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Methodenartikel

Quantitativer PCR-basierter Assay zur Messung des Sonic Hedgehog-Signalwegs im zellulären Modell der Ziliogenese

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DOI:

10.3791/67407

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31. Januar 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Studie demonstriert einen quantitativen PCR-basierten Assay für die Aktivierung des primären Zilien-vermittelten Sonic Hedgehog (SHH)-Signalwegs unter Verwendung eines SHH-Agonisten in einem zellulären Modell der Ziliogenese.

Zusammenfassung

Ziliopathie bezieht sich auf eine Sammlung von multisystemischen und polygenen menschlichen Krankheiten und Störungen, die aufgrund einer Aberration der Struktur oder Funktion von beweglichen oder nicht-beweglichen (primären) Zilien entstehen, bei denen es sich um Mikrotubuli-basierte Zellvorsprünge handelt. Primäre Zilien (PC) sind in den meisten menschlichen Epithel- und Endothelgeweben vorhanden und dienen als Drehscheibe für die physiologische Signaltransduktion, einschließlich der Sonic Hedgehog (SHH)-Signalübertragung. Verschiedene Situationen erfordern eine Untersuchung der Funktion von PC, die durch die Messung des kanonischen SHH-Signalwegs erreicht werden kann, der fast ausschließlich durch PC vermittelt wird. In dieser Arbeit wird eine quantitative PCR (qPCR)-basierte Technik entwickelt, um das Transkriptionsniveau von Genen des SHH-Signalwegs in ruhenden hTERT-RPE1 (oder RPE1) Zellen zu messen, die hauptsächlich PC enthalten. Die Ruhe in RPE1-Zellen wird durch Serummangel für 48 Stunden erreicht, während die Aktivierung des SHH-Signalwegs durch einen spezifischen Agonisten gefördert wird. Dieser auf Zellkulturen basierende Assay ist einfach zu befolgen und empfindlich. Die erfolgreiche Demonstration dieses Assays an flimmernden RPE1-Zellen zeigt sein immenses Potenzial als In-vitro-Assay zur Untersuchung der korrekten Funktion von PC bei genetischer oder epigenetischer Veränderung eines oder mehrerer Gene, die mit verschiedenen Ziliopathien assoziiert sein können.

Einleitung

Ein Zilium ist ein auf Mikrotubuli basierender und membranummantelter Vorsprung von der Zelloberfläche, der auf einem Basalkörper1 angeordnet ist. Bei Wirbeltieren werden zwei Arten von Zilien beobachtet, nämlich bewegliche und unbewegliche. Bewegliche Zilien befinden sich in spezialisierten Geweben und verleihen Beweglichkeit. Nicht-bewegliche primäre Zilien (PC) sind in den meisten Wirbeltierzellen vorhanden und erfüllen sensorische Funktionen und leiten kritische Signale aus dem extrazellulären Milieu in das Zellinnere weiter2. Einmal zusammengebaut, wird die Ziliarelongation durch eine intraflagellare Transportmaschine (IFT) unterstützt, ein bidirektionales Transportsystem, das Fracht transportiert, die von Kinesinen (anterograde Bewegung) und Dynein-II-Motorproteinen (retrograde Bewegung) angetrieben wird3,4. Strukturelle oder funktionelle Defekte an beweglichen oder primären Zilien können zu einer Vielzahl von multisystemischen Erkrankungen des Menschen führen, die zusammen als Ziliopathien bekannt sind 5,6.

