Aktive Immunisierung zur Induktion der autoimmunen muskelspezifischen Kinase (MuSK) Myasthenia gravis bei Mäusen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll für ein experimentelles Mausmodell der autoimmunen muskelspezifischen Kinase (MuSK) Myasthenia gravis vorgestellt, das darauf abzielt, die Pathophysiologie und mögliche therapeutische Strategien für die Erkrankung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Myasthenia gravis (MG) ist eine Autoimmunerkrankung, die die neuromuskuläre Verbindung betrifft. Während die meisten MG-Patienten Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor (AChR) produzieren, weist eine Untergruppe von Patienten Autoantikörper auf, die auf die muskelspezifische Kinase (MuSK) abzielen. Die MuSK MG ist gekennzeichnet durch schwere Muskelschwäche, behandlungsresistente klinische Manifestationen und myasthenische Krisen, die häufig eine maschinelle Beatmung erforderlich machen. Folglich benötigen Patienten häufig eine längere Einnahme von Immunsuppressiva, die mit langfristigen Nebenwirkungen verbunden sind. Angesichts des Schweregrads und der Seltenheit von MuSK-MG ist die Entwicklung eines experimentellen Tiermodells von entscheidender Bedeutung, um neue Behandlungsmodalitäten voranzutreiben und die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen besser zu verstehen. Die experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) dient als Tiermodell für MuSK-MG und ahmt die klinischen und immunologischen Merkmale der humanen MG effektiv nach. Die Induktion von autoimmunen Tiermodellen kann durch aktive oder passive Immunisierung erreicht werden. In dem hier vorgestellten Versuchsprotokoll wurde die aktive Immunisierung durch subkutane Verabreichung der gereinigten extrazellulären Domäne von humanem MuSK emulgiert, das in vollständigem Freund-Adjuvans mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis emulgiert wurde. Die Immunisierung wurde an vier Stellen durchgeführt, gefolgt von einer Auffrischungsinjektion mit MuSK am 28. Tag. Dieses Adjuvans mit M. tuberculosis ermöglicht die Aktivierung des Immunsystems durch TLR4 und eine verstärkte Phagozytose des verabreichten Antigens. Dieser Artikel beschreibt ausführlich die Entwicklung und Charakterisierung von MuSK-EAMG von der Idee bis zum Abschluss.

Einleitung

Myasthenia gravis (MG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich durch T-Zell-abhängige, Antikörper-vermittelte Mechanismen entwickelt. Sie wird hauptsächlich durch Antikörper gegen nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChR) auf der postsynaptischen Membran des neuromuskulären Übergangs (NMJ) bei 80%-85% der Patienten und durch Antikörper gegen muskelspezifische Kinase (MuSK) bei etwa 5% der Patienten sowie durch andere NMJ-Proteine verursacht. MG ist zu einem Prototyp für Autoimmunerkrankungen und zu einem Modell für das Verständnis der postsynaptischen Funktion^{geworden 1}. Tiermodelle für Autoimmunerkrankungen können in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: (1) Spontanmodelle, in denen Tiere auf natürliche Weise eine Autoimmunerkrankung entwickeln, und (2) induzierte Modelle, bei denen die Autoimmunerkrankung künstlich nachgeahmt und repliziert wird. Studien zu Myasthenia gravis (MG) haben gezeigt, dass sowohl die aktive als auch die passive Immunisierung die Krankheit auslösen können, was wesentlich zum Verständnis von Antikörper-vermittelten Erkrankungen beiträgt².

Der passive Transfer ist eine hochwirksame Methode zur Bewertung der akuten Auswirkungen von Autoantikörper-vermittelten Erkrankungen und wird häufig zur Untersuchung von patienteneigenen Antikörpern bei MG eingesetzt. Dieser Ansatz hat dazu beigetragen, das Verständnis der immunologischen Faktoren, die der Krankheit zugrunde liegen, zu erweitern. So haben passive Transferstudien beispielsweise den pathogenen Einfluss von anti-MuSK IgG4 auf die Reduktion von AChR-Clustern gezeigt³. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des passiven Transfermodells, wie z. B. die funktionellen Unterschiede zwischen dem IgG- und Immunsystem von Menschen und Nagetieren sowie die Unzulänglichkeit des passiven Transfermodells, um die anfänglichen Aktivierungsmechanismen der Anti-MuSK-Autoimmunität nachzuahmen, die in lymphatischen Geweben auftritt.

