Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Die Proteinglykosylierung ist eine weit verbreitete und komplexe Art der co- und posttranslationalen Modifikation von Proteinen, die von Spezies im gesamten phylogenetischen Stammbaum des Lebens produziert werden ^1,2,3. Es ist bekannt, dass die proteingebundenen Glykane eine breite Palette biologischer Prozesse beeinflussen, die für die menschliche Gesundheit wichtig sind, einschließlich der Vermittlung und Regulation zellulärer Interaktionen und Kommunikationsereignisse ^4,5. Es wird angenommen, dass die aberrante Proteinglykosylierung eine Ursache für die maligne Transformation, das Fortschreiten des Tumors und die Ausbreitung ist ^6,7,8. Dies impliziert die Beteiligung von Glykanen an wichtigen tumorigenen Prozessen in der Tumormikroumgebung (TME) und bietet ein beträchtliches und weitgehend ungenutztes Potenzial für die Entdeckung von Glykan-basierten Biomarkern und therapeutischen Anwendungen. Die Glykobiologie erhält daher in der Krebsforschung und in den Lebenswissenschaften zunehmend Aufmerksamkeit⁹.

Angetrieben durch wichtige Entwicklungen in der Glykoanalytik und Informatik in den letzten zehn Jahren 10,11,12,13,14,15,16,17 haben sich die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-getriebene Glykomik und Glykoproteomik als leistungsstarke Werkzeuge für das systemweite Profiling von freigesetzten Glykanen und intakten Glykopeptiden aus komplexen Mischungen von Glykoproteine, die direkt aus ihrer biologischen Probenherkunft extrahiert werden, wie z. B. verschiedene Arten von Krebspatientenproben (z. B. Tumorgewebe, Zellpopulationen, Körperflüssigkeiten)3,13,18,19,20.

Die Glykomik liefert Informationen über die Struktur und Menge des Glykanrepertoires (des Glykoms), das dynamisch von Zellen, Geweben und sogar ganzen Organismen produziert wird. Auf der anderen Seite liefert die Glykoproteomik quantitative Informationen über die Proteinträger und ihre Glykosylierungsstelle(n), die Belegungsraten der Glykosylierung (Makroheterogenität), die ortsspezifischen Glykanzusammensetzungen und ihr Verteilungsmuster (Mikroheterogenität) mit begrenzten Glykanstrukturinformationen (oft beschränkt auf die Glykanzusammensetzung)15,16,21. Glykomik und Glykoproteomik sind daher komplementäre Ansätze, um die biochemischen Details des Glykoproteoms^{zu untersuchen 22}.

Eine Vielzahl von methodischen Designs und Analysestrategien für die Glykomik und Glykoproteomik wurde entwickelt und in allen Laboratorien angewendet, abhängig vom interessierenden Glykoanalyten (z. B. N-/O-/C-gebunden, Glykan/Glykopeptid/Glykoprotein, markiert/unmarkiert), der Art der Probe (z. B. Zellen, Gewebe, Körperflüssigkeiten), der Menge (Nanogramm/Mikrogramm/Milligramm Proteingehalt) und dem verfügbaren Analyseinstrument^23. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Trotz der anerkannten Vorteile ihrer parallelen Anwendung werden Glykomik und Glykoproteomik aufgrund ihres hohen Bedarfs an analytischer Expertise und spezialisierter Instrumentierung nicht häufig zusammen, sondern als eigenständige Ansätze in glykobiologischen und Krebsforschungsstudien eingesetzt.

In Anbetracht dieser Technologielücke haben wir vor mehr als einem Jahrzehnt die Glykomik-gestützte Glykoproteomik-Methode eingeführt, die in der Lage ist, Glykomik- und Glykoproteomik-Daten aus komplexen biologischen Proben zu integrieren³³. Kurz gesagt, die Glykomics-gestützte (oder Glykomics-gesteuerte wie in diesem Protokoll) Glykoproteomik-Technologie profiliert die N- und/oder O-Glykane durch eine etablierte poröse graphitisierte Kohlenstoff (PGC) LC-MS/MS-Methode^34,35, die dann für die Analyse von intakten N- und/oder O-Glykopeptiddaten verwendet werden, die aus derselben Probe(n) gewonnen wurden, indem die Grenzen des Glykansuchraums³⁶ definiert werden. PGC-LC-MS/MS ist eine besonders leistungsfähige Glykomics-Methode, da sie quantitative Einblicke in das Glykom mit hoher Sensitivität und struktureller Auflösung bietet und Informationen über die Topologie (Monosaccharidsequenz und Verzweigungsmuster) und glykosidische Bindungen von Glykanen auch innerhalb komplexer Gemische liefert 35,37,38. Der Arbeitsablauf der Glykoproteomik umfasst die Peptidgenerierung, optionale Peptidmarkierung, Multiplexing und Präfraktionierung sowie die Anreicherung vor der Umkehrphasen-LC-MS/MS-Analyse, bei der idealerweise verschiedene Fragmentierungsmethoden zum Einsatz kommen, darunter stufenweise Kollisionsenergie/Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (sceHCD, für N-Glykopeptide) und Elektronentransfer/kollisionale Dissoziation mit höherer Energie (EThcD, für O-Glykopeptide) zur Identifizierung von Analyten. Für die N-Glykoproteom-Analyse kann die parallele De-N-Glykoproteomik die Analyse intakter N-Glykopeptid-Daten leiten, indem sie den Protein-/Peptid-Suchraum definiert und mehr Details zu den besetzten N-Glykosylierungsstellen und ihrer Belegungsrate liefert, während die parallele Analyse von nicht-modifizierten Peptiden alle Änderungen des Proteinspiegels zwischen den untersuchten Bedingungen aufdeckt.