PC dient als Drehscheibe für verschiedene Entwicklungssignalprozesse, wie z. B. Wingless (Wnt), G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs), Transforming Growth Factor β (TGFβ) und Platelet-derived growth factor (PDGF) 7,8. Bei Säugetieren ist die Signalgebung des Sonic Hedgehog (SHH) von entscheidender Bedeutung, die in Zellen, die PC 9,10,11 enthalten, fast ausschließlich von PC übertragen wird. Eine abnorme Struktur oder Funktion des PC führt zu abgeschwächten Signalwegen, die mit Krankheiten wie angeborenen Herzfehlern, polyzystischen Nierenerkrankungen, kraniofazialen Anomalien, Netzhautdystrophie und einigen seltenen Krankheiten wie dem Bardet-Biedl-Syndrom (BBS), dem Joubert-Syndrom (JBTS), dem Alström-Syndrom und der Jeune-erstickenden thorakalen Dysplasie (JATD) verbunden sind12,13,14,15. Bei den meisten davon handelt es sich um polygene Erkrankungen des Epithel- oder Endothelgewebes, die eine Herausforderung bei der Früherkennung und Behandlung dieser Erkrankungen darstellen. Die Bestimmung, wie solche Mutationen zu einer abgeschwächten PC-vermittelten Signalübertragung in einem Zellkulturmodell beitragen, kann nicht nur Einblicke in die molekulare Komplexität dieses Signalwegs geben, sondern auch die Diagnose verschiedener Ziliopathien erleichtern und therapeutische Interventionen nahelegen. Mit diesem Gedanken wird ein quantitativer PCR (qPCR)-basierter Assay entwickelt, um die Veränderung des PC-vermittelten SHH-Signalwegs in humanen Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT)-immortalisierten retinalen Pigmentepithelzellen (hTERT-RPE1, hier als RPE1 bezeichnet) zu bestimmen. RPE1-Zellen sind nahezu diploide, nicht transformierte menschliche Zellen, die weithin als zelluläres Modell für die Ziliogenese verwendet werden, da etwa 75%-80% dieser Zellen PC nach Serummangel (Inkubation von Zellen in serumfreiem Medium) für 24-48 Stunden assemblieren, verglichen mit nur 15%-18% Ciliatierung in einer asynchron wachsenden Kultur von RPE1-Zellen16.

Der Igel-Signalweg (HH) ist bei Wirbeltieren für die Embryonalentwicklung konserviert17. Bei Säugetieren werden drei verschiedene Arten von Hedgehog-Signalen beobachtet: Sonic (SHH), Indian (IHH) und Desert (DHH), von denen SHH und IHH überlappende Funktionen auf Gewebeebene aufweisen11. Der SHH-Signalweg spielt eine Schlüsselrolle während der Embryonalentwicklung, indem er die Musterbildung der Gliedmaßen und die Zelltypspezifikation im Nervensystem reguliert und die Homöostase des adulten Gewebes aufrechterhält 10,11,18. Obwohl die SHH-Signalgebung komplex ist, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass die kanonische SHH-Signalgebung auf PC 7,11,19 angewiesen ist, die durch kollektive Funktionen von Gli-Transkriptionsfaktoren (Gli1, Gli2 und Gli3) vermittelt wird. Es wurde vermutet, dass sich der HH-Signalweg und PC gemeinsam entwickelt haben, wobei kritische Signalkomponenten im kompakten Volumen an der Spitze des Ziliums konzentriert sind, um effektive Reaktionen auf niedrige Ligandenverhältnisse zu ermöglichen11.

In Abwesenheit von SHH-Liganden hemmt Patched1 (Ptch1), das auf der PC-Membran lokalisiert ist, die Aktivität von Smoothened (Smo) durch einen wenig verstandenen Mechanismus, der wahrscheinlich den Lipidtransport beinhaltet, wodurch der Signalweg unterdrückt wird 7,20. Das konstitutiv aktive ziliäre GPR161, ein G-gekoppelter Proteinrezeptor und ein negativer Regulator des Systems, stellt sicher, dass die Repression aufrechterhalten wird, indem es hohe Spiegel an ziliärem zyklischem AMP (cAMP) beibehält, das die Aktivität der Proteinkinase A (PKA)21 erhöht, und indem es die ziliäre Lokalisation von PKA7 aufrechterhält. Die PKA-Aktivität phosphoryliert zusammen mit der Kaseinkinase 1 (CK1) und der Glykogensynthase-Kinase 3 β (GSK3β) mehrere Reste der Gli-Proteine Gli2 und Gli3 im PC. Gli2 und Gli3 können sowohl als Aktivatoren als auch als Repressoren der Transkription von Zielgenen wirken. Die PKA-vermittelte Phosphorylierung bewirkt eine Hemmung der Aktivatorfunktion von Gli2, während phosphoryliertes Gli3 durch Proteasen gespalten wird, um den Repressor von Gli3R22 zu produzieren. Insgesamt ist die Expression von SHH-Zielgenen unter solchen Bedingungen unterdrückt.

