vorhandensein von Tumorzellen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Diagramm der intravesikalen Verabreichung von Krebszellen. Schematische Darstellung der intravesikalen Verabreichung von Krebszellen zur Konstruktion des orthotopen Modells des oberflächlichen Blasenkrebses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Konfiguration der modifizierten Dosiernadeln. Konfiguration von modifizierten Dosiernadeln innerhalb des 24 G Katheters. (A) Foto der 34-G-Abgabenadel im 24-G-Katheter. (B) Foto der 30-G-Abgabenadel im 24-G-Katheter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Forschung zu Blasenkrebs stützt sich auf Tiermodelle, die sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Forschung unverzichtbar sind. Um die Umgebung des Tumorwachstums besser nachzuahmen, bieten orthotope Blasentumormodelle im Vergleich zu subkutanen Tumormodellen einen überlegenen Ansatz¹¹.

Derzeit können orthotope Blasenkrebsmodelle auf der Grundlage von experimentellen Zwecken in zwei Haupttypen eingeteilt werden: solche, die immundefiziente Mäuse verwenden, wie z. B. patientenabgeleitete Xenotransplantatmodelle (PDX) 1 und zelllinienabgeleitete Xenotransplantatmodelle (CDX)⁵, und solche, die immunkompetente Mäuse verwenden, wie z. B. syngene Transplantationsmodelle¹².

Das PDX-Modell beinhaltet die Implantation von patientenstammendem Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse, was eine personalisierte Beurteilung des Ansprechens des Tumors auf Chemotherapeutika ermöglicht. Das Fehlen eines intakten Immunsystems bei diesen Mäusen stellt jedoch erhebliche Einschränkungen für die Untersuchung immunbezogener Mechanismen dar. In ähnlicher Weise bietet das CDX-Modell, das humane Tumorzelllinien verwendet, hohe Tumorbildungsraten, leidet aber auch unter dem Fehlen einer immunen Mikroumgebung⁵.

Im Zusammenhang mit immunkompetenten Mäusen besteht die primäre Methode zur Konstruktion orthotoper Blasentumoren darin, murinabgeleitete MB49-Zelllinien in die Blasenwand zu injizieren, um in situ Blasentumoren zu bilden¹². Dieses Verfahren erfordert eine Laparotomie und intravesikale Injektion von Tumorzellen, was Herausforderungen wie potenzielle Leckagen von Tumorzellen und Aussaat im Nadeltrakt mit sich bringt. Folglich ist es schwierig, oberflächliche Blasentumoren zu erzeugen, was die genaue Replikation des Fortschreitens des menschlichen Blasenkrebses von nicht-muskelinvasiven zu muskelinvasiven Stadien erschwert¹³.

Um oberflächliche orthotope Blasentumoren zu etablieren, beinhalten traditionelle Modellierungstechniken in der Regel die Induktion einer Schleimhautverletzung unter Verwendung von Mitteln wie Säure-Base-Lösungen oder Elektrokauter, gefolgt von der intravesikalen Instillation von Tumorzellsuspensionen mit Retentionszeiten von 2 h oder mehr ^8,14. Diese Methoden weisen jedoch einige erhebliche Einschränkungen auf. Erstens gewährleisten sie keine Einheitlichkeit in der Anzahl und Lage der Tumorimplantate in der Blase, wodurch die Reproduzierbarkeit des Modells beeinträchtigt wird. Darüber hinaus führen diese Techniken oft zu schweren Blasenschäden, die zu hohen Sterblichkeitsraten führen. Die daraus resultierende Blasenvernarbung und die verminderte Kapazität stellen erhebliche Hindernisse für Studien zu neuartigen Therapeutika dar, die wiederholte intravesikale Instillationen erforderlich machen. Dies untergräbt nicht nur die Zuverlässigkeit der Versuchsergebnisse, sondern wirft auch ethische Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes auf.

Daher würde die Entwicklung eines Tiermodells, das oberflächlichen menschlichen Blasenkrebs genau simulieren kann, eine bessere experimentelle Plattform für das Verständnis der Tumorproliferation und -progression bieten. Ein solches Modell wäre von unschätzbarem Wert für die Erforschung neuer intravesikaler Therapeutika und die Erweiterung unseres Wissens über die Biologie von Blasenkrebs.

Diese Studie beschreibt eine in situ Implantationsmethode, bei der Tumorzellen mit einer stumpfen Dosiernadel submukösal unter Druck injiziert werden (Abbildung 6). In der Studie werden die MB49-Zelllinie und weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, um ein in situ Tumormodell zu konstruieren.

Bei der Konstruktion dieses Modells stellt die Schutzschicht auf der normalen Oberfläche der Blasenschleimhaut eine erhebliche Herausforderung für die direkte Instillation von Tumorzellen dar und verhindert oft eine effektive Tumorbildung⁸. Folglich ist es notwendig, mit einer 34 G stumpfen Nadel eine lokalisierte Verletzung an der Blasenkuppel zu induzieren, um einen geeigneten "Boden" für die Tumorzellimplantation zu schaffen.

Die in dieser Studie verwendeten 34-G- und 30-G-Dosiernadeln wurden teilweise modifiziert. Die Spitze der 34-G-Nadel wurde geklemmt, um ein leicht unregelmäßiges Ende zu erzeugen, was ihre Fähigkeit, Schleimhautschäden zu verursachen, erhöht. Die Verbindungspunkte der 34-G- und 30-G-Nadeln wurden gekürzt, um sicherzustellen, dass die freiliegenden Teile des 24-G-Katheters 0,3 mm bis 0,5 mm (Abbildung 7A) bzw. 1 mm bis 1,5 mm (Abbildung 7B) betragen.

Dieser gesamte Eingriff kann innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden, wodurch eine Laparotomie oder eine verlängerte Harnröhrenligatur für die intravesikale Instillation überflüssig wird. Dieser Ansatz hat jedoch auch Grenzen. Aufgrund der zahlreichen technischen Schritte, die mit dieser Modellierungsmethode verbunden sind - wie z. B. das Einführen des Verweilkatheters durch die Harnröhre in die Blase und das Drehen der 34 G stumpfen Nadel, um den entsprechenden Grad der Schleimhautverletzung zu erreichen, ohne die Blasenwand zu perforieren - müssen die Experimentatoren üben, um die Erfolgsrate der Tumorimplantation zu erhöhen. Darüber hinaus kann es bei einer Schleimhautverletzung oder der Injektion von Tumorzellen zu einer Blasenperforation oder Tumorimplantation in die Muskelschicht kommen, wenn übermäßige Kraft angewendet wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden bietet, darunter eine verkürzte Verfahrenszeit, eine geringere Mortalität und eine verbesserte Konsistenz bei der Lokalisierung und dem Wachstum des Tumors, ohne dass invasive Verfahren oder eine verlängerte intravesikale Retention erforderlich sind. Diese Vorteile machen es zu einem wertvollen Instrument für präklinische Studien, die darauf abzielen, neue Therapeutika gegen Blasenkrebs zu bewerten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
34 G Dosiernadel	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G Dosiernadel	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypanblau	Sigma-Aldrich LLC	302643