Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca²⁺) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2⁺ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Zusammenfassung

Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung ist essentiell für die Untersuchung von Ca2⁺ -Kanälen, die durch verschiedene Stimulationen wie Temperatur, Spannung, native Verbindung und Chemikalien usw. aktiviert werden. Es stützt sich in erster Linie auf die Mikroskopie-Bildgebungstechnologie und den verwandten Ca2⁺ -Indikator Fura-2/AM (AM ist die Abkürzung für Acetoxymethylester). In den Zellen wird Fura-2/AM durch Esterasen zu Fura-2 hydrolysiert, das reversibel an freies zytoplasmatisches Ca²⁺ binden kann. Die maximale Anregungswellenlänge verschiebt sich bei der Bindung von 380 nm auf 340 nm (bei Sättigung mit Ca²⁺). Die emittierte Fluoreszenzintensität hängt quantitativ mit der Konzentration des gebundenen Ca²⁺ zusammen. Durch die Messung des Verhältnisses 340/380 kann die^Ca2+ -Konzentration im Zytoplasma bestimmt werden, wodurch Fehler vermieden werden, die durch Schwankungen in der Ladeeffizienz der Fluoreszenzsonde zwischen verschiedenen Proben verursacht werden. Diese Technologie ermöglicht die quantitative und gleichzeitige Überwachung von Ca2⁺ -Veränderungen in mehreren Zellen in Echtzeit. Die Ergebnisse werden in ". XLSX"-Format für die anschließende Analyse, das schnell ist und intuitive Änderungskurven erzeugt, wodurch die Erkennungseffizienz erheblich verbessert wird. Aus verschiedenen experimentellen Perspektiven listet dieser Artikel den Einsatz dieser Technologie zum Nachweis von Ca2⁺ -Signalen in Zellen mit endogenen oder überexprimierten Kanalproteinen auf. Inzwischen wurden auch verschiedene Methoden zur Aktivierung von Zellen gezeigt und verglichen. Ziel ist es, den Lesern ein klareres Verständnis für die Verwendung und Anwendungen der Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung zu vermitteln.

Einleitung

Ca²⁺ spielt eine entscheidende Rolle bei der zellulären Signaltransduktion und reguliert verschiedene zelluläre Funktionen wie Muskelkontraktion¹, Nervenleitung², Sekretion³ und Genexpression⁴ und beeinflusst dadurch mehrere physiologische Prozesse. Abnorme Ca2⁺ -Konzentrationen können zu Krankheiten wie Herzrhythmusstörungen⁵, Gerinnungsstörungen⁶ und hormonellen Ungleichgewichten⁷ führen. Daher ist die Untersuchung der Mechanismen intrazellulärer Ca2⁺ -Konzentrationsänderungen von größter Bedeutung.

An der Regulation der^Ca2+ -Konzentration in Zellen sind verschiedene Ionenkanäle beteiligt, darunter die hoch^Ca2+-selektiven Calciumfreisetzungs-aktivierten Calciumkanäle (CRAC)⁸ und nicht-selektive Kationenkanäle der TRP-Familie⁹. Diese Ionenkanäle können durch Reize wie Temperatur¹⁰, Verbindungen und Wirkstoffe aus der traditionellen chinesischen Medizin¹¹ aktiviert werden und spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Ca²⁺-bezogenen physiologischen Prozessen.

Eine effektive Überwachung intrazellulärer Ca2⁺ -Konzentrationsänderungen ist für die Untersuchung von^Ca2+-verwandten Ionenkanälen unerlässlich, insbesondere im Bereich der traditionellen chinesischen Medizin, wo die Regulation des Kalziumsignalwegs in vielen therapeutischen Ansätzen eine zentrale Rolle spielt. Derzeit können die primären Methoden zur Messung von intrazellulärem Ca²⁺ in zwei Typen eingeteilt werden: elektrische und optische Messungen. Der elektrische Messansatz verwendet die Patch-Clamp-Technik, um Veränderungen des Zellmembranpotentials aufgrund des Ca2⁺ -Einstroms¹² zu beurteilen.

