Methodenartikel

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

DOI:

10.3791/67405

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7. Februar 2025

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1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Glykosylierung ist eine häufige und strukturell vielfältige Proteinmodifikation, die eine Vielzahl von tumorigenen Prozessen beeinflusst. Die massenspektrometrische Glykomik und die Glykoproteomik haben sich als leistungsfähige Ansätze zur Analyse freigesetzter Glykane bzw. intakter Glykopeptide erwiesen und bieten ein tieferes Verständnis des heterogenen Glykoproteoms in der Tumormikroumgebung (TME). Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die zunächst poröse graphitisierte Kohlenstoff-LC-MS/MS-basierte Glykomik verwendet, um die Glykanstrukturen und ihre quantitative Verteilung im Glykom von Tumorgeweben, Zellpopulationen oder Körperflüssigkeiten aufzuklären, die untersucht werden. Dies ermöglicht eine vergleichende Glykosylanalyse, um eine veränderte Glykosylierung über Patientengruppen, Krankheitsstadien oder Zustände hinweg zu identifizieren, und dient vor allem dazu, die nachgelagerte Glykoproteomik-Analyse derselben Probe(n) zu verbessern, indem eine Bibliothek bekannter Glykanstrukturen erstellt wird, wodurch die Datensuchzeit und die Rate der Glykoprotein-Fehlidentifizierung reduziert werden. Mit dem Schwerpunkt auf der Erstellung von N-Glykoproteom-Profilen werden in diesem Protokoll die Probenvorbereitungsschritte für die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode detailliert beschrieben und Schlüsselaspekte der Datenerfassung und -analyse diskutiert. Die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode liefert quantitative Informationen über die im TME vorhandenen Glykoproteine und ihre Glykosylierungsstellen, die Belegung der Stelle und die ortsspezifischen Glykanstrukturen. Repräsentative Ergebnisse aus formalinfixierten, paraffineingebetteten Tumorgeweben von Darmkrebspatienten zeigen, dass die Methode sensitiv und kompatibel mit Gewebeschnitten ist, die üblicherweise in Biobanken zu finden sind. Die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik bietet daher einen umfassenden Einblick in die Heterogenität und Dynamik des Glykoproteoms in komplexen TMEs und generiert robuste biochemische Daten, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Einleitung

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Die Proteinglykosylierung ist eine weit verbreitete und komplexe Art der co- und posttranslationalen Modifikation von Proteinen, die von Spezies im gesamten phylogenetischen Stammbaum des Lebens produziert werden 1,2,3. Es ist bekannt, dass die proteingebundenen Glykane eine breite Palette biologischer Prozesse beeinflussen, die für die menschliche Gesundheit wichtig sind, einschließlich der Vermittlung und Regulation zellulärer Interaktionen und Kommunikationsereignisse 4,5. Es wird angenommen, dass die aberrante Proteinglykosylierung eine Ursache für die maligne Transformation, das Fortschreiten des Tumors und die Ausbreitung ist 6,7,8. Dies impliziert die Beteiligung von Glykanen an wichtigen tumorigenen Prozessen in der Tumormikroumgebung (TME) und bietet ein beträchtliches und weitgehend ungenutztes Potenzial für die Entdeckung von Glykan-basierten Biomarkern und therapeutischen Anwendungen. Die Glykobiologie erhält daher in der Krebsforschung und in den Lebenswissenschaften zunehmend Aufmerksamkeit9.

Angetrieben durch wichtige Entwicklungen in der Glykoanalytik und Informatik in den letzten zehn Jahren 10,11,12,13,14,15,16,17 haben sich die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-getriebene Glykomik und Glykoproteomik als leistungsstarke Werkzeuge für das systemweite Profiling von freigesetzten Glykanen und intakten Glykopeptiden aus komplexen Mischungen von Glykoproteine, die direkt aus ihrer biologischen Probenherkunft extrahiert werden, wie z. B. verschiedene Arten von Krebspatientenproben (z. B. Tumorgewebe, Zellpopulationen, Körperflüssigkeiten)3,13,18,19,20.

Die Glykomik liefert Informationen über die Struktur und Menge des Glykanrepertoires (des Glykoms), das dynamisch von Zellen, Geweben und sogar ganzen Organismen produziert wird. Auf der anderen Seite liefert die Glykoproteomik quantitative Informationen über die Proteinträger und ihre Glykosylierungsstelle(n), die Belegungsraten der Glykosylierung (Makroheterogenität), die ortsspezifischen Glykanzusammensetzungen und ihr Verteilungsmuster (Mikroheterogenität) mit begrenzten Glykanstrukturinformationen (oft beschränkt auf die Glykanzusammensetzung)15,16,21. Glykomik und Glykoproteomik sind daher komplementäre Ansätze, um die biochemischen Details des Glykoproteomszu untersuchen 22.

Eine Vielzahl von methodischen Designs und Analysestrategien für die Glykomik und Glykoproteomik wurde entwickelt und in allen Laboratorien angewendet, abhängig vom interessierenden Glykoanalyten (z. B. N-/O-/C-gebunden, Glykan/Glykopeptid/Glykoprotein, markiert/unmarkiert), der Art der Probe (z. B. Zellen, Gewebe, Körperflüssigkeiten), der Menge (Nanogramm/Mikrogramm/Milligramm Proteingehalt) und dem verfügbaren Analyseinstrument23. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Trotz der anerkannten Vorteile ihrer parallelen Anwendung werden Glykomik und Glykoproteomik aufgrund ihres hohen Bedarfs an analytischer Expertise und spezialisierter Instrumentierung nicht häufig zusammen, sondern als eigenständige Ansätze in glykobiologischen und Krebsforschungsstudien eingesetzt.