Dieses Dokument bietet ein detailliertes und leicht verständliches Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode (siehe Abbildung 1 für einen Überblick über den Arbeitsablauf). Das Protokoll enthält experimentelle Details zu den Schritten der Probenvorbereitung und den LC-MS/MS-basierten Glykomics- und Glykoproteomik-Experimenten und präsentiert repräsentative Ergebnisse, die die Anwendung der Methode auf formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebeschnitte von Tumoren demonstrieren, die von Darmkrebspatienten (CRC) reseziert wurden, und ermöglicht Einblicke in die Glykobiologie der TME in einem wertvollen Probentyp, der in Krebsbiobanken auf der ganzen Welt archiviert ist. Auch die Analyse und Integration von Glykomics- und Glycoproteomik-Daten wird kurz diskutiert.

Abbildung 1: Überblick über die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode. Die Übersicht zeigt detaillierte experimentelle Schritte in den Arbeitsabläufen der Glykomik (links) und der Glykoproteomik (rechts), mit einem Überblick über die gewonnenen Informationen (fett gedruckt) und wie die beiden Ansätze durch eine verbesserte Datenanalyse und -interpretation integriert werden. Einsatz: Selbstgemachte SPE-Mikrosäulen, die für die Arbeitsabläufe (i) Glykomik und (ii-iii) Glykoproteomik verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Studie wurde von der Ethikkommission für die Humanforschung (Medizinische Wissenschaften) an der Macquarie University, Sydney, Australien, genehmigt (Protokoll 5201800073).

HINWEIS: Die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode kann auf eine Vielzahl biologischer Proben angewendet werden, die von geringer bis extremer Glykoproteinkomplexität reichen. Für markierungsfreie Glykoproteomik-Ansätze (bei denen kein Probenpooling durchgeführt wird) werden etwa 100-200 μg Gesamtprotein aus komplexen Mischungen als Ausgangsmaterial benötigt, um eine hohe Glykoproteomabdeckung nach der Anreicherung für Glykopeptide zu gewährleisten, die möglicherweise nur 1%-10% der Peptidpopulation ausmachen. Aus Platzgründen wird die anfängliche Proteinextraktion aus Zellen oder Geweben weggelassen, und die Leser werden auf andere Ressourcen verwiesen¹⁵. Die Glykomik verbraucht konservativ ~10-20 μg Protein pro Analyse für ein tiefes Glykom-Profiling, wobei der Großteil des Proteinextrakts für die Glykoproteomik übrig bleibt. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Endkonzentrationen angegeben, und die Chemikalien sollten in ultrahochwertigem Wasser gelöst werden, um wässrige Lösungen herzustellen.

1. Zubereitung von Proteinen

1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von Extrakten mit einer etablierten Methode (z. B. Bicinchoninsäure- oder Bradford-Protein-Assays). Stellen Sie die Proteinkonzentration auf 10 μg/μl in 50 mM TEAB (pH 8,5) ein.
2. Disulfidbindungen werden reduziert, indem Proben 45 Minuten lang bei 56 °C mit 10 mM DTT inkubiert werden. Alkylatfreie Thiolgruppen durch anschließende Inkubation von Proben mit 40 mM IAA im Dunkeln für 30 min bei 20-25 °C. Die Alkylierungsreaktion mit überschüssigem DTT (~40 mM) wird gestillt.
3. Teilen Sie jede Proteinprobe auf. Erlauben Sie ca. 10-20 μg Gesamtprotein für die Glykomik und 100-200 μg Gesamtprotein für den Glykoproteomik-Arbeitsablauf.
   HINWEIS: Zusätzlich zu den interessierenden Proteinproben ist ein bekanntes Modellglykoprotein (z. B. Rinderfetuin) oder eine Proteinmischung (z. B. Zelllinienlysat, Plasma) zu verwenden, um die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Verfahren zu beurteilen und die LC-MS/MS-Leistung zu überwachen.