Bei der optischen Messung binden Fluoreszenzsonden spezifisch an Ca²⁺, wodurch Forscher Änderungen der zellulären Fluoreszenzintensität verfolgen können. Zu den gängigen optischen Methoden gehören fluoreszierende proteinbasierte und fluoreszierende Farbstoff-basierte Techniken. In fluoreszierenden Protein-basierten Methoden können^{Forscher Ca2}+-empfindliche fluoreszierende Proteine wie Cameleon¹³ und GCaMP¹⁴ in Zellen überexprimieren und Änderungen des Fluoreszenzsignals mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie überwachen, um Verschiebungen der zytoplasmatischen Ca2⁺ -Konzentrationen zu beobachten. Darüber hinaus können Forscher diese Proteine in Mäusen überexprimieren und die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie für die Echtzeit-Überwachung der intrazellulären Ca2⁺ -Konzentrationen in vivo oder auf Gewebeebene verwenden, um eine hohe Auflösung und tiefe Gewebepenetration zu gewährleisten¹⁰.

Für fluoreszierende Farbstoff-basierte Methoden werden häufig^Ca-2+ -Sonden verwendet, darunter Fluo-3/AM, Fluo-4/AM und Fura-2/AM¹⁰. Die Forscher inkubieren Zellen in einer Lösung, die diese Fluoreszenzsonden enthält, die die Zellmembran durchdringen und durch intrazelluläre Esterasen gespalten werden, um Wirkstoffe (z. B. Fluo-3, Fluo-4 und Fura-2) zu bilden, die in der Zelle verbleiben. Diese Sonden weisen in ihrer freien Ligandenform eine minimale Fluoreszenz auf, emittieren jedoch eine starke Fluoreszenz, wenn sie an intrazelluläres Ca2⁺ gebunden sind, was auf Veränderungen der zytoplasmatischen Ca2⁺ -Konzentrationen hinweist. Im Vergleich zu anderen fluoreszierenden Proteinen und Farbstoffen wird Fura-2 typischerweise bei Wellenlängen von 340 nm und 380 nm angeregt. Wenn es an intrazelluläres freies Ca²⁺ gebunden ist, erfährt Fura-2 eine Absorptionsverschiebung, die den Anregungswellenlängenpeak von 380 nm auf 340 nm verschiebt, während der Emissionspeak nahe 510 nm unverändert bleibt. Es besteht eine quantitative Beziehung zwischen der Fluoreszenzintensität und der gebundenen Ca2⁺ -Konzentration, die die Berechnung der intrazellulären^Ca2+ -Konzentration durch Messung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses bei diesen beiden Anregungswellenlängen ermöglicht. Verhältnismessungen reduzieren die Auswirkungen von Photobleichung, Leckagen von Fluoreszenzsonden, ungleichmäßiger Beladung und Unterschieden in der Zelldicke und führen zu zuverlässigeren und reproduzierbareren Ergebnissen (Abbildung 1).

Einzelzellige Ca2⁺ -Bildgebungssysteme verwenden hauptsächlich Mikroskopietechniken und den Ca2⁺ -Indikator Fura-2/AM, um intrazelluläre Ca2⁺ -Konzentrationen nachzuweisen. Diese Systeme bestehen aus einem Fluoreszenzmikroskop, einer Ca²⁺ -Bildgebungslichtquelle und einer Fluoreszenzbildgebungssoftware, die eine quantitative Echtzeitüberwachung von Ca2⁺ -Veränderungen im Zytoplasma mehrerer Zellen gleichzeitig ermöglichen (bis zu 50 Zellen pro Sichtfeld). Die Ergebnisse werden für die spätere Analyse im Format ".xlsx" gespeichert. Das System bietet eine schnelle Analysegeschwindigkeit (ca. 1 Minute für die Analyse einer Gruppe von Zellen innerhalb eines Sichtfelds) und generiert intuitive Änderungskurven, wodurch die Detektionseffizienz erheblich verbessert wird. Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung ist ein wesentlicher technischer Ansatz für die Untersuchung von Ca2⁺-verwandten Kanälen und hat einen erheblichen Wert in der biomedizinischen Forschung im Zusammenhang mit Ionenkanälen. Es wird erwartet, dass seine Anwendung in der Einzelzell-Calcium-Bildgebungstechnologie die Erforschung der Mechanismen, die der traditionellen chinesischen Medizin zugrunde liegen, erheblich voranbringen wird.