In Anbetracht dieser Technologielücke haben wir vor mehr als einem Jahrzehnt die Glykomik-gestützte Glykoproteomik-Methode eingeführt, die in der Lage ist, Glykomik- und Glykoproteomik-Daten aus komplexen biologischen Proben zu integrieren33. Kurz gesagt, die Glykomics-gestützte (oder Glykomics-gesteuerte wie in diesem Protokoll) Glykoproteomik-Technologie profiliert die N- und/oder O-Glykane durch eine etablierte poröse graphitisierte Kohlenstoff (PGC) LC-MS/MS-Methode34,35, die dann für die Analyse von intakten N- und/oder O-Glykopeptiddaten verwendet werden, die aus derselben Probe(n) gewonnen wurden, indem die Grenzen des Glykansuchraums36 definiert werden. PGC-LC-MS/MS ist eine besonders leistungsfähige Glykomics-Methode, da sie quantitative Einblicke in das Glykom mit hoher Sensitivität und struktureller Auflösung bietet und Informationen über die Topologie (Monosaccharidsequenz und Verzweigungsmuster) und glykosidische Bindungen von Glykanen auch innerhalb komplexer Gemische liefert 35,37,38. Der Arbeitsablauf der Glykoproteomik umfasst die Peptidgenerierung, optionale Peptidmarkierung, Multiplexing und Präfraktionierung sowie die Anreicherung vor der Umkehrphasen-LC-MS/MS-Analyse, bei der idealerweise verschiedene Fragmentierungsmethoden zum Einsatz kommen, darunter stufenweise Kollisionsenergie/Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (sceHCD, für N-Glykopeptide) und Elektronentransfer/kollisionale Dissoziation mit höherer Energie (EThcD, für O-Glykopeptide) zur Identifizierung von Analyten. Für die N-Glykoproteom-Analyse kann die parallele De-N-Glykoproteomik die Analyse intakter N-Glykopeptid-Daten leiten, indem sie den Protein-/Peptid-Suchraum definiert und mehr Details zu den besetzten N-Glykosylierungsstellen und ihrer Belegungsrate liefert, während die parallele Analyse von nicht-modifizierten Peptiden alle Änderungen des Proteinspiegels zwischen den untersuchten Bedingungen aufdeckt.

Dieses Dokument bietet ein detailliertes und leicht verständliches Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode (siehe Abbildung 1 für einen Überblick über den Arbeitsablauf). Das Protokoll enthält experimentelle Details zu den Schritten der Probenvorbereitung und den LC-MS/MS-basierten Glykomics- und Glykoproteomik-Experimenten und präsentiert repräsentative Ergebnisse, die die Anwendung der Methode auf formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebeschnitte von Tumoren demonstrieren, die von Darmkrebspatienten (CRC) reseziert wurden, und ermöglicht Einblicke in die Glykobiologie der TME in einem wertvollen Probentyp, der in Krebsbiobanken auf der ganzen Welt archiviert ist. Auch die Analyse und Integration von Glykomics- und Glycoproteomik-Daten wird kurz diskutiert.

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Abbildung 1: Überblick über die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode. Die Übersicht zeigt detaillierte experimentelle Schritte in den Arbeitsabläufen der Glykomik (links) und der Glykoproteomik (rechts), mit einem Überblick über die gewonnenen Informationen (fett gedruckt) und wie die beiden Ansätze durch eine verbesserte Datenanalyse und -interpretation integriert werden. Einsatz: Selbstgemachte SPE-Mikrosäulen, die für die Arbeitsabläufe (i) Glykomik und (ii-iii) Glykoproteomik verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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Die Studie wurde von der Ethikkommission für die Humanforschung (Medizinische Wissenschaften) an der Macquarie University, Sydney, Australien, genehmigt (Protokoll 5201800073).

HINWEIS: Die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode kann auf eine Vielzahl biologischer Proben angewendet werden, die von geringer bis extremer Glykoproteinkomplexität reichen. Für markierungsfreie Glykoproteomik-Ansätze (bei denen kein Probenpooling durchgeführt wird) werden etwa 100-200 μg Gesamtprotein aus komplexen Mischungen als Ausgangsmaterial benötigt, um eine hohe Glykoproteomabdeckung nach der Anreicherung für Glykopeptide zu gewährleisten, die möglicherweise nur 1%-10% der Peptidpopulation ausmachen. Aus Platzgründen wird die anfängliche Proteinextraktion aus Zellen oder Geweben weggelassen, und die Leser werden auf andere Ressourcen verwiesen15. Die Glykomik verbraucht konservativ ~10-20 μg Protein pro Analyse für ein tiefes Glykom-Profiling, wobei der Großteil des Proteinextrakts für die Glykoproteomik übrig bleibt. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Endkonzentrationen angegeben, und die Chemikalien sollten in ultrahochwertigem Wasser gelöst werden, um wässrige Lösungen herzustellen.

1. Zubereitung von Proteinen

  1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von Extrakten mit einer etablierten Methode (z. B. Bicinchoninsäure- oder Bradford-Protein-Assays). Stellen Sie die Proteinkonzentration auf 10 μg/μl in 50 mM TEAB (pH 8,5) ein.
  2. Disulfidbindungen werden reduziert, indem Proben 45 Minuten lang bei 56 °C mit 10 mM DTT inkubiert werden. Alkylatfreie Thiolgruppen durch anschließende Inkubation von Proben mit 40 mM IAA im Dunkeln für 30 min bei 20-25 °C. Die Alkylierungsreaktion mit überschüssigem DTT (~40 mM) wird gestillt.
  3. Teilen Sie jede Proteinprobe auf. Erlauben Sie ca. 10-20 μg Gesamtprotein für die Glykomik und 100-200 μg Gesamtprotein für den Glykoproteomik-Arbeitsablauf.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den interessierenden Proteinproben ist ein bekanntes Modellglykoprotein (z. B. Rinderfetuin) oder eine Proteinmischung (z. B. Zelllinienlysat, Plasma) zu verwenden, um die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Verfahren zu beurteilen und die LC-MS/MS-Leistung zu überwachen.