2. N-Glykomics-Arbeitsablauf

1. Immobilisierung von Proteinen auf einer PVDF-Membran
   1. Verwenden Sie einen Einloch-Locher, um die PVDF-Membran passend für die Anzahl der zu erkennenden Proteinproben zu schneiden.
   2. Befeuchten Sie die herausgeschnittenen Membranen mit Ethanol oder Methanol und geben Sie die Membranen dann auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.
   3. Sobald die Membranen nahezu trocken sind, lagern Sie die Proteinproben in einem maximalen Volumen von 2,5 μl pro Spot ab, um die Oberfläche der abgelagerten Proteinprobe zu minimieren. Bei Bedarf werden die Proben erneut gespottet, so dass die Gesamtmenge des immobilisierten Proteins vor Ort ~10-20 μg beträgt. Lassen Sie dazu den Fleck an der Luft trocknen, bevor Sie den Fleckenvorgang wiederholen.
      HINWEIS: Während der Schmierblutung kann es erforderlich sein, die Membran erneut mit Ethanol oder Methanol zu benetzen, um zu verhindern, dass die Membranen vollständig austrocknen.
   4. Trocknen Sie die Membranen bei 20-25 °C für mindestens 3 h, am besten über Nacht, an der Luft. Vermeiden Sie jegliche Kontamination der Membranen während des Trocknens.
      HINWEIS: Als optionaler Qualitätskontrollschritt können die auf den Membranen entdeckten Proteine durch Färben mit der Lösung Direct Blue 71 wie zuvor beschrieben^{sichtbar gemacht werden 34}.
2. Freisetzung von proteingebundenen N-Glykanen
   1. Geben Sie 100 μl 1 % (w/v) PVP40 in Methanol in jede Vertiefung, die die gefleckten Membranen enthält. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Membran, auf der die Proteinprobe aufgefleckt wurde, während der gesamten Probenvorbereitung nach oben zeigt.
   2. Schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang bei 20-25 °C in der PVP40-Lösung, dann entsorgen Sie die PVP40-Lösung.
      HINWEIS: Die PVP40-Lösung blockiert die PVDF-Membranen und die Vertiefungen, um eine unspezifische Bindung von PNGase F (und allen Exoglykosidasen, die zur Erzielung kopplungsspezifischer Informationen in parallelen Experimenten verwendet werden können; siehe Diskussion unten) in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.
   3. Waschen Sie jede Vertiefung mit den blockierten Proteinflecken mit 100 μl Reinstwasser und schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Stellen Sie sicher, dass das Wasser nach jedem Waschen vollständig entsorgt wird.
   4. Geben Sie 15 μl PNGase F-Lösung (0,5 U/μl, verdünnt in Reinstwasser aus der 10 U/μl-Stammlösung) in jede Vertiefung, wobei davon ausgegangen wird, dass 15 μg Protein pro Probe abgelagert wurden.
   5. Geben Sie Wasser in die umliegenden leeren Vertiefungen, um eine Austrocknung der Probe während der nachfolgenden Inkubationsschritte zu verhindern, und verwenden Sie eine transparente Folie, um die Platte sorgfältig zu verschließen. Die Platte mindestens 8 h bei 37 °C inkubieren.
   6. Beschallen Sie die Platte 5 Minuten lang, damit sich verdunstete Tröpfchen an der Seite der Vertiefungen am Boden der Platte sammeln können.
   7. Übertragen Sie die freigesetzten N-Glykan-Proben vorsichtig in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL). Waschen Sie die Probenvertiefungen 2x mit 20 μl Reinstwasser, dosieren und aspirieren Sie mehrmals. Kombinieren Sie die verbleibende Probe aus jeder Vertiefung in die Mikrozentrifugenröhrchen mit den N-Glykan-Proben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von niedrig bindenden Röhrchen für die N-Glykomics-Probenvorbereitung, da die hydrophilen Glykane irreversibel an die beschichteten Röhrchen binden können.
   8. 10 μl 100 mM Ammoniumacetat pH 5,0 zugeben und die Proben 1 h lang bei 20-25 °C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden die aminierten N-Acetylglucosaminreste am reduzierenden Ende der freigesetzten N-Glykane hydroxyliert, so dass im folgenden Schritt eine vollständige Reduktion möglich ist. 100 mM Ammoniumacetat auf pH 5,0 einstellen, da hohe Umwandlungsraten von Glykosylamin in Hydroxyl am reduzierenden Ende der abgelösten N-Glykane vom schwachen Säuregehalt der Lösung abhängen.
   9. Trocknen Sie die N-Glykan-Proben in einem Vakuumkonzentratorsystem.
3. Reduktion von freigesetzten N-Glykanen
   1. 20 μl frisch zubereitetes 1 M NaBH₄ in 50 mM KOH zu den getrockneten N-Glykan-Proben geben und gründlich mischen.
      HINWEIS: NaBH₄ sollte am Tag der Anwendung frisch in KOH zubereitet werden.
   2. Die Deckel jedes Röhrchens werden fest verschlossen und die Proben 3 Stunden lang bei 50 °C inkubiert.
      HINWEIS: N-Glykane durchlaufen eine Reduktion, bei der die α- und β-Anomere des reduzierenden Endes in eine einzelne Alditol-Form umgewandelt werden, was zu einem einzigen chromatographischen Peak in der PGC-LC-MS/MS-Analyse führt.
   3. Nach der Inkubation drehen Sie die Probenröhrchen in einer Mikrozentrifuge, um die Flüssigkeit auf den Boden der Röhrchen zu bringen.
   4. Geben Sie 100 μl Reinstwasser zu jeder Probe. Fügen Sie 2 μl Eisessig hinzu, um die alkalischen N-Glykan-Proben zu neutralisieren. Drehen Sie die Probenröhrchen in einer Mikrozentrifuge, um die Proben an den Boden der Röhrchen zu bringen.
      HINWEIS: Eisessig neutralisiert die alkalischen Proben, was zur Bildung von Wasserstoffgas (H₂) und anschließendem Aufschäumen während der Reaktion führt.
4. Entsalzung von N-Glykanen mit PGC-C18-SPE
   1. Bereiten Sie hausgemachte PGC-C18-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C18-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf geeignete Pipettenspitzen (10 μL) übertragen.
         HINWEIS: Hier können auch handelsübliche C18-SPE-Mikrosäulen verwendet werden.
      2. Pipettieren Sie 10 μl Aufschlämmung PGC-Harz, suspendiert in 50 % (v/v) Methanol, in die C18-SPE-Mikrosäulen. Legen Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind. Drehen Sie die Röhrchen, um PGC-C18-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~0,5 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1i). Bereiten Sie für jede Probe eine PGC-C18-SPE-Mikrosäule vor.
         HINWEIS: Die Verwendung von Adaptern stellt sicher, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Rohrs aufgehängt sind.