Auf der anderen Seite ist eine mögliche Einschränkung der Immunisierungsstudien die immungenetische Variabilität zwischen verschiedenen Mausstämmen⁴. Während beispielsweise C57BL/6 (B6)-Mäuse anfällig für eine aktive Immunisierung mit AChR sind, sind AKR/J-Mäuse resistent. Daher ist es bei der Erstellung eines EAMG-Tiermodells entscheidend, die Tierart, die Immunisierungsmethode und den Protokollinhalt korrekt auszuwählen, um die Krankheit genau widerzuspiegeln⁵.

Darüber hinaus führt die Verwendung des Zielantigens als ganzes Protein häufig zu hohen Antikörpertitern. Allerdings können nicht alle Antikörper mit dem Mausantigen kreuzreagieren oder krankheitserregende Epitope produzieren. Daher spiegeln aktive Immunisierungsmodelle die menschliche Pathologie nicht immer genau wider. Wenn es ihnen jedoch gelingt, einen geeigneten klinischen und physiologischen Phänotyp zu erstellen, bieten diese Modelle eine langfristige Plattform für die Erprobung experimenteller Therapien.

Klinische Studien weisen auf unterschiedliche Krankheitsmechanismen und therapeutische Anforderungen für MuSK-MG hin, was die Notwendigkeit einer weiteren Identifizierung der spezifischen pathogenen Merkmale dieses MG-Subtyps^{unterstreicht 4,5,6}. Frühere auf aktiver Immunisierung basierende MuSK-EAMG-Studien zeigten eine überwiegende Beteiligung von Immunität vom Th2-Typ und Anti-Maus-IgG1 an der MuSK-Autoimmunität und identifizierten eine Reihe potenzieller Behandlungsmodalitäten (z. B. Teriflunomid, mesenchymale Stammzelle, FCRLB shRNA) für humane MuSK MG ^7,8,9. Dies zeigte die Bedeutung des MuSK EAMG-Modells für die Erprobung neuer therapeutischer Ziele und die Untersuchung der MuSK MG-Pathophysiologie.

In diesem Artikel wurden die Verfahren zur Induktion des Tiermodells, zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und zur Validierung der EAMG-Induktion detailliert beschrieben. Die klinische Bewertung umfasste die Überwachung von Gewicht, Haltung, Griffkraft und klinischen Werten durch einen Beobachter. Die Mäuse wurden 28 Tage nach der zweiten Impfung eingeschläfert, und verschiedene Gewebe, darunter Blut, Muskeln der hinteren Gliedmaßen, Milz sowie axilläre und leistende Lymphknoten, wurden entnommen, um die Etablierung der Krankheit zu bestätigen. Anti-MuSK-Antikörper wurden in Seren mit der ELISA-Methode quantifiziert. Zusätzlich wurde eine Immunfluoreszenzfärbung an Muskelgewebe durchgeführt, um Ablagerungen an der neuromuskulären Verbindung sichtbar zu machen. Um die klinischen und Immunantworten in Mausgruppen mit unterschiedlicher MuSK EAMG-Empfindlichkeit zu demonstrieren und zu vergleichen, zeigten Mäuse, die mit KCNS3 shRNA behandelt wurden, eine proinflammatorische Wirkung (unveröffentlicht), und FCRLB shRNA zeigte eine entzündungshemmende Wirkung⁹, wie in früheren Studien festgestellt wurde.