2. N-Glykomics-Arbeitsablauf

  1. Immobilisierung von Proteinen auf einer PVDF-Membran
    1. Verwenden Sie einen Einloch-Locher, um die PVDF-Membran passend für die Anzahl der zu erkennenden Proteinproben zu schneiden.
    2. Befeuchten Sie die herausgeschnittenen Membranen mit Ethanol oder Methanol und geben Sie die Membranen dann auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.
    3. Sobald die Membranen nahezu trocken sind, lagern Sie die Proteinproben in einem maximalen Volumen von 2,5 μl pro Spot ab, um die Oberfläche der abgelagerten Proteinprobe zu minimieren. Bei Bedarf werden die Proben erneut gespottet, so dass die Gesamtmenge des immobilisierten Proteins vor Ort ~10-20 μg beträgt. Lassen Sie dazu den Fleck an der Luft trocknen, bevor Sie den Fleckenvorgang wiederholen.
      HINWEIS: Während der Schmierblutung kann es erforderlich sein, die Membran erneut mit Ethanol oder Methanol zu benetzen, um zu verhindern, dass die Membranen vollständig austrocknen.
    4. Trocknen Sie die Membranen bei 20-25 °C für mindestens 3 h, am besten über Nacht, an der Luft. Vermeiden Sie jegliche Kontamination der Membranen während des Trocknens.
      HINWEIS: Als optionaler Qualitätskontrollschritt können die auf den Membranen entdeckten Proteine durch Färben mit der Lösung Direct Blue 71 wie zuvor beschriebensichtbar gemacht werden 34.
  2. Freisetzung von proteingebundenen N-Glykanen
    1. Geben Sie 100 μl 1 % (w/v) PVP40 in Methanol in jede Vertiefung, die die gefleckten Membranen enthält. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Membran, auf der die Proteinprobe aufgefleckt wurde, während der gesamten Probenvorbereitung nach oben zeigt.
    2. Schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang bei 20-25 °C in der PVP40-Lösung, dann entsorgen Sie die PVP40-Lösung.
      HINWEIS: Die PVP40-Lösung blockiert die PVDF-Membranen und die Vertiefungen, um eine unspezifische Bindung von PNGase F (und allen Exoglykosidasen, die zur Erzielung kopplungsspezifischer Informationen in parallelen Experimenten verwendet werden können; siehe Diskussion unten) in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.
    3. Waschen Sie jede Vertiefung mit den blockierten Proteinflecken mit 100 μl Reinstwasser und schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Stellen Sie sicher, dass das Wasser nach jedem Waschen vollständig entsorgt wird.
    4. Geben Sie 15 μl PNGase F-Lösung (0,5 U/μl, verdünnt in Reinstwasser aus der 10 U/μl-Stammlösung) in jede Vertiefung, wobei davon ausgegangen wird, dass 15 μg Protein pro Probe abgelagert wurden.
    5. Geben Sie Wasser in die umliegenden leeren Vertiefungen, um eine Austrocknung der Probe während der nachfolgenden Inkubationsschritte zu verhindern, und verwenden Sie eine transparente Folie, um die Platte sorgfältig zu verschließen. Die Platte mindestens 8 h bei 37 °C inkubieren.
    6. Beschallen Sie die Platte 5 Minuten lang, damit sich verdunstete Tröpfchen an der Seite der Vertiefungen am Boden der Platte sammeln können.
    7. Übertragen Sie die freigesetzten N-Glykan-Proben vorsichtig in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL). Waschen Sie die Probenvertiefungen 2x mit 20 μl Reinstwasser, dosieren und aspirieren Sie mehrmals. Kombinieren Sie die verbleibende Probe aus jeder Vertiefung in die Mikrozentrifugenröhrchen mit den N-Glykan-Proben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von niedrig bindenden Röhrchen für die N-Glykomics-Probenvorbereitung, da die hydrophilen Glykane irreversibel an die beschichteten Röhrchen binden können.
    8. 10 μl 100 mM Ammoniumacetat pH 5,0 zugeben und die Proben 1 h lang bei 20-25 °C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden die aminierten N-Acetylglucosaminreste am reduzierenden Ende der freigesetzten N-Glykane hydroxyliert, so dass im folgenden Schritt eine vollständige Reduktion möglich ist. 100 mM Ammoniumacetat auf pH 5,0 einstellen, da hohe Umwandlungsraten von Glykosylamin in Hydroxyl am reduzierenden Ende der abgelösten N-Glykane vom schwachen Säuregehalt der Lösung abhängen.
    9. Trocknen Sie die N-Glykan-Proben in einem Vakuumkonzentratorsystem.
  3. Reduktion von freigesetzten N-Glykanen
    1. 20 μl frisch zubereitetes 1 M NaBH4 in 50 mM KOH zu den getrockneten N-Glykan-Proben geben und gründlich mischen.
      HINWEIS: NaBH4 sollte am Tag der Anwendung frisch in KOH zubereitet werden.
    2. Die Deckel jedes Röhrchens werden fest verschlossen und die Proben 3 Stunden lang bei 50 °C inkubiert.
      HINWEIS: N-Glykane durchlaufen eine Reduktion, bei der die α- und β-Anomere des reduzierenden Endes in eine einzelne Alditol-Form umgewandelt werden, was zu einem einzigen chromatographischen Peak in der PGC-LC-MS/MS-Analyse führt.
    3. Nach der Inkubation drehen Sie die Probenröhrchen in einer Mikrozentrifuge, um die Flüssigkeit auf den Boden der Röhrchen zu bringen.
    4. Geben Sie 100 μl Reinstwasser zu jeder Probe. Fügen Sie 2 μl Eisessig hinzu, um die alkalischen N-Glykan-Proben zu neutralisieren. Drehen Sie die Probenröhrchen in einer Mikrozentrifuge, um die Proben an den Boden der Röhrchen zu bringen.
      HINWEIS: Eisessig neutralisiert die alkalischen Proben, was zur Bildung von Wasserstoffgas (H2) und anschließendem Aufschäumen während der Reaktion führt.
  4. Entsalzung von N-Glykanen mit PGC-C18-SPE
    1. Bereiten Sie hausgemachte PGC-C18-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C18-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf geeignete Pipettenspitzen (10 μL) übertragen.
        HINWEIS: Hier können auch handelsübliche C18-SPE-Mikrosäulen verwendet werden.
      2. Pipettieren Sie 10 μl Aufschlämmung PGC-Harz, suspendiert in 50 % (v/v) Methanol, in die C18-SPE-Mikrosäulen. Legen Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind. Drehen Sie die Röhrchen, um PGC-C18-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~0,5 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1i). Bereiten Sie für jede Probe eine PGC-C18-SPE-Mikrosäule vor.
        HINWEIS: Die Verwendung von Adaptern stellt sicher, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Rohrs aufgehängt sind.