      3. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie für 60 s, um den Durchgang der mobilen Phasen durch die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen zu erleichtern. Jede PGC-C18-SPE-Mikrosäule wird nacheinander mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA in ACN dreimal gewaschen und konditioniert, gefolgt von 50 μl 0,1 % (v/v) TFA dreimal.
         HINWEIS: Die PGC-SPE-Mikrosäulen können Stunden im Voraus zubereitet werden, müssen aber vor der Verwendung hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
   2. Geben Sie die N-Glykan-Proben in einem Ladevolumen von bis zu 40 μl auf die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen und drehen Sie sie nach jeder Zugabe 60 s lang bei 6.000 U/min (~2.000 x g). Wiederholen Sie den Ladeschritt, bis die gesamte N-Glykan-Probe auf die Mikrosäule aufgetragen wurde.
      HINWEIS: Obwohl die Durchflussfraktionen keine Glykane enthalten sollten, empfehlen wir, diese Fraktionen aufzubewahren, bis die Glykomics-Daten erfolgreich erfasst wurden, falls eine unvollständige Retention auf den PGC-C18-SPE-Mikrosäulen vorliegt.
   3. Waschen Sie die Mikrosäulen PGC-C18-SPE mit 20 μl Reinstwasser. Übertragen Sie die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um sie für die N-Glykan-Elution vorzubereiten.
   4. Eluieren Sie die N-Glykane, indem Sie 40 μl 0,1 % TFA in 50 % (beide v/v) ACN in jede PGC-C18-SPE-Mikrosäule geben und dann drehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang und kombinieren Sie das Eluat.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
   5. Trocknen Sie die entsalzten N-Glykane in einem Vakuumkonzentratorsystem.
5. PGC-LC-MS/MS-Erfassung
   1. Bereiten Sie LC-Lösungsmittel wie unten beschrieben vor.
      1. Lösungsmittel A: 100 mL 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO₃) Stammlösung in Reinstwasser herstellen. Filtrieren Sie die Stammlösung durch eine 0,2-μm-Nylonfilterscheibe mit einer Vakuumfiltrationseinheit, um Partikel zu entfernen. Bereiten Sie dann 1 l 10 mM NH₄HCO₃ Lösung (Lösungsmittel A) vor, indem Sie 100 ml 100 mM NH₄HCO₃ Stammlösung in 900 ml Reinstwasser verdünnen. Beschallung des Lösungsmittels A für 15 Minuten, um die Lösung zu entgasen. Lösungsmittel A kann 1 Woche bei 20-25 °C gelagert werden, während die 100 mM NH₄HCO₃ Stammlösung 1 Monat bei 4 °C gelagert werden kann.
      2. Lösungsmittel B: 1 l 10 mM NH₄HCO₃ in 70 % (v/v) ACN in Reinstwasser (Lösungsmittel B) herstellen, indem 100 ml 100 mM NH₄HCO_{3-Stammlösung} (siehe vorheriger Schritt 2.5.1.2) zu 700 ml ACN hinzugefügt und mit Reinstwasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l verdünnt werden. Lösungsmittel B 15 Minuten lang beschallen, um es zu entgasen. Lösungsmittel B kann 2 Wochen bei 20-25 °C gelagert werden.
   2. Die entsalzten N-Glykane in 10 μl Reinstwasser resuspendieren und gründlich mischen. Schleudern Sie die Proben 5 Minuten lang bei 14.000 x g und überführen Sie dann den Überstand vorsichtig in MS-Probenfläschchen, wobei ca. 0,5 μl zurückbleiben, um eine Übertragung von sichtbaren oder unsichtbaren Partikeln und Ablagerungen zu vermeiden, die das LC-MS/MS-System beschädigen würden.
   3. Injizieren und trennen Sie die N-Glykane auf einer PGC-LC-Kapillarsäule, die auf 50 °C erhitzt wird, unter Verwendung eines 60-minütigen linearen (oder anderweitig geeigneten) Gradienten von 0 % bis 70 % (v/v) Lösungsmittel B in Lösungsmittel A auf einem HPLC-System. Stellen Sie sicher, dass das HPLC-System an das Massenspektrometer angeschlossen ist und mit einer konstanten Flussrate von 20 μL/min arbeitet (passen Sie die Flussrate an die Geometrie der PGC-LC-Säule an).
   4. Detektieren Sie die getrennten N-Glykane mit einem Quadrupol-Massenspektrometer mit linearer Ionenfalle (oder einem anderen geeigneten MS-System mit niedriger oder hoher Auflösung), das mit einer Elektrospray-Ionenquelle installiert ist und im Modus mit negativer Ionenpolarität arbeitet.
   5. Legen Sie den MS1-Erfassungs-Scanbereich auf m/ z 150-2.000 mit einer Zoom-Scan-Spitzenbreite von m/ z 0,25 und halber Breite (FWHM) bei m/ z 200 fest. Stellen Sie die Quellenspannung auf 3,2 kV ein. Stellen Sie für MS1-Scans die automatische Verstärkungsregelung (AGC) auf 5 x 10⁴ Ionen mit einer maximalen Akkumulationszeit von 50 ms ein (oder andere geeignete Einstellungen).
      HINWEIS: Die niedrige Start-m/z umfasst die Detektion von Mono- und Disacchariden, die häufig zum N- und O-Glykom beitragen.
   6. Stellen Sie für MS/MS die Auflösung auf m/z 0,25 FWHM bei m/z 200, die AGC auf 2 x 10⁴ Ionen und die maximale Akkumulationszeit auf 300 ms ein. Aktivieren Sie die datenabhängige Erfassung (DDA) und wählen Sie die fünf am häufigsten vorkommenden Vorläufer in jedem MS1-Vollscan für die Fragmentierung unter Verwendung von Resonanzaktivierung (Ionenfalle) und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) bei einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 33 % aus. Deaktivieren Sie den dynamischen Ausschluss, um zu vermeiden, dass eng eluierende isobare N-Glykan-Isomere übersehen werden.
6. Datenanalyse von LC-MS/MS-Glykomics-Daten
   1. Durchsuchen Sie die generierten LC-MS/MS-Rohdaten mit geeigneter Software, um eine hohe Datenqualität nach Bestätigung einer schmalen LC-Peakbreite, einer effektiven N-Glykan-Isomerentrennung, einer hohen MS-Genauigkeit, Auflösung und Signal-Rausch-Beziehung sowie einer hohen CID-MS/MS-Fragmentierungseffizienz zu gewährleisten.
   2. Identifizieren Sie die N-Glykane in der Probe manuell auf der Grundlage ihrer monoisotopischen Vorläufermasse, des CID-MS/MS-Fragmentierungsmusters sowie der relativen und absoluten PGC-LC-Retentionszeit.
      HINWEIS: RawMeat v2.1, GlycoMod und GlycoWorkBench v2.1 können den Identifizierungsprozess wie beschrieben unterstützen²⁶. Bekannte biosynthetische Einschränkungen und die strukturelle Verwandtschaft zwischen den beobachteten Analyten können ebenfalls das Vertrauen in die identifizierten N-Glykane erhöhen²⁶. Alternativ kann die halbautomatische Glykanidentifikation und spektrale Annotation mit kommerzieller Software erfolgen.
   3. Für die relative N-Glykan-Quantifizierung generieren Sie eine Übergangsliste, die den monoisotopischen Vorläufer m/z aller identifizierten N-Glykan-Isomere enthält, und verwenden Sie eine kommerzielle Software, um die Area-under-the-Curve (AUC)-Werte basierend auf extrahierten Ionenchromatogrammen (EICs) aller N-Glykan-Vorläuferionen zu bestimmen, wie beschrieben²⁶.