Protokoll

Die experimentellen Methoden wurden von den IACUC-Richtlinien der Tsinghua-Universität und der Peking-Universität für Chinesische Medizin genehmigt und befolgten diese. Dieses Protokoll führt einzellige Ca2⁺ -Bildgebungsverfahren für verschiedene Zelltypen ein, einschließlich primärer Keratinozyten, die aus der Haut mehrerer neugeborener Mäuse isoliert wurden (innerhalb von drei Tagen nach der Geburt, mit geschlechtsrandomisierten Wurfgeschwistern, C57BL/6-Mäuse). Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen

ANMERKUNG: Primärzellen, Zelllinien mit endogenen Zielgenen oder solche, die mit überexprimierten Plasmiden transfiziert wurden, eignen sich alle für die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung. Die in dieser Studie verwendeten Plasmide wurden aus dem Labor von Professor Xiao Bailong an der Tsinghua-Universität gewonnen. Diese Plasmide wurden konstruiert, indem Sequenzen des fluoreszierenden GFP-Proteins mit humanem STIM1, des fluoreszierenden Proteins DsRed mit dem humanen Orai1, des fluoreszierenden mRuby-Proteins mit dem Kaninchen-TRPV1 sowie des rot fluoreszierenden Proteins mCherry in Phagen-Plasmidvektoren¹⁰ eingebaut wurden.

1. Bereiten Sie sterile Objektträger mit einem Durchmesser von 8 mm in einer 24-Well-Platte vor. Geben Sie 500 μl Poly-D-Lysin (PDL)-Puffer (50 μg/ml in DPBS) in jede Vertiefung.
2. Inkubieren Sie die Objektträger 1 h lang bei 37 °C, um die Beschichtung zu ermöglichen, und entsorgen Sie dann die Beschichtungslösung mit einer Pipette.
3. Waschen Sie die Objektträger einmal mit DPBS und legen Sie sie für den späteren Gebrauch beiseite.
4. Primärzellen und Zelllinien getrennt nach ihren spezifischen Kultivierungsmethoden^{kultivieren 10}.
5. Säen Sie die Zellen auf die vorbereitete 24-Well-Platte mit einer Dichte von etwa 1,5 x 10⁵ Zellen pro Well. Verwenden Sie die Zellen für die Ca2⁺ -Bildgebung, sobald sie auf dem Deckglas haften.
6. Bei Zellen, die Plasmide überexprimieren, transfizieren Sie^10,15 das Zielplasmid (1 μg/Well) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (oder Lipofectamine 3000) Transfektionsreagenz im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie in einem Zellkulturinkubator für etwa 24 Stunden.
   ANMERKUNG: Für größere exprimierte Proteine kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein.

2. Herstellung der Arbeitslösung Fura-2/AM

1. 50 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in ein Röhrchen mit 50 μg Fura-2/AM-Pulver geben und gut mischen, um eine 1 μg/μl-Stammlösung von Fura-2/AM herzustellen.
2. Mischen Sie die Fura-2/AM-Stammlösung und Pluronic F-127 in Hanks Puffer, der 1,3 mM Ca²⁺ enthält.
   ANMERKUNG: Die Endkonzentration von Fura-2/AM und Pluronic F-127 in der Arbeitslösung beträgt 2,5 μg/ml. Der Hank-Puffer wird durch Zugabe von 10 mM HEPES zu 1x HBSS-Puffer vorbereitet.
3. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Arbeitslösung Fura-2/AM vor Licht zu schützen.