      3. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie für 60 s, um den Durchgang der mobilen Phasen durch die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen zu erleichtern. Jede PGC-C18-SPE-Mikrosäule wird nacheinander mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA in ACN dreimal gewaschen und konditioniert, gefolgt von 50 μl 0,1 % (v/v) TFA dreimal.
        HINWEIS: Die PGC-SPE-Mikrosäulen können Stunden im Voraus zubereitet werden, müssen aber vor der Verwendung hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
    2. Geben Sie die N-Glykan-Proben in einem Ladevolumen von bis zu 40 μl auf die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen und drehen Sie sie nach jeder Zugabe 60 s lang bei 6.000 U/min (~2.000 x g). Wiederholen Sie den Ladeschritt, bis die gesamte N-Glykan-Probe auf die Mikrosäule aufgetragen wurde.
      HINWEIS: Obwohl die Durchflussfraktionen keine Glykane enthalten sollten, empfehlen wir, diese Fraktionen aufzubewahren, bis die Glykomics-Daten erfolgreich erfasst wurden, falls eine unvollständige Retention auf den PGC-C18-SPE-Mikrosäulen vorliegt.
    3. Waschen Sie die Mikrosäulen PGC-C18-SPE mit 20 μl Reinstwasser. Übertragen Sie die PGC-C18-SPE-Mikrosäulen in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um sie für die N-Glykan-Elution vorzubereiten.
    4. Eluieren Sie die N-Glykane, indem Sie 40 μl 0,1 % TFA in 50 % (beide v/v) ACN in jede PGC-C18-SPE-Mikrosäule geben und dann drehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang und kombinieren Sie das Eluat.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
    5. Trocknen Sie die entsalzten N-Glykane in einem Vakuumkonzentratorsystem.
  5. PGC-LC-MS/MS-Erfassung
    1. Bereiten Sie LC-Lösungsmittel wie unten beschrieben vor.
      1. Lösungsmittel A: 100 mL 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) Stammlösung in Reinstwasser herstellen. Filtrieren Sie die Stammlösung durch eine 0,2-μm-Nylonfilterscheibe mit einer Vakuumfiltrationseinheit, um Partikel zu entfernen. Bereiten Sie dann 1 l 10 mM NH4HCO3 Lösung (Lösungsmittel A) vor, indem Sie 100 ml 100 mM NH4HCO3 Stammlösung in 900 ml Reinstwasser verdünnen. Beschallung des Lösungsmittels A für 15 Minuten, um die Lösung zu entgasen. Lösungsmittel A kann 1 Woche bei 20-25 °C gelagert werden, während die 100 mM NH4HCO3 Stammlösung 1 Monat bei 4 °C gelagert werden kann.
      2. Lösungsmittel B: 1 l 10 mM NH4HCO3 in 70 % (v/v) ACN in Reinstwasser (Lösungsmittel B) herstellen, indem 100 ml 100 mM NH4HCO3-Stammlösung (siehe vorheriger Schritt 2.5.1.2) zu 700 ml ACN hinzugefügt und mit Reinstwasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l verdünnt werden. Lösungsmittel B 15 Minuten lang beschallen, um es zu entgasen. Lösungsmittel B kann 2 Wochen bei 20-25 °C gelagert werden.
    2. Die entsalzten N-Glykane in 10 μl Reinstwasser resuspendieren und gründlich mischen. Schleudern Sie die Proben 5 Minuten lang bei 14.000 x g und überführen Sie dann den Überstand vorsichtig in MS-Probenfläschchen, wobei ca. 0,5 μl zurückbleiben, um eine Übertragung von sichtbaren oder unsichtbaren Partikeln und Ablagerungen zu vermeiden, die das LC-MS/MS-System beschädigen würden.
    3. Injizieren und trennen Sie die N-Glykane auf einer PGC-LC-Kapillarsäule, die auf 50 °C erhitzt wird, unter Verwendung eines 60-minütigen linearen (oder anderweitig geeigneten) Gradienten von 0 % bis 70 % (v/v) Lösungsmittel B in Lösungsmittel A auf einem HPLC-System. Stellen Sie sicher, dass das HPLC-System an das Massenspektrometer angeschlossen ist und mit einer konstanten Flussrate von 20 μL/min arbeitet (passen Sie die Flussrate an die Geometrie der PGC-LC-Säule an).
    4. Detektieren Sie die getrennten N-Glykane mit einem Quadrupol-Massenspektrometer mit linearer Ionenfalle (oder einem anderen geeigneten MS-System mit niedriger oder hoher Auflösung), das mit einer Elektrospray-Ionenquelle installiert ist und im Modus mit negativer Ionenpolarität arbeitet.
    5. Legen Sie den MS1-Erfassungs-Scanbereich auf m/ z 150-2.000 mit einer Zoom-Scan-Spitzenbreite von m/ z 0,25 und halber Breite (FWHM) bei m/ z 200 fest. Stellen Sie die Quellenspannung auf 3,2 kV ein. Stellen Sie für MS1-Scans die automatische Verstärkungsregelung (AGC) auf 5 x 104 Ionen mit einer maximalen Akkumulationszeit von 50 ms ein (oder andere geeignete Einstellungen).
      HINWEIS: Die niedrige Start-m/z umfasst die Detektion von Mono- und Disacchariden, die häufig zum N- und O-Glykom beitragen.
    6. Stellen Sie für MS/MS die Auflösung auf m/z 0,25 FWHM bei m/z 200, die AGC auf 2 x 104 Ionen und die maximale Akkumulationszeit auf 300 ms ein. Aktivieren Sie die datenabhängige Erfassung (DDA) und wählen Sie die fünf am häufigsten vorkommenden Vorläufer in jedem MS1-Vollscan für die Fragmentierung unter Verwendung von Resonanzaktivierung (Ionenfalle) und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) bei einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 33 % aus. Deaktivieren Sie den dynamischen Ausschluss, um zu vermeiden, dass eng eluierende isobare N-Glykan-Isomere übersehen werden.
  6. Datenanalyse von LC-MS/MS-Glykomics-Daten
    1. Durchsuchen Sie die generierten LC-MS/MS-Rohdaten mit geeigneter Software, um eine hohe Datenqualität nach Bestätigung einer schmalen LC-Peakbreite, einer effektiven N-Glykan-Isomerentrennung, einer hohen MS-Genauigkeit, Auflösung und Signal-Rausch-Beziehung sowie einer hohen CID-MS/MS-Fragmentierungseffizienz zu gewährleisten.
    2. Identifizieren Sie die N-Glykane in der Probe manuell auf der Grundlage ihrer monoisotopischen Vorläufermasse, des CID-MS/MS-Fragmentierungsmusters sowie der relativen und absoluten PGC-LC-Retentionszeit.
      HINWEIS: RawMeat v2.1, GlycoMod und GlycoWorkBench v2.1 können den Identifizierungsprozess wie beschrieben unterstützen26. Bekannte biosynthetische Einschränkungen und die strukturelle Verwandtschaft zwischen den beobachteten Analyten können ebenfalls das Vertrauen in die identifizierten N-Glykane erhöhen26. Alternativ kann die halbautomatische Glykanidentifikation und spektrale Annotation mit kommerzieller Software erfolgen.
    3. Für die relative N-Glykan-Quantifizierung generieren Sie eine Übergangsliste, die den monoisotopischen Vorläufer m/z aller identifizierten N-Glykan-Isomere enthält, und verwenden Sie eine kommerzielle Software, um die Area-under-the-Curve (AUC)-Werte basierend auf extrahierten Ionenchromatogrammen (EICs) aller N-Glykan-Vorläuferionen zu bestimmen, wie beschrieben26.