Protokoll

Das Protokoll wurde von der Lokalen Ethikkommission für Tierversuche der Universität Istanbul (HADYEK) mit der Entscheidungsnummer 2020/29 genehmigt. In unseren vorangegangenen Studien ^7,8,9 wurde das EAMG-Modell in 8-10 Wochen alten BALB/c- oder B6-Mäusen durch aktive Immunisierung mit dem MuSK-Protein induziert. In diesem Artikel werden exemplarische Daten aus verschiedenen Experimenten mit MuSK-immunisierten BALB/C-Mäusen (4-8 Mäuse pro Gruppe) vorgestellt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung und Aufbereitung von humanem MuSK für die Immunisierung

1. Klonieren Sie die humanen extrazellulären MuSK-Domänenaminosäuren 24-495 (NCBI-Referenzsequenz: NP_005583.1) in den pPIC9-Vektor.
2. Sekretionsexpression im Hefesystem Pichia pastoris (Stamm GS115).
3. Induzieren Sie die Expression durch Zugabe von Methanol (2,5 % v/v) in das Wachstumsmedium.
4. Fügen Sie ein C-terminales 6xHIS-Etikett zu Reinigungszwecken hinzu.
5. Exprimieren Sie das Protein als sezerniertes glykosyliertes Protein und reinigen Sie es unter nativen Bedingungen. Dialysieren Sie das Kulturmedium gegen 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, 300 mM NaCl.
6. Fahren Sie mit der Nickel-Ionen-Affinitätschromatographie mit Ni²⁺/Nitrilotriacetat-Agarose (Ni-NTA) fort. Lagern Sie das gereinigte Protein nach Zugabe von 10 % Glycerin bei -80 °C, wo es mindestens zwei Jahre lang stabil ist¹⁰.
   HINWEIS: Die nach der Ni-NTA-Reinigung geschätzten Expressionswerte betragen ca. 0,4 mg/l Kultur. In den mit SDS-PAGE analysierten Proben wurden keine weiteren Proteinverunreinigungen nachgewiesen.
7. Vor der Immunisierung ist die Reinheit der isolierten extrazellulären Domäne des MuSK-Proteins durch Gelelektrophorese zu überprüfen (Ergänzende Abbildung 1).
8. Bereiten Sie den MuSK für jede Maus in einer Konzentration von 45 μg/100 μl PBS vor.
9. Homogenisieren (emulgieren) Sie das MuSK im Verhältnis 1:1 mit PBS (100 μL) und Complete Freund's Adjuvans (CFA-100 μL), das Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) enthält (das Gesamtvolumen der Emulsion beträgt 200 μL pro Maus).

2. Anästhesie und Immunisierung

1. Verdünnen Sie vor der Immunisierung das Propofol in PBS (Verhältnis 1:5).
2. Intraperitoneal mit 50 mg/kg pro Maus verabreichen.
   HINWEIS: Isofluran kann auch zur Anästhesie durch Inhalation verwendet werden (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Die Anfangskonzentration wird in der Regel auf 3 %-5 % bei einem Sauerstoffdurchfluss von 1-2 l/min eingestellt, während die Erhaltungskonzentration bei einem Sauerstoffdurchfluss von 0,5 bis 1 l/min in der Regel 1 %-3 % beträgt.
3. Erste Immunisierung: Injizieren Sie insgesamt 45 μg/200 μl präpariertes MuSK in CFA subkutan in die Schultern und die inneren Hinterpfoten (ca. 11,25 μg/50 μl für jeden Teil).
4. Zweite Immunisierung: Injizieren Sie insgesamt 45 μg/200 μl vorbereitetes MuSK in CFA subkutan in die Schultern und Hüften (ca. 11,25 μg/50 μl für jeden Teil).
   HINWEIS: Verabreichen Sie die Injektionen zweimal im Abstand von 28 Tagen, um das Modell zu etablieren. Die intramuskuläre Verabreichung ist mit Muskelschmerzen verbunden, die die klinische Schwächebeurteilung beeinträchtigen können. Da es sich bei der EAMG um eine Muskelerkrankung handelt, kann die Verwendung einer intramuskulären Injektion eine schmerzbedingte nicht-myasthenische Schwäche hervorrufen und somit als Störfaktor wirken. Eine Kontrollgruppe, die nur mit CFA (ohne MuSK) immunisiert ist, wird empfohlen.