3. Zellvorbehandlung für die Einzelzell-Ca-2⁺ -Bildgebung

1. Übertragen Sie die Objektträger mit den Zellen zum Waschen auf eine neue 24-Well-Platte, die Hanks Puffer enthält.
2. Verwerfen Sie den Puffer mit einer Pipette und geben Sie 500 μl Fura-2/AM-Arbeitspuffer in jede Vertiefung.
3. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang inkubieren, damit die Sonde geladen werden kann.
4. Entfernen Sie den Fura-2/AM-Arbeitspuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit Hanks Puffer, um überschüssiges Fura-2/AM zu entfernen. Die Zellen sind nun einsatzbereit.

4. Starten des Bildgebungssystems Ca²⁺

HINWEIS: In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop für die Ca2⁺ -Bildgebung verwendet.

1. Starten Sie die folgenden Komponenten nacheinander: DG4-Licht (Xenonlampe), Kamera, Weißlichtquelle, Mikroskoptischsteuerung, Mikroskop, Computer und Fluoreszenzbildgebungssoftware.
   ANMERKUNG: Wenn Sie die Aktivierung von Ionenkanälen anhand der Temperatur erkennen, schalten Sie auch die folgenden Komponenten ein: Perfusionssystem, Heizsystem, Temperaturregler und Heiz-/Kühlgerät für Flüssigkeitszirkulation.