3. Arbeitsablauf der N-Glykoproteomik

  1. Verdauung des Proteingemisches
    1. 100-200 μg des reduzierten und alkylierten Proteinextrakts (aus Teil 1) werden durch Zugabe von Trypsin (1:50 Enzym:Protein-Verhältnis, w/w) und/oder anderen Proteasen nach Wahl zu jeder Probe verdaut.
      HINWEIS: Anders als bei der Glykomik-Probenvorbereitung sollten für die Glykoproteomik-Probenvorbereitungsschritte nach Möglichkeit Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Bindung verwendet werden, um eine maximale Peptidrückgewinnung zu erzielen.
    2. Die Proben werden 8-12 h bei 37 °C inkubiert. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ~8,5 beträgt, da eine mild alkalische Lösung die Effizienz des Trypsinaufschlusses verbessert.
      HINWEIS: Spezifische Proteasen, die vorhersehbare Spaltungsmuster erzeugen und die meisten N-Glykopeptide mit einer einzigen Folge (Glykosylierungsstelle) belassen, wie Trypsin und Lys-C, werden bevorzugt. Vermeiden Sie eine Überinkubation der Proben, um unspezifische Spaltungen von Proteinen durch Trypsin oder andere Proteasen zu reduzieren.
    3. Stoppen Sie die Verdauung durch Ansäuerung (um unspezifische Spaltungen zu vermeiden, die durch eine verlängerte Verdauung verursacht werden) durch Zugabe von 1% (v/v) TFA.
  2. Peptid-Entsalzung mit Oligo R3-C18-SPE
    1. Bereiten Sie hausgemachte Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C18-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf 10-μl-Pipettenspitzen übertragen.
        HINWEIS: Hier können auch handelsübliche C18-SPE-Mikrosäulen verwendet werden.
      2. Eine Aufschlämmung aus Oligo R3-Harz, suspendiert in reinem ACN, in die C18-SPE-Mikrosäulen abscheiden. Platzieren Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind, um sicherzustellen, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Röhrchens aufgehängt sind, und drehen Sie sie, um Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~1 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1ii). Bereiten Sie eine Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule für jede Probe vor.
    2. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie sie 60 s lang, damit die mobilen Phasen durch die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen gelangen können. Waschen und konditionieren Sie jede Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule nacheinander mit 50 μl reinem ACN, 3x, und dann 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, 3x.
      HINWEIS: Die Mikrosäulen des Oligo R3-C18-SPE können im Voraus vorbereitet und vor der Verwendung stundenlang hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
    3. Setzen Sie die konditionierten Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen zusammen mit Mikrozentrifugenadaptern in neue 1,5-ml-Röhrchen ein. Tragen Sie die tryptisch verdauten Peptidmischungen auf die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen auf und drehen Sie sie 60 s lang bei 2.000 x g . Bei Probenvolumina von mehr als 50 μl können mehrere Laderunden erforderlich sein.
    4. Waschen Sie die Oligo R3-C18-SPE Mikrosäulen mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, 3x. Übertragen Sie die Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäulen in neue 1,5-ml-Röhrchen, um die Elution der entsalzten Peptide vorzubereiten.
    5. Eluieren Sie die entsalzten Peptide durch Auftragen von 50 μl 0,1 % TFA in 50 % (beide v/v) ACN, gefolgt von 50 μl 0,1 % TFA in 70 % (beide v/v) ACN auf jede Oligo R3-C18-SPE-Mikrosäule. Drehen Sie sich nach jedem Schritt.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
    6. Sammeln, kombinieren und trocknen Sie die entsalzten Peptide in einem Vakuumkonzentratorsystem.
      HINWEIS: Wenn Sie parallele Proteomik und De-N-Glykoproteomik durchführen (siehe Diskussion), teilen Sie die entsalzten Peptidproben und legen Sie separate Fraktionen vor dem Trocknen beiseite.
  3. Anreicherung von N-Glykopeptid mit ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Bereiten Sie hausgemachte ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen wie unten beschrieben vor.
      1. C8-Scheiben mit einer geeigneten Spritze verstopfen und auf 10-μl-Pipettenspitzen übertragen.
      2. Eine Aufschlämmung aus in Methanol suspendiertem ZIC-HILIC-Harz wird in die C8-SPE-Mikrosäulen gegeben. Platzieren Sie die Mikrosäulen in 2-ml-Röhrchen, die mit Mikrozentrifugenadaptern ausgestattet sind, um sicherzustellen, dass die Mikrosäulen in der Mitte des Röhrchens aufgehängt sind, und drehen Sie sie, um ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen mit einer Säulenhöhe von ~1 cm zu erzeugen (siehe Abbildung 1iii). Bereiten Sie für jede Probe eine ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule vor.