3. Klinische Bewertung

1. Trainieren Sie die Mäuse, indem Sie sie vorsichtig 40 Mal über das obere Gitter eines Käfigs ziehen, während sie versuchen, das Gitter zu greifen, um Ermüdung auszulösen, da die Symptome von Myasthenia gravis bei Mäusen nach körperlicher Anstrengung und Ermüdung ausgeprägter werden.
2. Beobachten Sie die Mäuse nach dem Training sorgfältig auf Veränderungen der Aktivität, des Gewichts und der Muskelkraft. Weisen Sie auf der Grundlage dieser Beobachtungen geeignete Punktzahlen zu, um die Bewertungskriterien zu bestimmen.
   HINWEIS: Punktzahl 0: Mäuse bleiben aktiv und erkunden weiterhin ihre Umgebung; Punktzahl 1: Nach dem Training wird eine gebeugte Haltung beobachtet, aber die Mäuse kehren zu normaler Aktivität und Geselligkeit zurück. Die Fellpflege wird in der Regel beibehalten. Punktzahl 2: Eine gebeugte Haltung ist bereits vor dem Training sichtbar und wird nach dem Training ausgeprägter. Es wird eine Abnahme der Selbstpflege und Aktivität festgestellt. Punktzahl 3: Vor und nach dem Training wird eine dramatische gebeugte Haltung beobachtet. Es kommt zu einer signifikanten Abnahme der Bewegung, der Geselligkeit und der Muskelkraft, begleitet von einem Gewichtsverlust von 1-2 Gramm alle 2-3 Tage. Es kommt zu Dehydrierung, die es für Mäuse schwierig macht, Wasser und Nahrung zu erreichen. Dehydrierung erkennt man daran, dass die Haut nach dem Kneifen nicht schnell zurückkehrt und sich der Kot verändert. Mäuse mit Schmerzen zeichnen sich durch Schielen und eine gebeugte Haltung aus. Mäuse, die Anzeichen von starken Schmerzen und Gewichtsverlust von mehr als 20 % zeigen, werden getötet. Punktzahl 4: Die Maus wird tot im Käfig aufgefunden. Die verstorbene Maus sollte sofort entfernt und der Käfig gewechselt werden⁵.
3. Untersuchen Sie die Mäuse täglich, da die Symptome etwa 10 Tage nach der zweiten Immunisierung schnell fortschreiten. Führen Sie in den ersten 28 Tagen wöchentlich und dann zweimal pro Woche klinische Bewertungen und Messungen durch.
4. Führen Sie eine Gewichtsmessung durch.
   HINWEIS: Die Gewichtsmessung ist ein entscheidender Parameter für die Verfolgung des Fortschreitens der Krankheit. Aufgrund der hohen Stoffwechselraten von Mäusen kann das Körpergewicht stark variieren. Es ist wichtig, für alle Messungen die gleiche Skala zu verwenden und diese Messungen zur gleichen Tageszeit durchzuführen, um die Konsistenz zu gewährleisten.
5. Führen Sie eine Muskelkraftmessung durch. Verwende ein horizontales Dynamometer mit einem Gitterdraht, um die Muskelkraft zu messen.
   1. Trainieren Sie die Mäuse für die klinische Bewertung, indem Sie sie 40 Mal vorsichtig über den Käfig ziehen, um Ermüdung zu erzeugen.
   2. Platzieren Sie sofort jede Maus auf dem Gitter des Prüfstands und ziehen Sie vorsichtig am Schwanz, wobei Sie darauf achten, dass alle Pfoten das Gitter fest umklammern. Betrachten Sie nur Messungen, bei denen die Mäuse das Gitter mit allen vier Pfoten greifen.
      HINWEIS: Versuchen Sie, bei jeder Messung die gleiche Kraft aufzubringen, und es wird empfohlen, dass derselbe Forscher alle Messungen durchführt, um die Zuverlässigkeit zu erhalten und die Variabilität zu reduzieren. Da die Ermüdbarkeit das Kennzeichen der MG-Schwäche ist, sollte eine Reihe von Grifffestigkeitstests durchgeführt werden, ohne die Griffkraft zu messen. Danach wurden sieben Messungen für jede Maus durchgeführt, und die Maximal- und Minimalwerte wurden verworfen. Der Durchschnitt der verbleibenden fünf Messungen wird berechnet, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.