5. Verfahren der zellulären Ca2⁺ -Reaktion

1. Öffnen Sie die Fluoreszenzbildgebungssoftware (siehe Materialtabelle).
   1. Wählen Sie Protocol (Protokoll) und dann File ( Datei) und dann Load Protocol (Protokoll laden) aus. Wählen Sie das Protokoll aus und klicken Sie auf OK.
   2. Konfigurieren Sie das Experiment (in der Menüliste).
   3. Wählen Sie Neues Experiment aus.
2. Montieren Sie die Perfusionskammer am Mikroskop.
   ANMERKUNG: Senken Sie das Objektiv beim Ein- oder Ausbau von Kammern immer mit dem groben Fokusknopf vollständig ab, um eine Beschädigung des Objektivs zu vermeiden.
3. Entfernen Sie die mit Fura-2/AM behandelten Zellobjektträger und legen Sie sie in die Kammer mit dem Hank-Puffer.
4. Starten Sie das Perfusionssystem.
5. Wählen Sie das Objektiv mit 20x DIC und stellen Sie den Fokus bei weißem Licht ein.
6. Klicken Sie in der Taskleiste auf Cfg Exp .
   1. Wählen Sie die gewünschten Fluors für die Bildgebung aus.
   2. Bestimmen Sie die Erfassungsfrequenz und die Anzeigeeinstellungen auf dem Bildschirm (Erfassen: auf 340, 380, GFP prüfen; Erfassungsintervall: 1 s; Speicherintervall: 1 s).
7. Brennpunkt
   1. Klicken Sie in der Systemsteuerung des Experiments auf die Schaltfläche Fokus .
   2. Passen Sie die Erfassungszeit (normalerweise 100 ms) und die Verstärkung nach Bedarf an und speichern Sie dann für diese Welle.
      ANMERKUNG: Verwenden Sie für UV-Licht die Verstärkung anstelle der Belichtungszeit.
   3. Wählen Sie die gewünschte Wellenlänge für die Fokussierung (z.B. 380) und klicken Sie auf Fokussierung starten.
   4. Schalten Sie den Blick vom Fernglas auf den Computer um.
   5. Stellen Sie sicher, dass eine schwache grünliche Farbe durch das Fernglas sichtbar ist.
   6. Fokussieren Sie sich auf die Zellen und verwenden Sie zuerst den Grobfokus, um das Objektiv nahe zu bringen, und dann den Feinfokus.
      ANMERKUNG: Das Mikroskop piept, wenn es zu nahe an den Tisch kommt. Senken Sie in diesem Fall das Objektiv ab, richten Sie die Platte auf der Bühne neu aus und fokussieren Sie erneut. Minimieren Sie den Zeitaufwand für die Fokussierung, um laserinduzierte Zellschäden zu reduzieren.
   7. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Zellen während des Fokussierungsprozesses.
   8. Passen Sie die Fluoreszenzintensität der Zellen an, indem Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung ändern.
      ANMERKUNG: Die Belichtungszeit und die Verstärkung für 340 und 380 müssen konsistent sein.
   9. Sobald eine gute Fokussierung erreicht ist, drücken Sie die Taste am Mikroskop, um die Ansicht auf den Computer umzuschalten.
   10. Fokussieren Sie bei Bedarf neu, um das schärfste Bild auf dem Computer zu erhalten, und klicken Sie dann auf Fokussierung stoppen.
8. Alternatives Verfahren zum Auffinden von GFP-positiven Zellen
   1. Verwenden Sie zuerst das 340/380-Verfahren, um eine gute Fokussierung auf die Zellen zu erreichen.
   2. Wählen Sie FITC und klicken Sie dann auf Fokussierung starten.
   3. Verwenden Sie den Tischregler, um GFP-positive Zellen zu finden.
   4. Schalten Sie die Ansicht auf den Computer um und klicken Sie dann auf Fokussierung stoppen.
9. Auswahl der Region
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Region in der Menüleiste.
   2. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungstyp (340/380/FITC/TRITC). FITC- und TRITC-Filter werden für GFP bzw. mCherry/DsRed/mRuby für Zellen ausgewählt, die die Zielplasmide überexprimieren; Andernfalls wählen Sie Fura-2 aus.
      ANMERKUNG: Vermeiden Sie die Auswahl von Zellen, die in schlechtem Zustand oder tot sind, wie z. B. solche, die offensichtlich abgerundet sind oder übermäßig exponierte fluoreszierende Proteine aufweisen.
   3. Klicken Sie auf Bilder erfassen und dann auf OK.
   4. Ein neues Fenster wird angezeigt. Wählen Sie Zellen aus, indem Sie auf das ovale Werkzeug klicken und dann auf die Zelle klicken.
   5. Wählen Sie die gewünschten Zellen unter der Fluoreszenz aus, die vom Zielprotein (FITC oder TRITC) getragen wird. Wählen Sie die Kontrollzellen aus, die das Zielprotein unter der 380-nm-Bedingung nicht exprimieren.
   6. Machen Sie einen Bereich rückgängig, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Kreis klicken und dann Region löschen auswählen.
   7. Wählen Sie ein Hintergrundbeispiel als letzten Bereich aus und notieren Sie sich dessen ID-Nummer.
   8. Klicken Sie auf Speichern und dann auf Fertig.
10. Subtraktion im Hintergrund
    1. Klicken Sie auf den Menü-Button Referenzen.
    2. Geben Sie die Nummer des Hintergrundbereichs an.
       ANMERKUNG: Wenn der Hintergrund die zuletzt ausgewählte Region war, wird durch Eingabe einer sehr hohen Zahl automatisch zur zuletzt ausgewählten Region gewechselt.
    3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Referenzen subtrahieren und klicken Sie dann auf OK.
11. Log-Daten
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten protokollieren in der Systemsteuerung des Experiments.
       ANMERKUNG: Bilder werden nur gespeichert, wenn der Wunsch besteht, das Experiment später erneut abzuspielen. Normalerweise reicht es aus, das Kontrollkästchen "Daten" zu aktivieren.
    2. Stellen Sie sicher, dass eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, in der Sie nach dem bevorzugten Datendateityp gefragt werden. Auswahl. Das XLSX-Format wird empfohlen.
    3. Es öffnet sich ein Arbeitsblatt vom Typ ".xlsx". Wenn Sie das Arbeitsblatt minimieren, wird verhindert, dass es Platz auf dem Bildschirm einnimmt.
12. Datenerfassung
    1. Stellen Sie im Abschnitt Zeitraffer des Bedienfelds das Datenerfassungsintervall auf 1 s ein.
       ANMERKUNG: Dies kann je nach tatsächlichem Bedarf angepasst werden.
    2. Klicken Sie auf Zero Clock and Acquire in der Systemsteuerung des Experiments, um das Experiment zu starten. Die Grundlinien werden in einem Diagramm angezeigt, in dem die einzelnen ausgewählten Zellregionen angezeigt werden.
    3. Führen Sie eine Reihe von Behandlungen an den Zellen gemäß den experimentellen Anforderungen durch.
    4. Um das Temperaturverhalten der Zellen zu beobachten, erhitzen Sie den Puffer im Perfusionssystem mit einem Temperaturregler auf eine geeignete Temperatur.
    5. Um die Auswirkungen von Arzneimitteln auf Zellen zu beobachten, perfundieren oder fügen Sie manuell arzneimittelhaltigen Puffer hinzu und zeichnen Sie die Zellveränderungen auf.
    6. Nachdem die Datenerfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Pause.
       ANMERKUNG: Die Datenerfassung kann pausiert und die Uhr jederzeit während des Experiments zurückgesetzt werden.
    7. Speichern und analysieren Sie die Daten.
13. Klicken Sie auf Datei und Experiment schließen , um das Experiment zu beenden, und wählen Sie im Dialogfeld Nein aus, um das Protokoll zu speichern.
14. Öffnen Sie ein neues Experiment, indem Sie im Menü auf Neu klicken, und wiederholen Sie den Vorgang.
15. Herunterfahren
    1. Schließen Sie die Software und übertragen Sie die Daten vom Computer.
    2. Kehren Sie den Startvorgang um.
    3. Protokollieren Sie die Stunden auf dem Anmeldeformular und beseitigen Sie das Chaos.
16. Datenanalyse
    1. Die intrazelluläre Ca2⁺ -Konzentration wird durch das Fura-2 340/380-Verhältnis dargestellt oder in die entsprechende Ca2⁺ -Konzentration umgerechnet.