Wenn SHH-Ligand vorhanden ist, bindet Ptch1 an ihn, und GPR161 verlässt PC, und Smo, das von der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Kinase 2 (GPRK2) phosphoryliert wird, und CK1 wird zusammen mit β-Arrestin und dem Mikrotubuli-Motor KIF3A23 in PC transportiert. Im Zusammenspiel wird die Lokalisation von Gli2/3, Suppressor of Fused (SUFU) und Kif7 an der Ziliarspitze gefördert und ist mit einer verminderten Gli2/3-Spaltung verbunden, wodurch die Aktivatorfunktion von Gli2/3 erhöhtwird 24,25. Einmal aktiviert, induziert Gli2/3 die Expression von Gli1, das nur als Aktivator fungieren kann, und verstärkt dadurch die Reaktion des SHH-Signalwegs22. Die Bindung von SHH an Ptch1 wird durch CAM-bezogene/herunterregulierte Onkogene (CDO), Bruder von CDO (BOC), Wachstumsarrest-spezifisches 1 (GAS1) und Low-Density-Lipoproteinrezeptor-verwandtes Protein 2 (LRP2) erleichtert. Umgekehrt kann das Hedgehog-interagierende Protein (HHIP) SHH sequestrieren, indem es direkt mit ihm interagiert, und konkurriert auch mit Ptch1 durch die Interaktion mit SHH26. Wichtig ist, dass GLI1, HHIP und PTCH1 bei der Aktivierung des SHH-Signalwegs transkribiert werden, während die letzten beiden an der negativen Regulation des SHH-Signalwegs beteiligt sind.

Frühere Studien zeigten, dass die Transkriptspiegel von SHH-Zielgenen gemessen werden können, um den SHH-Signalweg zu beurteilen, obwohl er bei verschiedenen Zelltypen erheblich variieren kann27,28. Eine solche Variation in der Antwort des SHH-Signalwegs kann auf unterschiedliche Kombinationen des PC-vermittelten SHH-Signalwegs und des SHH-Signalwegs, der durch die Zellmembran vermittelt wird, zurückgeführt werden, wahrscheinlich in Abwesenheit von PC. SAG ist ein Smo-Agonist, der bei dieser Methode verwendet wird, um die Aktivierung des SHH-Signalwegs in serumarmen RPE1-Zellen nachzuahmen, die hauptsächlich ciliatisiert sind. Die Transkriptspiegel von SHH-Zielgenen wie HHIP, GLI1 und PTCH1 und einem Nicht-Zielgen SMO wurden mittels qPCR in Kontroll- und SAG-behandelten Zellen gemessen und verglichen, um die Aktivierung des SHH-Signalwegs zu bestimmen. Die erfolgreiche Demonstration dieses zellkulturbasierten sensitiven Assays zur Messung des PC-vermittelten SHH-Signalwegs deutet auf seine vielversprechende Anwendung in der biomedizinischen Forschung im Zusammenhang mit der primären Zilienfunktion hin.

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Protokoll

1. Zellkultur

  1. Passieren Sie einen nahezu konfluenten T-25-Zellkulturkolben mit RPE1-Zellen in einer Verdünnung von 1:5 der Originalkultur in einen frischen T-25-Zellkulturkolben mit 5 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin-Mischung (Endkonzentration - 100 U/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin). Dieses Medium wird als vollständiges Medium bezeichnet. Züchten Sie Zellen bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2.
    HINWEIS: RPE1-Zellen sind nicht transformierte Zellen, die häufig verwendet werden, um die molekulare Regulation des PC-Auf- und -Abbaus in Zellkulturen zu untersuchen. Etwa 80% der RPE1-Zellen bauen PC nach Serummangel an, das bei erneuter Zugabe vonSerum-16 wieder zerlegt wird.
  2. Bereiten Sie die runden Deckgläser 12 mm vor, indem Sie sie in 50 mL à 1 N HCl in einem abgedeckten Glasbecherglas über Nacht ohne Schütteln bei 60 °C in einem Wasserbad oder Inkubator inkubieren.
  3. Pipettieren Sie am nächsten Tag mit einer 25-ml-Pipette die Säurelösung aus und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß in einem Behälter für chemische Gefahren. Waschen Sie anschließend die Deckgläser 3x in 100 ml destilliertem Wasser, indem Sie sie 15 Minuten lang inkubieren und gelegentlich schütteln, gefolgt von einem Pipettieren.
  4. Wiederholen Sie die Waschschritte mit 70 % Ethanol und 95 % Ethanol. Trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie einzeln auf ein Laborlöschpapier in einer Biosicherheitswerkbank legen. Nach dem Trocknen 60 min mit UV-Strahlung sterilisieren.