4. Vorbereitung der Gewebeprobe

HINWEIS: Die Mäuse 28 Tage nach der zweiten Immunisierung gemäß den institutionell anerkannten Protokollen töten. Die Entnahme von Blut, Muskeln, Milz und Lymphknoten von den getöteten Mäusen wird für weitere Untersuchungen von Vorteil sein.

1. Herzblutentnahme
   HINWEIS: Um Herzblut zu entnehmen, betäuben Sie die Mäuse mit einem geeigneten Anästhetikum (z. B. Propofol), das von der Ethikkommission genehmigt wurde. Die Herzpunktion erfordert eine Anästhesie und ist ein tödlicher Eingriff, was bedeutet, dass die Tiere unmittelbar danach eingeschläfert werden müssen.
   1. Nachdem Sie die Ratte tief betäubt haben, legen Sie sie auf den Rücken, öffnen Sie den Bauch und lokalisieren Sie das Herz, etwa 1 cm über der untersten Rippe und leicht nach rechts.
   2. Entnehmen Sie mit einer 25-35-G-Nadel vorsichtig Blut aus dem linken Ventrikel in einem 45-Grad-Winkel, ohne die Spritze zu bewegen, um Komplikationen zu vermeiden¹¹.
   3. Übertragen Sie die Blutproben in trockene Röhrchen für die Serumtrennung und/oder in EDTA-Röhrchen für die RNA-Isolierung - falls geplant.
   4. Trennen Sie das Serum durch Zentrifugation und bewahren Sie die Serumproben bis zur Verwendung bei -20 °C auf.
2. Konservierung und Aufbereitung von Muskelproben
   1. Musculus tibialis anterior^sammeln 11,12,13. Mit eiskaltem PBS abspülen.
   2. Die Proben werden in Kryoröhrchen gegeben, sofort in flüssigem, stickstoffgekühltem Isopentan bei -20 °C getaucht und in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert.
      HINWEIS: Die Proben sollten schockgefroren werden, um genauere Ergebnisse in Experimenten zu erzielen.
   3. Legen Sie das Gewebe senkrecht auf eine Schnitthalterung; Es kann ein Korken verwendet werden. Betten Sie die Proben für die Immunfluoreszenzfärbung in OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) ein.
   4. Lassen Sie das Gewebe auf flüssigem, stickstoffgekühltem Isopentan schwimmen. In einem -80 °C Gefrierschrank lagern, bis sie mit einem Kryostaten geschnitten werden.

5. Bewertung neuromuskulärer Verbindungen mittels Immunfluoreszenzmarkierung

1. Kryostaten-Schnitt und -Fixierung
   1. Das in OCT bei -24 °C eingebettete gefrorene Gewebe wird mit einem Kryostaten auf eine Dicke von 7 μm geschnitten.
   2. Die Abschnitte in Aceton fixieren, das auf -20 °C abgekühlt ist. 5 Min. mit PBS waschen.
   3. PBS mit 0,4 % Triton X (PBS-T) erneut 10 Min. waschen.
      HINWEIS: Ein Permeabilisierungsschritt kann durchgeführt werden, um die Konformation der von der Fixierung betroffenen Moleküle zu korrigieren und eine genauere Bindung zu gewährleisten. Die Permeabilisierung umfasste die Behandlung mit PBS mit 1 % FBS für 10 min und PBS-T für weitere 10 Minuten.
   4. Blockieren Sie die Abschnitte mit PBS-T mit 10 % FBS für 30 Minuten, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
2. Immunfluoreszenz-Färbung
   HINWEIS: Für die Färbung können folgende Antikörper verwendet werden: C3, IgG, Acetylcholinrezeptor-Marker α-Bungarotoxin.
   1. Verdünnen Sie die ausgewählten Antikörper in PBS-T, die 1% FBS enthalten.
   2. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 2,5 h inkubieren.
   3. Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-T mit 1 % FBS.
   4. Gegenfärbung mit DAPI.
   5. Lagern Sie die Schnitte bis zur Untersuchung unter einem Fluoreszenzmikroskop in einer dunklen und feuchten Umgebung bei 4 °C.
   6. Führen Sie Bildgebung und Analyse durch.
      HINWEIS: Bungarotoxin (BTX)-positive neuromuskuläre Verbindungen in jedem Abschnitt sollten mit einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden. Nehmen Sie Bilder mit 20-facher Vergrößerung auf. Für die Analyse wurden BTX und C3 bzw. IgG-positive neuromuskuläre Verbindungen manuell unter dem Mikroskop gezählt. Für die Analyse sollte der prozentuale Anteil der doppelt positiven Übergänge im Verhältnis zu den gesamten BTX-markierten Übergängen in seriellen Schnitten verwendet werden.