Ergebnisse

Erkennung des Temperaturverhaltens
Primärer Keratinozyten
Primäre Keratinozyten wurden aus neugeborenen Mäusen isoliert und gemäß den etablierten Protokollen¹⁰ präpariert. Diese Zellen wurden in 24-Well-Platten mit Glasobjektträgern ausgesät. Nach dem Laden der Fura-2-Sonde wurde der Fokus unter dem Mikroskop bei einer Wellenlänge von 380 nm eingestellt, um eine klare Visualisierung der Zellmorphologie zu erreichen, wie in Abbildung 2A dargestellt. Wenn die Sonde während des Prozesses nicht erfolgreich geladen wurde, waren die Zellen nicht sichtbar. Der extrazelluläre Puffer in der Kammer wurde kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ersetzt, wodurch optimale Bedingungen für die Zellen gewährleistet wurden. Das Temperaturkontrollsystem war mit dem Perfusionssystem verbunden und ermöglichte die Detektion zellulärer thermischer Reaktionen durch Kontrolle von Temperaturänderungen im extrazellulären Puffer. Bei diesem Prozess wurde der extrazelluläre Puffer allmählich erhitzt und dann allmählich abgekühlt.

Das einzellige Ca2⁺ -Bildgebungssystem wurde verwendet, um Veränderungen der intrazellulären^Ca2+ -Konzentration unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Wie in Abbildung 2B gezeigt, zeigten Keratinozyten eine ausgeprägte thermische Reaktion, wenn sie Erwärmung ausgesetzt wurden, sowie eine auffällige Reaktion während der Abkühlphase. Bemerkenswert ist, dass diese Temperaturreaktion verschwand, als das STIM1-Gen, das hauptsächlich für diese Reaktion verantwortlich ist, gelöscht wurde (Abbildung 2C)¹⁰. Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung ermöglicht die Beobachtung von Echtzeit-Änderungen der intrazellulären Ca2⁺ -Konzentration als Reaktion auf verschiedene externe Reize und ermöglicht so eine detaillierte Analyse des zellulären Verhaltens und der Signalübertragung.