    2. Für die nachfolgenden Wasch- und Probenladeschritte stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 6.000 U/min (~2.000 x g) ein und schleudern Sie für 60 s, damit die mobilen Phasen durch die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen gelangen können. Jede ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule wird nacheinander mit 50 μl Methanol, 3x und dann 50 μl Reinstwasser, 3x und schließlich 50 μl 1 % TFA in 80 % (beide v/v) ACN, 3x gewaschen und konditioniert.
      HINWEIS: Die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen können Stunden im Voraus zubereitet werden, müssen aber vor der Verwendung hydratisiert bei Raumtemperatur gelagert werden.
    3. Die getrockneten Peptidmischungen, die für die N-Glykopeptid-Anreicherung bestimmt sind, in 50 μl 1 % TFA in 80 % ACN (beide v/v) ACN resuspendieren und gründlich mischen.
      HINWEIS: Wenn sich Peptide nur schwer im HILIC-Ladelösungsmittel auflösen lassen, können die Peptide zunächst in 10 % (v/v) TFA wieder gelöst und dann schnell in ACN verdünnt werden, um die Konzentrationen des HILIC-Ladelösungsmittels zu erreichen. Vermeiden Sie es, die Probe in hoher TFA-Konzentration zu erhitzen, um eine Hydrolyse zu vermeiden.
    4. Setzen Sie die konditionierten ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen zusammen mit Mikrozentrifugenadaptern in neue 1,5-ml-Röhrchen ein. Tragen Sie die resuspendierten Peptidmischungen auf die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen auf und drehen Sie sie 60 s lang bei 2.000 x g . Bei Probenvolumina von mehr als 50 μl können mehrere Laderunden erforderlich sein.
    5. Sammeln Sie die Durchflussfraktion(en) und tragen Sie die Fraktion(en) erneut auf dieselbe ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule auf. Wiederholen Sie die erneute Anwendung 2x und bewahren Sie die Durchflussschläuche auf.
    6. Waschen Sie die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen 2x mit 50 μL 1 % TFA in 80 % (beide v/v) ACN, schleudern Sie diesen Durchfluss und kombinieren Sie diesen Durchfluss mit dem Durchfluss aus Schritt 3.3.4.
      HINWEIS: Die kombinierte Durchflussfraktion enthält typischerweise ~90% des gesamten Peptidmaterials und bildet effektiv die nicht modifizierte Peptidfraktion, die daher für eine separate Downstream-Analyse verwendet werden kann (anstatt ein separates Proteomik-Experiment durchzuführen).
    7. Übertragen Sie die ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen auf neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Eluieren Sie die zurückgehaltenen N-Glykopeptide nacheinander mit 50 μl 0,1 % (v/v) TFA, gefolgt von 50 μl 25 mM Ammoniumbicarbonat und dann 50 μl 50 % (v/v) ACN. Nach jedem Schritt 60 s lang mit 2.000 x g drehen.
      HINWEIS: Das Eluat enthält in der Regel ~10% des gesamten Peptidmaterials, von denen die meisten N-Glykopeptide sein sollten, wenn eine hohe Anreicherungseffizienz erreicht wird. Es ist wichtig, die Mikrosäulen nach jedem Spin zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig durchlaufen wurde, da dies eine effiziente Elution ermöglicht.
    8. Sammeln, kombinieren und trocknen Sie die angereicherten N-Glykopeptide und (falls erforderlich) das nicht modifizierte Peptid durch die Fraktionen in einem Vakuumkonzentratorsystem.
  4. Umkehrphasen-LC-MS/MS von intakten N-Glykopeptiden
    1. Bereiten Sie LC-Lösungsmittel wie unten beschrieben vor.
      1. Lösungsmittel A: 1 l 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Reinstwasser zubereiten. 15 Minuten lang beschallen, um das Lösungsmittel zu entgasen. Lösungsmittel A kann einen Monat lang bei 20-25 °C gelagert werden.
      2. Lösungsmittel B: Bereiten Sie 1 l 0,1%ige Ameisensäure in 99,9% (beide v/v) ACN vor. 15 Minuten lang beschallen, um zu entgasen. Lösungsmittel B kann einen Monat lang bei 20-25 °C gelagert werden.
    2. Die getrockneten Peptidfraktionen in 0,1 % (v/v) Ameisensäure auf eine Konzentration von ca. 0,2-0,5 μg Peptid/μl resuspendieren und gründlich mischen. Schleudern Sie die Proben 5 Minuten lang bei 14.000 x g und überführen Sie dann den Überstand vorsichtig in MS-Probenfläschchen, wobei ca. 0,5 μl zurückbleiben, um eine Übertragung unerwünschter Partikel und Ablagerungen zu vermeiden.
    3. Für jede Probe injizieren Sie ~0,5-1 μg Gesamtpeptid auf eine C18-LC-Fallensäule und trennen Sie die Peptide auf einer C18-LC-Analysesäule bei einer konstanten Flussrate von 250 nL/min unter Verwendung eines UPHLC-Systems, das mit dem Massenspektrometer mit einem Gradienten von 2 % bis 30 % Lösungsmittel B über 100 min, 30 % bis 50 % B über 18 min verbunden ist. 50%-95% B über 1 min und 9 min bei 95% (alle v/v) B in Lösungsmittel A (oder einem anderweitig geeigneten Setup).
    4. Detektieren Sie die Peptide mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, das mit dem nanoLC-System gekoppelt ist, das mit einer Nano-Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet ist und im Modus mit positiver Ionenpolarität arbeitet.
    5. Verwenden Sie für MS1 einen Erfassungsscanbereich von m/z 350 bis 1.800, eine hohe Auflösung von 60.000 bis 120.000 FWHM bei m/ z 200 und eine Quellenspannung von ~2,5 kV. Stellen Sie die AGC auf 3 x 106 Ionen mit einer maximalen Akkumulationszeit von 50 ms ein (oder anderweitig geeignete Einstellungen).