2. Zellwachstum, Serummangel und SAG-Behandlung

  1. Die Zellen werden im T-25-Kolben in einem vorgewärmten vollständigen Medium resuspendiert, nachdem die Zellen durch die enzymatische Aktivität der vorgewärmten 0,25%igen Trypsin-EDTA-Lösung entfernt wurden. Bestimmen Sie die Zelldichte der Suspension, indem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
  2. Bereiten Sie zwei 35-mm-Zellkulturschalen vor und legen Sie jeweils zwei sterile 12-mm-Deckgläser hinein. Passage 2 x 105 asynchron wachsende RPE1-Zellen in jede 35-mm-Schale mit Deckgläsern und züchten die Zellen in 2 mL vollständigem Medium für 24 h.
  3. Entfernen Sie nach 24 h das Medium der wachsenden RPE1-Zellen und waschen Sie die Zellen 1x mit vorgewärmten 1 mL DPBS-Puffer. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes DMEM-Medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin, aber ohne FBS (serumfreies Medium) in jede Schale und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2.
  4. Nach 24 Stunden wird das Medium durch das serumfreie Medium ersetzt, das entweder SAG bis zu einer Endkonzentration von 250 nM oder DMSO als Kontrolllösungsmittel enthält, und die Zellen weitere 24 Stunden inkubieren. Ein Cartoon-Diagramm des Zellkulturprotokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.

3. Entnahme von Zellen

  1. Übertragen Sie die Deckgläser auf eine 24-Well-Platte mit jeweils einem Deckglas in jeder Vertiefung. Geben Sie 0,5 ml gekühltes Methanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei -20 °C, um die Zellen auf den Deckgläsern zu fixieren. Waschen Sie die Deckgläser unmittelbar danach 3x mit 0,5 mL Waschpuffer (1x PBS mit 0,5 mM MgCl2 und 0,05% Triton-X 100).
  2. Entsorgen Sie das Medium und geben Sie 0,5 ml Trizol-Reagenz direkt in jede Schale. Gleichmäßig verteilen und 5 Min. aufbewahren lassen. Pipettieren Sie einige Male auf und ab, um eine homogene Mischung zu erhalten, und sammeln Sie sie in nukleasefreien 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

4. Präparation der Gesamt-RNA und cDNA

  1. Geben Sie 0,1 ml Chloroform in jedes Röhrchen mit den lysierten Zellen und inkubieren Sie es 2-3 Minuten lang. Jede Probe wird 15 Minuten lang bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase, die die RNA enthält, wird in frische Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  2. 0,25 ml Isopropanol in die wässrige Phase geben und 10 Minuten inkubieren. 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Das RNA-Präzipitat bildet ein weißes, gelartiges Pellet. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
  3. Resuspendieren Sie das RNA-Pellet in 0,5 ml frisch verdünntem 75%igem Ethanol. Die Proben kurz vorziehen und dann 5 min bei 7500 x g bei 4°C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
  4. Trocknen Sie das RNA-Pellet 10 Minuten lang an der Luft und resuspendieren Sie es in 25 μl nukleasefreiem Wasser. Bestimmen Sie die Konzentration der Gesamt-RNA durch Messung der Extinktion bei 260 nm mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer.
  5. Verwenden Sie 1-3 μg Gesamt-RNA aus beiden Proben, um cDNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers für ein cDNA-Synthesekit herzustellen. cDNAs bei -20 °C lagern.