6. Westlicher Blot

1. Proteinisolierung und -quantifizierung
   1. Verwenden Sie Muskelproben, die schockgefroren sind.
   2. Bereiten Sie einen Lysepuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren vor.
   3. Fügen Sie 0,5 mm Zirkonoxidkügelchen hinzu, die dem Probengewicht und dem 2-fachen Volumen des Lysepuffers entsprechen.
   4. Homogenisieren Sie die Proben mit einem Homogenisator.
   5. Lysat bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
   6. Sammeln Sie den Überstand, der das Proteinlysat enthält.
   7. Verwenden Sie ein BCA-Assay-Kit oder ein Bradford-Reagenz, um die Proteinkonzentration zu quantifizieren.
   8. Bereiten Sie Proteinproben mit Lysepuffer auf die gewünschte Konzentration vor. 25 μg Protein pro Vertiefung sind effizient für die Darstellung von AChR.
2. SDS-PAGE Gelelektrophorese
   1. Mischen Sie Proteinproben mit 4x Laemmli Puffer.
   2. Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten lang bei 95 °C, um sie zu denaturieren.
   3. Laden Sie gleiche Mengen Protein und eine Proteinleiter in die Vertiefungen eines SDS-PAGE-Gels.
   4. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 200 V laufen (die Zeit kann je nach Netzteil variieren).
3. Proteintransfer
   1. Für den halbtrockenen Transfer mit Nitrozellulosemembran benetzen Sie jede Komponente mit einem Kalttransferpuffer.
   2. Richten Sie das Transfersandwich ein: Schwamm, Filterpapier, Gel, Membran, Filterpapier, Schwamm.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen den Schichten vorhanden sind. Das Transferprogramm sollte gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgewählt werden (siehe Materialtabelle).
4. Blockierung und Antikörperinkubation
   1. Blockieren Sie die Membran in 5 % fettfreier Trockenmilch oder BSA in TBST für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln.
   2. Inkubieren Sie die Membran mit einem Primärantikörper (Anti-AChR), der über Nacht bei 4 °C bei 4 °C in einem 2,5%igen Blockierungspuffer verdünnt wurde, unter leichtem Schaukeln.
   3. Waschen Sie die Membran 3 Mal für je 10 min in TBST.
   4. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (IgG HRP), verdünnt in 2,5 % Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur.
   5. Waschen Sie die Membran 3 Mal für je 10 min in TBST.
5. Detektion und Bildgebung
   1. Tragen Sie das ECL-Substrat gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Membran auf.
   2. Erfassen Sie das Chemilumineszenzsignal mit einem Bildgebungssystem.
   3. Analysieren Sie Banden mit Bildgebungssoftware.
      HINWEIS: Bewahren Sie Proteine und Reagenzien immer auf Eis auf, um einen Abbau zu verhindern. Stellen Sie eine gleichmäßige Beladung sicher, indem Sie ein Haushaltsprotein (z. B. Beta-Aktin, Alpha-Tubulin oder GAPDH) als Kontrolle ausführen. Optimieren Sie die Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten für beste Ergebnisse. Entscheidend ist der Nachweis, dass das AChR-Protein in MuSK-immunisierten Mäusen weniger exprimiert wird.