    6. Wählen Sie für MS/MS die 20 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen aus jedem MS1-Vollscan für die Fragmentierung im DDA-Modus aus, wobei HCD-MS/MS mit einem festen NCE von 35 % oder sceHCD mit einem NCE von 25 %, 35 % und 45 % verwendet wird. Wichtig ist, dass Sie den unteren m/z-Wert auf 110 festlegen (z. B. Scanbereich m/z 110 - 1.800), um alle Oxonium-Ionen mit geringer Masse in jedem Fragmentspektrum zu beobachten.
    7. Wählen Sie für die Fragmentierung Vorläufer aus, die mehr als 2 Aufladungen (Z ≥ 2) enthalten. Erfassen von (sce)HCD-MS/MS-Spektren mit einer Auflösung von 30.000 bis 45.000 FWHM bei m/ z 200 mit einer AGC von 1 x 105 Ionen und einer Akkumulationszeit von 90 ms unter Verwendung eines Vorläuferisolationsfensters von ± 1,0 Th. Aktivieren Sie den dynamischen Ausschluss von 30 s nach der einfachen Isolierung und Fragmentierung eines bestimmten Vorläuferions.
      HINWEIS: Wenn ETD verfügbar ist, sollten Sie auch die Entnahme von EThcD-MS/MS von intakten N-Glykopeptid-Proben mittels produktabhängiger Ionenauslösung in Betracht ziehen. Dieser Schritt ist durchzuführen, wenn diagnostische Glykanoxoniumionen (z. B. m/z 138.0545, 204.0867 und 366.1396) zu den obersten 20 Fragmentionen innerhalb jedes HCD-MS/MS-Spektrums39 gehören. Detektion der EThcD-MS/MS-Fragmente bei einer Auflösung von 30.000-45.000 FWHM bei m/ z 200 mit einer AGC von 4 x 105 Ionen, einer Injektionszeit von 250 ms, HCD NCE von 15 % und einer Vorläuferisolationsbreite von 1,6 Th.
  5. Datenanalyse von LC-MS/MS-Glykoproteomik-Daten
    1. Bestätigung der Anreicherung von LC-MS/MS-Rohdaten mit N-Glykopeptiden, indem überprüft wird, ob die meisten HCD-MS/MS-Spektren Glykanoxonium-Ionen enthalten (z. B. m/z 138.0545, 204.0867 und 366.1396) und (für Markierungsstrategien) eine Basislinientrennung der TMT-Reporterionen mit geringer Masse, eine hohe Fragmentierungseffizienz in den MS/MS-Spektren und eine schmale LC-Peakbreite sowie eine hohe MS-Genauigkeit aufweisen. Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis.
    2. Durchsuchen Sie mit Hilfe einer Suchmaschine (es sind mehrere verfügbar; siehe unten) die MS/MS-Daten nach intakten N-Glykopeptiden im Vergleich zu einer geeigneten Protein-/Peptiddatenbank, die auf die zu untersuchende Probe abzielt (z. B. aus einem de-N-Glykoproteomik-Experiment) oder anhand aller überprüften humanen UniProtKB-Proteine. Passen Sie die Suche gegen die Peptid-N-Glykosylierung an, indem Sie nach Peptiden mit sequon-lokalisiertem Asn suchen. Wichtig ist, dass Sie eine Glykomics-informierte N-Glykan-Datenbank auswählen, d. h. Glykane, die in Schritt 2 aus Glykomics-Daten identifiziert wurden, um den Suchraum auf Glykane zu beschränken, von denen bekannt ist, dass sie in der/den Probe(n) vorhanden sind.
      HINWEIS: Parallele Suchen unter Verwendung einer breiten vordefinierten N-Glykan-Datenbank können in Betracht gezogen werden, um das Vorhandensein zusätzlicher N-Glykan-Zusammensetzungen in den Daten auszuschließen.
    3. Passen Sie die verbleibenden Suchvariablen an die zu untersuchende Stichprobe, die durchgeführten spezifischen Probenhandhabungsverfahren sowie die verwendeten MS-Einstellungen und verwendeten Instrumente an. Zu den gängigen Sucheinstellungen für die N-Glykoproteomik-Datensuche gehören:
      Toleranz der Ausgangsstoff- und Produktmasse: 10 ppm und 20 ppm
      Proteasespezifität: Vollständig spezifisch und/oder semispezifisch (N-ragged)
      Erlaubte verpasste Dekolletés: 2
      Behobene Modifikationen: Cys carbamidomethylierung (+57.021 Da)
      Variable Modifikationen: Met-Oxidation (+15,994 Da) (häufig 1)
      Zulässige variable Modifikationen pro Peptid: 1 oder 2
      Glykanmodifikationen: Glykomics-informierte Glykandatenbank (selten 1)
      Datenbank für Proteinköder und Kontaminanten: Aktiviert
    4. Filtern Sie alle Suchanfragen nach <1 % False Discovery Rate (FDR) auf Protein- und Peptidebene. Betrachten Sie nur N-Glykopeptide, die mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert wurden (z. B. PEP-2D-Scores < 0,001), und führen Sie eine manuelle Annotation/Kuration der gefilterten Ausgabe durch, um die Rate der falschen N-Glykopeptid-Identifizierung weiter zu reduzieren, wie 36,40,41 beschrieben.
      HINWEIS: Glykopeptide mit sialylierten und multifucosylierten N-Glykanen und Glykopeptide, die neben Glykanen auch andere variable Modifikationen tragen (d. h. Met-Oxidation und Asn/Gln-Deamidierung), sind besonders anfällig für Fehlinterpretationen durch die Suchmaschinen41. Besonderes Augenmerk sollte auf die Validierung solcher Kandidaten gelegt werden, bevor eine Meldung erfolgt.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Abschnitt finden Sie repräsentative Ergebnisse der Glykomics-gesteuerten Glykoproteomik-Methode, die auf einen FFPE-Gewebeträger eines an Darmkrebs erkrankten Patienten im Stadium II angewendet wurde.