3. Arbeitsablauf der N-Glykoproteomik

1. Verdauung des Proteingemisches
   1. 100-200 μg des reduzierten und alkylierten Proteinextrakts (aus Teil 1) werden durch Zugabe von Trypsin (1:50 Enzym:Protein-Verhältnis, w/w) und/oder anderen Proteasen nach Wahl zu jeder Probe verdaut.
      HINWEIS: Anders als bei der Glykomik-Probenvorbereitung sollten für die Glykoproteomik-Probenvorbereitungsschritte nach Möglichkeit Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Bindung verwendet werden, um eine maximale Peptidrückgewinnung zu erzielen.
   2. Die Proben werden 8-12 h bei 37 °C inkubiert. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ~8,5 beträgt, da eine mild alkalische Lösung die Effizienz des Trypsinaufschlusses verbessert.
      HINWEIS: Spezifische Proteasen, die vorhersehbare Spaltungsmuster erzeugen und die meisten N-Glykopeptide mit einer einzigen Folge (Glykosylierungsstelle) belassen, wie Trypsin und Lys-C, werden bevorzugt. Vermeiden Sie eine Überinkubation der Proben, um unspezifische Spaltungen von Proteinen durch Trypsin oder andere Proteasen zu reduzieren.
   3. Stoppen Sie die Verdauung durch Ansäuerung (um unspezifische Spaltungen zu vermeiden, die durch eine verlängerte Verdauung verursacht werden) durch Zugabe von 1% (v/v) TFA.
2. Peptid-Entsalzung mit Oligo R3-C18-SPE
   1. Bereiten Sie hausgemachte Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C18-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf 10-μl-Pipettenspitzen übertragen.
         HINWEIS: Hier können auch handelsübliche C18-SPE-Mikrosäulen verwendet werden.
      2. Eine Aufschlämmung aus Oligo R3-Harz, suspendiert in reinem ACN, in die C18-SPE-Mikrosäulen abscheiden. Platzieren Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind, um sicherzustellen, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Röhrchens aufgehängt sind, und drehen Sie sie, um Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~1 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1ii). Bereiten Sie eine Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule für jede Probe vor.
   2. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie sie 60 s lang, damit die mobilen Phasen durch die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen gelangen können. Waschen und konditionieren Sie jede Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule nacheinander mit 50 μl reinem ACN, 3x, und dann 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, 3x.
      HINWEIS: Die Mikrosäulen des Oligo R3-C18-SPE können im Voraus vorbereitet und vor der Verwendung stundenlang hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
   3. Setzen Sie die konditionierten Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen zusammen mit Mikrozentrifugenadaptern in neue 1,5-ml-Röhrchen ein. Tragen Sie die tryptisch verdauten Peptidmischungen auf die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen auf und drehen Sie sie 60 s lang bei 2.000 x g . Bei Probenvolumina von mehr als 50 μl können mehrere Laderunden erforderlich sein.
   4. Waschen Sie die Oligo R3-C18-SPE Mikrosäulen mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, 3x. Übertragen Sie die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen in neue 1,5-ml-Röhrchen, um die Elution der entsalzten Peptide vorzubereiten.
   5. Eluieren Sie die entsalzten Peptide durch Auftragen von 50 μl 0,1 % TFA in 50 % (beide v/v) ACN, gefolgt von 50 μl 0,1 % TFA in 70 % (beide v/v) ACN auf jede Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule. Drehen Sie sich nach jedem Schritt.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
   6. Sammeln, kombinieren und trocknen Sie die entsalzten Peptide in einem Vakuumkonzentratorsystem.
      HINWEIS: Wenn Sie parallele Proteomik und De-N-Glykoproteomik durchführen (siehe Diskussion), teilen Sie die entsalzten Peptidproben und legen Sie separate Fraktionen vor dem Trocknen beiseite.
3. Anreicherung von N-Glykopeptid mit ZIC-HILIC-C8-SPE
   1. Bereiten Sie hausgemachte ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C8-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf 10-μl-Pipettenspitzen übertragen.
      2. Eine Aufschlämmung aus in Methanol suspendiertem ZIC-HILIC-Harz wird in die C8-SPE-Mikrosäulen gegeben. Platzieren Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind, um sicherzustellen, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Röhrchens aufgehängt sind, und drehen Sie sie, um ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~1 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1iii). Bereiten Sie für jede Probe eine ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule vor.
   2. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie für 60 s, damit die mobilen Phasen durch die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen gelangen können. Jede ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule wird nacheinander mit 50 μl Methanol, 3x und dann 50 μl Reinstwasser, 3x und schließlich 50 μl 1 % TFA in 80 % (beide v/v) ACN, 3x gewaschen und konditioniert.
      HINWEIS: Die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen können Stunden im Voraus zubereitet werden, müssen aber vor der Verwendung hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
   3. Die getrockneten Peptidmischungen, die für die N-Glykopeptid-Anreicherung bestimmt sind, in 50 μl 1 % TFA in 80 % ACN (beide v/v) ACN resuspendieren und gründlich mischen.
      HINWEIS: Wenn sich Peptide nur schwer im HILIC-Ladelösungsmittel auflösen lassen, können die Peptide zunächst in 10 % (v/v) TFA wieder gelöst und dann schnell in ACN verdünnt werden, um die Konzentrationen des HILIC-Ladelösungsmittels zu erreichen. Vermeiden Sie es, die Probe in hoher TFA-Konzentration zu erhitzen, um eine Hydrolyse zu vermeiden.
   4. Setzen Sie die konditionierten ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen zusammen mit Mikrozentrifugenadaptern in neue 1,5-ml-Röhrchen ein. Tragen Sie die resuspendierten Peptidmischungen auf die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen auf und drehen Sie sie 60 s lang bei 2.000 x g . Bei Probenvolumina von mehr als 50 μl können mehrere Laderunden erforderlich sein.
   5. Sammeln Sie die Durchflussfraktion(en) und tragen Sie die Fraktion(en) erneut auf dieselbe ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule auf. Wiederholen Sie die erneute Anwendung 2x und bewahren Sie die Durchflussschläuche auf.
   6. Waschen Sie die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen 2x mit 50 μL 1 % TFA in 80 % (beide v/v) ACN, schleudern Sie diesen Durchfluss und kombinieren Sie diesen Durchfluss mit dem Durchfluss aus Schritt 3.3.4.
      HINWEIS: Die kombinierte Durchflussfraktion enthält typischerweise ~90% des gesamten Peptidmaterials und bildet effektiv die nicht modifizierte Peptidfraktion, die daher für eine separate Downstream-Analyse verwendet werden kann (anstatt ein separates Proteomik-Experiment durchzuführen).
   7. Übertragen Sie die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen auf neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Eluieren Sie die zurückgehaltenen N-Glykopeptide nacheinander mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, gefolgt von 50 μl 25 mM Ammoniumbicarbonat und dann 50 μl 50 % (v/v) ACN. Nach jedem Schritt 60 s lang mit 2.000 x g drehen.