5. Quantitative PCR

  1. Setzen Sie die qPCR-Reaktionen (in dreifacher Ausfertigung, Tabelle 1) unter Verwendung von 1:5 verdünnten cDNAs aus jeder Probe mit Primer-Sets von GLI1, PTCH1, HHIP, SMO und β-ACTIN (als Housekeeping-Gen; Tabelle 2) Gene mit einem qPCR-Mastermix, der geeignete DNA-Polymerase, dNTPs und Puffer enthält, in einer geeigneten, fluoreszenzempfindlichen Multi-Well-PCR-Platte.
  2. Decken Sie die Platte mit einem geeigneten Versiegelungsmittel ab, legen Sie sie in ein geeignetes qPCR-Gerät und führen Sie am Ende des Programms ein standardisiertes qPCR-Programm mit 40 Amplifikationszyklen und einem Schritt zur Analyse der Schmelzkurve durch. Das standardisierte 40-Zyklen-qPCR-Programm, einschließlich einer Schmelzkurvenanalyse, ist in Abbildung 1B schematisch dargestellt.
  3. Wenn das qPCR-Programm abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Schmelzkurve jedes Amplikons auf einen einzelnen Peak bei der gewünschten Temperatur.
    HINWEIS: Am Ende der Amplifikationszyklen misst die zugehörige Schmelzkurvenanalyse die Schmelztemperatur des Amplikons, indem die Temperatur jeder Vertiefung von 65 °C auf 95 °C erhöht wird, mit einem Schritt von 0,5 °C pro Schritt von 5 s Dauer.
  4. Exportieren Sie die Amplifikationsdaten in eine Tabelle und berechnen Sie die relative Expression (2-ΔΔCT-Methode) jedes Transkripts, indem Sie für jede Probe gegen die des β-ACTIN-Gens normalisieren. Zeichnen Sie das Diagramm und berechnen Sie die statistische Signifikanz der Änderungen in der relativen Expression jedes Transkripts mit einem ungepaarten T-Test.

6. Immunfärbung und Bildaufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie

  1. Inkubieren Sie die fixierten Zellen auf Deckgläsern in 200 μl Blockierungspuffer (2 % BSA und 0,1 % TritonX-100 in 1x PBS) für 30 Minuten.
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit einer Mischung aus Primärantikörpern (typischerweise ein Anti-Maus-Antikörper gegen acetyliertes α-Tubulin des PC-Axonems bzw. Anti-Kaninchen-Antikörper gegen Ziliarmembran bzw. Zentriol), verdünnt in einem Blockpuffer (siehe Materialtabelle für die endgültige Verdünnung) über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
    1. Stellen Sie eine befeuchtete Kammer her, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in die untere Hälfte einer leeren 1-ml-Pipettenspitzenbox legen. Legen Sie einen Streifen transparenter Folie auf die Rackoberfläche und tülpen Sie einen Tropfen (20 -25 μl) der Antikörperlösung auf die Folie, einen für jedes Deckglas, das inkubiert werden soll. Legen Sie ein Deckglas auf die Tröpfchen, so dass die Zellen eingetaucht sind, und schließen Sie den Deckel der Tippbox.
  3. Am nächsten Tag die Deckgläser wieder umdrehen und wieder in die 24-Well-Schale geben. Waschen Sie die Deckgläser mit dem Waschpuffer und inkubieren Sie sie dann in 150 μl Sekundärantikörpermischung mit einer vorstandardisierten Verdünnung von Antikörpern (hier grün fluoreszierendes Farbstoffkonjugiertes Anti-Maus und rot fluoreszierendes Farbstoffkonjugiertes Anti-Kaninchen, verdünnt in Blockpuffer) und nukleären DNA-Färbereagenzien für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Deckgläser 3x.
  4. Spotten Sie ein Tröpfchen (ca. 3-5 μl) der Einbettlösung, die das Antifading-Reagenz enthält, auf einem Glasobjektträger. Legen Sie ein Deckglas mit der Zellenseite nach unten auf die Eindecklösung. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit ab, indem Sie vorsichtig auf ein sauberes Tuch drücken. Tragen Sie transparenten Nagellack entlang der Kante des Deckglases auf, um ihn auf dem Objektträger zu versiegeln.
  5. Legen Sie einen Objektträger auf das Mikroskop (siehe Materialtabelle), der mit einem motorisierten Tisch und einer Kamera für digitale Bildgebung verbunden ist. Verwenden Sie ein 60x Plan Apo Öl-Immersionsobjektiv (mit einer numerischen Apertur von 1,4), um die Bilder von serumarmen RPE1-Zellen bei Umgebungstemperatur aufzunehmen, um PC in Zellen zu visualisieren, wie durch die genannten Antikörper gekennzeichnet.
  6. Erfassen Sie Bilder der verschiedenen Proben auf separaten Deckgläsern mit identischer Belichtungszeit für verschiedene Fluorophore entlang der Z-Achse mit einem Softwarepaket für die digitale Mikroskopie-Bildgebung. Zählen Sie die Anzahl der PC-haltigen Zellen von mindestens 500 Zellen, um die prozentuale Ciliation im 48-stündigen serumarmen Zustand zu bestimmen.