Um ein ausreichendes Proteinausgangsmaterial für das Protokoll zu erhalten, wurden Proteinextrakte aus zwei Objektträgern (z-Stacks) aus demselben FFPE-Gewebeblock nach einem veröffentlichten Protokoll kombiniert und ein TMT-Markierungsansatz angewendet, um die Sensitivität des Glykopro...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte im Protokoll
In diesem Protokollpapier haben wir Schritt für Schritt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode skizziert, die einen umfassenden Überblick über die Heterogenität und Dynamik des Glykoproteoms in der komplexen TME bietet.

Ein kritischer Schritt im Protokoll besteht darin, eine vollständige Proteolyse zu gewährleisten, ohne die Proteinmischung zu überverdauen. Unspezifische Spaltungen von Proteinen verg...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC wird durch ein Stipendium des International Research Training Program unterstützt, das von der australischen Regierung finanziert wird. NB wird durch International Macquarie University Research Excellence Scholarships unterstützt, die von der Macquarie University finanziert werden. AC wird durch ein Stipendium des Research Training Program unterstützt, das von der australischen Regierung finanziert wird. RK wurde vom Cancer Institute of New South Wales (ECF181259) unterstützt. MTA ist Preisträgerin eines Future Fellowship (FT210100455 des Australian Research Council.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemikalien
Ammoniumacetat Sigma AldrichA1542Alternativen verfügbar
Ammoniumbicarbonat, Reinheit ≥ 99,0%Sigma AldrichA6141Alternativen verfügbar
Wasserfreies Acetonitril (ACN), LC-MS QualitätSigma Aldrich34851Alternativen verfügbar
RinderfetuinSigma AldrichF3004Alternativen verfügbar
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternativen verfügbar
Ethanol SigmaAldrichE7023Verfügbare Alternativen
Ameisensäure, LC-MS-QualitätSigma Aldrich00940Verfügbare Alternativen
EisessigSigma AldrichA6283Verfügbare Alternativen
Iodacetamid (IAA)Sigma AldrichI1149Verfügbare Alternativen
MethanolSigma AldrichM1775Verfügbare Alternativen
Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) rekombinant exprimiert in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidon 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternativen verfügbar
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma Aldrich484016Alternativen verfügbar
Schweinetrypsin in SequenzierqualitätPromegaV5113Verfügbare Alternativen
Natriumborhydrid (NaBH4)Sigma Aldrich213462Verfügbare Alternativen
Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), LC-MS KlasseSigma AldrichT7408Alternative verfügbar
Trifluoressigsäure (TFA), LC-MS KlasseSigma AldrichT6508Alternativen verfügbar
Werkzeuge/Materialien
C18 FestplattenEmpore66883-U
C8 FestplattenEmpore66882-U 96-Well-Platte
aus Polypropylen mit flachem Boden  Corning3364
Immobilon-PSQ Polyvinylidendifluorid (PVDF)-MembranMilliporeIPVH20200Porengröße: 0,45 μ M 
MikrozentrifugeEppendorf5452000069Alternativen verfügbar
Mikrozentrifugen-Adapter The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Säulenkragen, wird mit Microspin Säulen
Oligo R3 HarzThermo1133903Partikelgröße 30 μ m
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind Röhrchen 1,5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind Röhrchen 2,0mL Eppendorf0030108442
Safe-Lock Röhrchen 1,5 mLEppendorf0030120086
Safe-Lock Röhrchen 2,0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternativen verfügbar
EinlochlocherSwingline74005
SpeedVac KonzentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternativen verfügbar
Supelclean ENVI-Carb SPE HarzSupelco57088Partikelgröße 120-400 mesh. Das Harz kann manuell aus den Kartuschen extrahiert werden und kann langfristig in 50 % (v/v) Methanol in MilliQ Wasser gelagert werden
Spritze 5 mLSigma AldrichZ116866Verfügbare Alternativen Temperierter
InkubatorThermolineE7.30Verfügbare Alternativen Ultraschallbad
UnisonicsFXPVerfügbare Alternativen
ZIC-HILIC HarzMerck150455Partikel-/Porengröße, 5 μ m/200 Å. Das Harz kann manuell aus der LC-Säule extrahiert und langfristig in 50 % (v/v) Methanol in MilliQ Wasser gelagert werden
ZipTip C18 Festphasenextraktions-Mikrosäulen (SPE).MilliporeZTC18S096Alternativ können hausgemachte C18-SPE-Mikrosäulen das kommerzielle Produkt ersetzen
LC-MS/MS Analyse
1260 Infinity Capillary HPLC-System AgilentAlternativen verfügbar
Analytische LC-Säule vorgepackt mit ReproSil-Pur C18 AQ-HarzDr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Deutschlandr13.aq.s2570Partikel-/Porengröße: 3 μ m/120 Å, Länge/Innendurchmesser: 25 cm/75 μm. Kommerzielle C18 Nano-LC-Säulen sind ebenfalls erhältlich/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System Thermo Alternativen verfügbar
HyperCarb KAPPA PGC Kapillar-LC-SäuleThermoAuslaufartikelPartikel/Porengröße, 3 μ m/250 Å; Länge der Säule, 30 mm; Innendurchmesser 0,180 mm. Größere Geometrien der HyperCarb PGC-LC-Säulen, die Daten in ähnlicher Qualität liefern, sind im Handel erhältlich (z. B. Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC-Säule von Merck mit einer Partikel-/Porengröße, 2,7 μ m/200 und mit unterschiedlichen Säulenlängen und Innendurchmessern sind ebenfalls erhältlich (z.B. Merck #59994-U). 
LiChrosolv100029verfügbare AlternativenLCMS-Qualität
Linearfallen-Quadrupol (LTQ) Velos Pro Ionenfallen-Massenspektrometer (Glykomik)Alternativen verfügbar
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer (Glykoproteomik)ThermoAndere hochauflösende MS-Systeme mit oder ohne ETD (nur für O-Glykoproteomik erforderlich) sind ebenfalls erhältlich (z. B. Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupol-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker oder ähnliche Hochleistungs-Massenspektrometer anderer Hersteller)
Total Recovery Klarglas-Schraubfläschchen 0,9 mLThermoTHC11093563Alternativen verfügbar
Total Recovery Klarglas-Schraubfläschchen passende KappenThermoTHC09150869Alternativen verfügbar
Trap LC-Säule im eigenen Haus verpackt mit ReproSil-Pur C18 AQ-HarzDr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Deutschlandr15.aq.s0202Partikel-/Porengröße: 5 μ m/120 Å, Länge/Innendurchmesser: 2 cm/100 &m.m. Kommerzielle C18 Trap LC-Säulen sind ebenfalls erhältlich. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 oder höherKommerzielle Glykopeptid- und PTM-Suchmaschine, die LC-MS/MS-Rohdaten von den meisten MS-Anbietern akzeptiert
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 oder höherKommerzielle Software für die manuelle Inspektion von Glykopeptidkandidaten und die automatische Annotation von Glykan-MS/MS-Spektren
GlycoModExpasyOpen-Access-Software, die die Annotation von Glykomics-Daten unterstützt (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Open-Access-Software, die die Annotation von Glykomics-Daten und das Zeichnen von Glykan-Cartoons unterstützt
RawMeatVAST Scientificv2.1Open-Access-Software, die m/z von Glykan-Vorläufer-Ionen aus spektralen Rohdaten
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 oder höherOpen-Access-Software für die relative Quantifizierung von Glykanen
XcaliburThermov2.2 oder höherZum Durchsuchen von LC-MS/MS-Rohdaten
in Thermo extrahiert

Referenzen

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