7. Hausgemachter Anti-MuSK IgG-ELISA

1. Bereiten Sie das MuSK-Antigen in einer Konzentration von 0,5 μg pro Vertiefung in 100 μl Karbonat-Bicarbonat-Puffer vor (Plate Coating).
2. Geben Sie 100 μl der Antigenlösung in jede Vertiefung einer Immunoassay-Platte.
3. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
4. Waschen Sie die Platte mit PBS mit 0,5 % Tween 20 (Waschlösung).
5. Die Platte wird 90 min lang bei 4 °C mit PBS mit 5 % FBS (Blocklösung) inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren (Blockierung).
6. Da Optimierungsstudien hohe MuSK-IgG-Spiegel zeigten, verdünnen Sie die Serumproben um 1/50.000 in Blocklösung.
7. Ohne sie nach dem Blockieren zu waschen, geben Sie die verdünnten Serumproben in die Vertiefungen.
8. Die Platte bei 37 °C 90 min inkubieren.
9. Waschen Sie den Teller dreimal mit der Waschlösung.
10. Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (ab97023) 1/5000 in Blockierungslösung.
11. 100 μl des verdünnten Sekundärantikörpers werden in jede Vertiefung gegeben.
12. Die Platte bei 37 °C 90 min inkubieren.
13. Waschen Sie den Teller dreimal mit der Waschlösung.
14. Geben Sie 100 μl TMB-Substrat in jede Vertiefung und beobachten Sie die Farbveränderung.
15. Stoppen Sie die Reaktion zu einem geeigneten Zeitpunkt mit 2 M H₂SO_4.
16. Messen Sie die optische Dichte bei 450 nm mit einem Spektralphotometer.
17. Führen Sie alle Proben in Duplikaten und auf derselben Platte durch, um die Konsistenz zu gewährleisten.
    HINWEIS: Für die Analyse sollten optische Dichtewerte verwendet werden, da keine Standardverdünnungen der Probe verfügbar waren. In den negativen Kontrollvertiefungen (blank) sollte es keine Farbänderung geben. Es wird eine schnelle Farbänderung erwartet, daher sollte die Stopplösung in der Nähe aufbewahrt werden, um die Reaktion in den Vertiefungen sofort zu stoppen.

Ergebnisse

Bei der Evaluierung und Validierung des MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) Modells sind mehrere Schlüsselparameter und experimentelle Ergebnisse entscheidend, um die erfolgreiche Induktion und Charakterisierung des Krankheitsmodells zu demonstrieren. Nachfolgend finden Sie die repräsentativen Ergebnisse, die die Etablierung des MuSK EAG-Modells bestätigen.

Klinische Bewertung
Die Mäuse werden anhand eines standardisierten klinischen Scoring-Systems auf kl...

Diskussion

Murine MuSK-EAMG ahmt humanes MuSK-MG sowohl in seinen klinischen als auch in immunpathogenen Aspekten in Bezug auf Muskelschwäche, Gewichtsverlust aufgrund von bulbärer Muskelschwäche, zirkulierende Anti-MuSK-Antikörper und reduzierten Muskel-AChR nach. Was die Meilensteine und den voraussichtlichen Zeitplan für dieses MuSK-EAMG-Modell betrifft, so sollten klinische Anzeichen einer Muskelschwäche innerhalb der ersten Woche nach der zweiten Immunisierung auftreten. Etwa 5 % der Mäuse kön...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
125I-α-bungarotoxin	Invitrogen	BTX T1175
2-Methylbutan	Sigma-Aldrich	M32631
40 μ m Cell Strainer	NEST	258369
96 Well Maxisorp Platte	Sigma-Aldrich	M9410
Adjuvans unvollständig	Becton Dickinson & Co.& Co.	263910
Anti-AChR alfa1	Alomone	ANC-001
Anti-Maus IgG HRP	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	Next Advance		Gewebehomogenisator
C3	Novus	NB200-540G
Karbonat-Bicarbonat-Puffer	Merck	C3041
Kryostat	Leica	CM1860
Dynamometer Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Fluoreszenzmikroskop	Leica	DM4M
Glasspritze mit Luer-Lock	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
Mikroplatten-Photometer, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
Maus-Chirurgie-Kit	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.
OCT	Compound Agar Scientific	AGR1180
Spritzen, 1 mL	Becton Dickinson & Co.& Co.
Spritzen, 2	mL B. Braun	7389
Universal-Rückhaltesystem für Tiere	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Sirius-Western Blotting Detection Kit	Advansta	K-12043-D10	ECL