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Ergebnisse

Die Aktivierung des PC-vermittelten SHH-Signaltransduktionswegs ist eine Möglichkeit, die richtige Funktion von PC7 zu verstehen. In dieser Arbeit wird die relative Expression von Zielgenen des SHH-Signalwegs mittels RT-qPCR-Assay nach SAG-vermittelter Aktivierung des SHH-Signalwegs in RPE1-Zellen gemessen, die überwiegend zilienförmig sind. Die direkten transkriptionellen Ausgänge GLI1 und PTCH1 des SHH-Signalwegs werden häufig verwendet, um die Aktivität dieses Signalwegs zu messen

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Diskussion

Die Untersuchung der Funktionalität von PC ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Dynamik der Zilialität und der Krankheiten oder Störungen, die mit der Dysfunktion von PC verbunden sind. Neben der Untersuchung der Zililiation durch Immunfärbung auf ziliäre Marker oder Fluorophor-markierte ziliare Strukturkomponenten wird die Funktion von PC häufig durch die Untersuchung der Aktivierung des kanonischen SHH-Signalwegs bestimmt, indem die ziliäre Translokation von Smo in Gewebe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch das Ramalingaswami-Stipendium für SM durch das Department of Biotechnology (DBT) der indischen Regierung und das Forschungsstipendium des Science and Engineering Research Board (SERB) der indischen Regierung an SM (CRG/2020/004042) unterstützt. Das Stipendium von PH wird von der University Grant Commission (UGC) der indischen Regierung gesponsert. Die Autoren danken Dr. Chandrama Mukherjee und Avik Mukherjee vom RNABio Lab des Institute of Health Sciences der Presidency University herzlich für den Zugang zum qPCR-Instrument bzw. die Schulung in diesem Instrument.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMSO, steril gefiltertSigmaD2650
Esel, Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Esel, Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von DulbeccoGibco, ThermoFisher Scientific14190144
fötales Rinderserum (FBS)HimediaRM1112
Fluoreszenzmikroskop mit 60-fachem ObjektivCarl Zeiss;Axio Observer colibri 5
hTERT-RPE1 ZellenATCCCRL-4000
iScript cDNA SynthesekitBio-Rad Laboratories1708891
Maus, monoklonaler anti-acetylierter Tubulin-AntikörperMilipore Sigma-AldrichT7451Endgültige Verdünnung 1:1000
Penicillin-Streptomycin, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Quantitative PCR-Maschine, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Kaninchen, polyklonaler Arl13B-AntikörperProteinTech17711-1-APEndgültige Verdünnung 1:250
Kaninchen, polyklonaler Cep135-AntikörperProteinTech24428-1-APEndgültige Verdünnung 1:500
SlowFade Gold Antifade-AntikörperThermoFisher ScientificS36940
Geglättet Agonist (SAG) AbmoleM4865Stammlösung: in DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagenzInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisherScientific 12605028

Referenzen

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Quantitativer PCR-basierter Assay zur Messung des Sonic Hedgehog-Signalwegs im zellulären Modell der Ziliogenese
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