      HINWEIS: Das Eluat enthält in der Regel ~10% des gesamten Peptidmaterials, von denen die meisten N-Glykopeptide sein sollten, wenn eine hohe Anreicherungseffizienz erreicht wird. Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
   8. Sammeln, kombinieren und trocknen Sie die angereicherten N-Glykopeptide und (falls erforderlich) das nicht modifizierte Peptid durch die Fraktionen in einem Vakuumkonzentratorsystem.
4. Umkehrphasen-LC-MS/MS von intakten N-Glykopeptiden
   1. Bereiten Sie LC-Lösungsmittel wie unten beschrieben vor.
      1. Lösungsmittel A: 1 l 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Reinstwasser zubereiten. 15 Minuten lang beschallen, um das Lösungsmittel zu entgasen. Lösungsmittel A kann einen Monat lang bei 20-25 °C gelagert werden.
      2. Lösungsmittel B: Bereiten Sie 1 l 0,1%ige Ameisensäure in 99,9% (beide v/v) ACN vor. 15 Minuten lang beschallen, um zu entgasen. Lösungsmittel B kann einen Monat lang bei 20-25 °C gelagert werden.
   2. Die getrockneten Peptidfraktionen in 0,1 % (v/v) Ameisensäure auf eine Konzentration von ca. 0,2-0,5 μg Peptid/μl resuspendieren und gründlich mischen. Schleudern Sie die Proben 5 Minuten lang bei 14.000 x g und überführen Sie dann den Überstand vorsichtig in MS-Probenfläschchen, wobei ca. 0,5 μl zurückbleiben, um eine Übertragung unerwünschter Partikel und Ablagerungen zu vermeiden.
   3. Für jede Probe injizieren Sie ~0,5-1 μg Gesamtpeptid auf eine C18-LC-Fallensäule und trennen Sie die Peptide auf einer C18-LC-Analysesäule bei einer konstanten Flussrate von 250 nL/min unter Verwendung eines UPHLC-Systems, das mit dem Massenspektrometer mit einem Gradienten von 2 % bis 30 % Lösungsmittel B über 100 min, 30 % bis 50 % B über 18 min verbunden ist. 50%-95% B über 1 min und 9 min bei 95% (alle v/v) B in Lösungsmittel A (oder einem anderweitig geeigneten Setup).
   4. Detektieren Sie die Peptide mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, das mit dem nanoLC-System gekoppelt ist, das mit einer Nano-Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet ist und im Modus mit positiver Ionenpolarität arbeitet.
   5. Verwenden Sie für MS1 einen Erfassungsscanbereich von m/z 350 bis 1.800, eine hohe Auflösung von 60.000 bis 120.000 FWHM bei m/ z 200 und eine Quellenspannung von ~2,5 kV. Stellen Sie die AGC auf 3 x 10⁶ Ionen mit einer maximalen Akkumulationszeit von 50 ms ein (oder anderweitig geeignete Einstellungen).
   6. Wählen Sie für MS/MS die 20 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen aus jedem MS1-Vollscan für die Fragmentierung im DDA-Modus aus, wobei HCD-MS/MS mit einem festen NCE von 35 % oder sceHCD mit einem NCE von 25 %, 35 % und 45 % verwendet wird. Wichtig ist, dass Sie den unteren m/z-Wert auf 110 festlegen (z. B. Scanbereich m/z 110 - 1.800), um alle Oxonium-Ionen mit geringer Masse in jedem Fragmentspektrum zu beobachten.
   7. Wählen Sie für die Fragmentierung Vorläufer aus, die mehr als 2 Aufladungen (Z ≥ 2) enthalten. Erfassen von (sce)HCD-MS/MS-Spektren mit einer Auflösung von 30.000 bis 45.000 FWHM bei m/ z 200 mit einer AGC von 1 x 10⁵ Ionen und einer Akkumulationszeit von 90 ms unter Verwendung eines Vorläuferisolationsfensters von ± 1,0 Th. Aktivieren Sie den dynamischen Ausschluss von 30 s nach der einfachen Isolierung und Fragmentierung eines bestimmten Vorläuferions.
      HINWEIS: Wenn ETD verfügbar ist, sollten Sie auch die Entnahme von EThcD-MS/MS von intakten N-Glykopeptid-Proben mittels produktabhängiger Ionenauslösung in Betracht ziehen. Dieser Schritt ist durchzuführen, wenn diagnostische Glykanoxoniumionen (z. B. m/z 138.0545, 204.0867 und 366.1396) zu den obersten 20 Fragmentionen innerhalb jedes HCD-MS/MS-Spektrums³⁹ gehören. Detektion der EThcD-MS/MS-Fragmente bei einer Auflösung von 30.000-45.000 FWHM bei m/ z 200 mit einer AGC von 4 x 10⁵ Ionen, einer Injektionszeit von 250 ms, HCD NCE von 15 % und einer Vorläuferisolationsbreite von 1,6 Th.
5. Datenanalyse von LC-MS/MS-Glykoproteomik-Daten
   1. Bestätigung der Anreicherung von LC-MS/MS-Rohdaten mit N-Glykopeptiden, indem überprüft wird, ob die meisten HCD-MS/MS-Spektren Glykanoxonium-Ionen enthalten (z. B. m/z 138.0545, 204.0867 und 366.1396) und (für Markierungsstrategien) eine Basislinientrennung der TMT-Reporterionen mit geringer Masse, eine hohe Fragmentierungseffizienz in den MS/MS-Spektren und eine schmale LC-Peakbreite sowie eine hohe MS-Genauigkeit aufweisen. Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis.
   2. Durchsuchen Sie mit Hilfe einer Suchmaschine (es sind mehrere verfügbar; siehe unten) die MS/MS-Daten nach intakten N-Glykopeptiden im Vergleich zu einer geeigneten Protein-/Peptiddatenbank, die auf die zu untersuchende Probe abzielt (z. B. aus einem de-N-Glykoproteomik-Experiment) oder anhand aller überprüften humanen UniProtKB-Proteine. Passen Sie die Suche gegen die Peptid-N-Glykosylierung an, indem Sie nach Peptiden mit sequon-lokalisiertem Asn suchen. Wichtig ist, dass Sie eine Glykomics-informierte N-Glykan-Datenbank auswählen, d. h. Glykane, die in Schritt 2 aus Glykomics-Daten identifiziert wurden, um den Suchraum auf Glykane zu beschränken, von denen bekannt ist, dass sie in der/den Probe(n) vorhanden sind.
      HINWEIS: Parallele Suchen unter Verwendung einer breiten vordefinierten N-Glykan-Datenbank können in Betracht gezogen werden, um das Vorhandensein zusätzlicher N-Glykan-Zusammensetzungen in den Daten auszuschließen.
   3. Passen Sie die verbleibenden Suchvariablen an die zu untersuchende Stichprobe, die durchgeführten spezifischen Probenhandhabungsverfahren sowie die verwendeten MS-Einstellungen und verwendeten Instrumente an. Zu den gängigen Sucheinstellungen für die N-Glykoproteomik-Datensuche gehören:
      Toleranz der Ausgangsstoff- und Produktmasse: 10 ppm und 20 ppm
      Proteasespezifität: Vollständig spezifisch und/oder semispezifisch (N-ragged)
      Erlaubte verpasste Dekolletés: 2
      Behobene Modifikationen: Cys carbamidomethylierung (+57.021 Da)
      Variable Modifikationen: Met-Oxidation (+15,994 Da) (häufig 1)
      Zulässige variable Modifikationen pro Peptid: 1 oder 2
      Glykanmodifikationen: Glykomics-informierte Glykandatenbank (selten 1)
      Datenbank für Proteinköder und Kontaminanten: Aktiviert
   4. Filtern Sie alle Suchanfragen nach <1 % False Discovery Rate (FDR) auf Protein- und Peptidebene. Betrachten Sie nur N-Glykopeptide, die mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert wurden (z. B. PEP-2D-Scores < 0,001), und führen Sie eine manuelle Annotation/Kuration der gefilterten Ausgabe durch, um die Rate der falschen N-Glykopeptid-Identifizierung weiter zu reduzieren, wie 36,40,41 beschrieben.
      HINWEIS: Glykopeptide mit sialylierten und multifucosylierten N-Glykanen und Glykopeptide, die neben Glykanen auch andere variable Modifikationen tragen (d. h. Met-Oxidation und Asn/Gln-Deamidierung), sind besonders anfällig für Fehlinterpretationen durch die Suchmaschinen⁴¹. Besonderes Augenmerk sollte auf die Validierung solcher Kandidaten gelegt werden, bevor eine Meldung erfolgt.

In diesem Abschnitt finden Sie repräsentative Ergebnisse der Glykomics-gesteuerten Glykoproteomik-Methode, die auf einen FFPE-Gewebeträger eines an Darmkrebs erkrankten Patienten im Stadium II angewendet wurde.

Um ein ausreichendes Proteinausgangsmaterial für das Protokoll zu erhalten, wurden Proteinextrakte aus zwei Objektträgern (z-Stacks) aus demselben FFPE-Gewebeblock nach einem veröffentlichten Protokoll kombiniert und ein TMT-Markierungsansatz angewendet, um die Sensitivität des Glykoproteomik-Experiments zu erhöhen (siehe optionale Schritte unten)42.

Zunächst wurden bei der Analyse der PGC-LC-MS/MS-basierten N-Glykomics-Daten der FFPE-CRC-Gewebe insgesamt 76 N-Glykan-Isomere identifiziert, die sich über 59 Glykanzusammensetzungen erstrecken (Abbildung 2). In Übereinstimmung mit einer früheren N-Glycome-Profiling-Studie von Darmkrebsgeweben43 bildeten die komplexen/hybriden N-Glykane den am häufigsten vorkommenden Typ (~70%), gefolgt von den oligomannossidischen (~20%) und paucimannossidischen (~10%) N-Glykanen.

Abbildung 2: Überblick über die N-Glykan-Strukturen und ihre relative Verteilung. Die Strukturen wurden anhand quantitativer Glykomik-Daten eines FFPE-Gewebeschnitts von einem Darmkrebspatienten im Stadium II identifiziert. *Diese Kategorie umfasst nicht-konventionelle oligomannoseähnliche N-Glykanstrukturen, die neben den regulären oligomannosidischen N-Glykanen (Man5-9GlcNAc2) aus der FFPE-Gewebesektion identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wichtig ist, dass alle N-Glykanstrukturen mit robusten PGC-LC-, MS1- und MS/MS-Spektralnachweisen identifiziert und ihre relativen Häufigkeiten anhand von Area-under-the-Curve (AUC)-Werten von extrahierten Ionenchromatogrammen der Glykan-Vorläuferionen quantifiziert wurden (Beispiel in Abbildung 3).

Abbildung 3: Glykanidentifikation aus GLYKOMISCHEN LC-MS/MS-Rohdaten. Die Glykane wurden manuell aus den LC-MS/MS-Glykomics-Daten identifiziert, indem die beobachtete und erwartete (theoretische) 1) Molekülmasse, 2) MS/MS-Fragmentierungsmuster, die in silico erzeugt wurden, und 3) die relative und absolute PGC-LC-Retentionszeit26 abgeglichen wurden. Die Glykan-MS/MS-Spektren wurden mit einem kommerziellen Softwarepaket annotiert. Ein Beispiel wird für einen komplexen Typ N-Glykan gezeigt. Die strukturspezifischen D-Ionen und die frühe PGC-LC-Elution bestätigen die halbierende GlcNAc-Eigenschaft des Isomers a mit einer Elutionszeit von 17.55 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Obwohl die PGC-LC-MS/MS-basierte Glykomik quantitative und feine strukturelle Details der einzelnen Glykane im Glykom liefert, liefert die Technik keine Informationen über die Proteinträger und ihre ortsspezifische Glykosylierung. Die Glykoproteomik ist daher nützlich, um die Erkenntnisse aus den Glykomics-Experimenten zu bestätigen und zu erweitern.

Unter Verwendung der Glykomics-informierten Suchstrategie, bei der ein Suchraum nur die 59 N-Glykan-Zusammensetzungen umfasste, die aus den Glykomics-Daten beobachtet wurden (und einige zusätzliche Zusammensetzungen, die der Vollständigkeit halber manuell hinzugefügt wurden), wurden 1.475 Glykopeptid-zu-Spektrum-Übereinstimmungen (GlykoPSMs) sicher aus den Glykoproteomik-Daten der gleichen FFPE-CRC-Gewebeschnitte identifiziert. Insgesamt wurden 574 nicht-redundante (einzigartige) N-Glykopeptide nachgewiesen, die sich über 189 N-Glykosylierungsstellen erstrecken und aus 111 verschiedenen N-Glykoproteinen stammen. Die Glykopeptid-Identifizierung wurde mit Hilfe einer (Glyko-)Protein-Identifizierungssoftware unter Verwendung strenger Konfidenzschwellen durchgeführt, wie beschrieben40,42. Proteine in FFPE-Gewebeschnitten können aufgrund der chemischen Verfahren, die bei der Erstellung von FFPE-Gewebeschnitten und der Extraktion ihrer Proteine beteiligt sind, ein gewisses Maß an Modifikationen erfahren, wie zuvor diskutiert44. Selbst wenn solche FFPE-spezifischen Modifikationen im Datenanalyseschritt nicht berücksichtigt werden, kann jedoch immer noch eine umfassende Glykopeptid-Profilerstellung erreicht werden, wenn etablierte Probenhandhabungsprotokolle befolgt werden 42,45,46. Die 20 am häufigsten vorkommenden N-Glykoproteine, die in den N-Glykoproteomik-Daten identifiziert wurden, sind zusammen mit ihren GlykoPSM-Zahlen in Tabelle 1 aufgeführt. Während die GlykoPSM-Zählung (Spektralzählung) ein einfacher Ansatz ist, um Glykopeptideigenschaften zwischen Bedingungen quantitativ zu vergleichen, hat dieser Ansatz Grenzen, wenn niedrige spektrale Zählungen an einzelnen Glykosylierungsstellen beobachtet werden. Vergleichende Glykoproteomik-Ansätze, die eine AUC-basierte Quantifizierung der Glykopeptid-Vorläuferionen verwenden, können daher für eine detaillierte ortsspezifische Quantifizierung zuverlässiger sein47.

Tabelle 1: Die am häufigsten vorkommenden N-Glykoproteine, die in den N-Glykoproteomik-Daten eines FFPE-Gewebeschnitts eines Darmkrebspatienten im Stadium II identifiziert wurden. Die GesamtglykoPSM-Zahlen werden für jedes Protein angegeben.

In Übereinstimmung mit unseren vorangegangenen Arbeiten zum SFB43,48 ergab die genontologische Annotation der Glykoproteine, die aus den FFPE-Gewebeschnitten identifiziert wurden, dass die Glykoproteine erwartungsgemäß an tumorigenen und angeborenen Immunprozessen beteiligt sind, die bekannte Merkmale des SFB TME sind. Insbesondere wurde festgestellt, dass extrazelluläre Matrix-Rezeptor-Wechselwirkungen und eine negative Regulation der Verarbeitung und Präsentation von dendritischen Zellantigenen die am stärksten angereicherten biologischen Prozesse sind, die mit den identifizierten Glykoproteinen assoziiert sind (Tabelle 2). Das gesamte humane Proteom wurde als Hintergrund für die identifizierten Glykoproteine ausgewählt, um eine unvoreingenommene Analyse der Signalweganreicherung zu gewährleisten. Das Hintergrundproteom (Glyko)Proteom sollte auf der Grundlage der Forschungsfrage49 ausgewählt werden.

Tabelle 2. Liste der biologischen Prozesse, die mit den Glykoproteinen angereichert sind, die aus dem FFPE-Gewebeschnitt des Darmkrebspatienten im Stadium II identifiziert wurden. Die GO-Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung der Genontologie-Ressource mit dem GO-Datensatz für biologische Prozesse als Referenzdurchgeführt 48. Als Hintergrund für die identifizierten Glykoproteine wurde das gesamte humane Proteom ausgewählt.

Zusammenfassend dokumentieren die repräsentativen Ergebnisse, dass die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode detaillierte Informationen über das Glykoproteom liefert und dass die Methode sensitiv genug ist, um mit den geringen Proteinmengen umzugehen, die aus FFPE-Gewebeschnitten gewonnen werden können. Angesichts der Tatsache, dass FFPE-Gewebe in großer Zahl in Krebsbiobanken auf der ganzen Welt archiviert werden, eröffnet die Methodenkompatibilität neue Wege für ein umfassendes Glykoproteom-Profiling der TME aus großen Patientenkohorten und über ein breites Spektrum von Krebsarten hinweg.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.