HEK293T Zellen, die die Zielplasmide überexprimieren
HEK293T Zellen wurden nach der experimentellen Methode in eine 24-Well-Platte mit Glasobjektträgern ausgesät. Die Zellen wurden dann mit STIM1/Orai1 überexprimiert, und ihre vermittelte thermische Reaktion wurde mit der gleichen Methode wie oben beschrieben für Primärzellen nachgewiesen. Im Falle von Zellen, die das Zielplasmid überexprimierten, wurde die erfolgreiche Transfektion durch Selektion von Zellen bestätigt, die das entsprechende Plasmid exprimierten, was durch rot oder grün fluoreszierende Proteine angezeigt wurde, die vom Plasmid unter TRITC- oder FITC-Wellenlängen getragen wurden. Für dieses Experiment wurden STIM1-GFP/Orai1-DsRed-Plasmide verwendet, wobei GFP unter FITC nachgewiesen wurde und grüne Fluoreszenz emittierte, und DsRed unter TRITC mit roter Fluoreszenz detektiert wurde. Zellen, die leere mCherry (TRITC) überexprimieren, wurden als Negativkontrollen verwendet. Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigten Fluoreszenzzellen, die unter FITC beobachtet wurden, eine erfolgreiche Expression von STIM1, was die Auswahl und Aufzeichnung ihrer thermischen Reaktion während des Heiz- und Kühlprozesses ermöglicht. Zellen, die nicht transfiziert wurden, dienten als Negativkontrolle. Abbildung 3B zeigt, dass STIM1/Orai1 während des Abkühlprozesses eine signifikante thermische Reaktion zeigte, im Gegensatz zu der in Abbildung 3C gezeigten Negativkontrolle.

Erkennung von Arzneimittelreaktionen
Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebungstechnologie kann auch verwendet werden, um Zellreaktionen auf Verbindungen zu erkennen. Die Zellvorbereitung für die Detektion thermischer Reaktionen ist die gleiche wie oben beschrieben. Der Unterschied zwischen Wirkstoffreaktion und thermischer Reaktion liegt in der Tatsache, dass die thermische Reaktion in der Regel die Aktivierung von Zellen durch Änderung der Temperatur des extrazellulären Puffers durch ein Perfusionssystem erfordert, während Verbindungen entweder durch Perfusion oder durch direkte Zugabe mit einer Pipette verabreicht werden können. Durch die direkte Zugabe mit einer Pipette kann die Menge der verwendeten Verbindung effektiv eingespart werden. Die resultierende Kurve ist jedoch möglicherweise nicht immer optisch so ansprechend wie die durch Perfusion erhaltene.

Am Beispiel von Abbildung 4 zeigt Abbildung 4A die SOCE-Reaktion (Store-Operated Calcium Entry) von STIM1/Orai1, bei der die extrazelluläre^Ca2+ -Konzentration und der Gehalt an Cyclopiazonsäure (CPA) sequentiell durch ein Perfusionssystem verändert werden, um SOCE zu induzieren. In Abbildung 4B wird der TRPV1-Agonist Capsaicin mit einer Pipette direkt zu Zellen hinzugefügt, die das TRPV1-Plasmid überexprimieren. Capsaicin kann TRPV1 aktivieren und den extrazellulären Ca2⁺ -Einstrom induzieren.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fura-2 AM. Fura-2 ist eine in der Zellbiologie häufig verwendete Ca2⁺ -Fluoreszenzsonde, die selektiv im Verhältnis 1:1 an Ca2⁺ bindet und Fluoreszenz emittiert. Aufgrund seiner hochpolaren Natur als saure Verbindung kann Fura-2 nicht in Zellen eindringen. Um die Zellpermeabilität zu erhöhen, wird es an seiner negativen Gruppe mit Acetoxymethyl (AM) konjugiert, um Fura-2/AM zu bilden. Diese Modifikation erhöht die Löslichkeit des Esters und eliminiert die negative Ladung. In den Zellen wird Fura-2/AM durch Esterasen zu Fura-2 hydrolysiert, das reversibel an freies zytoplasmatisches Ca²⁺ binden kann. Bei der Bindung verschiebt sich die maximale Anregungswellenlänge von 380 nm auf 340 nm (bei Sättigung mit Ca²⁺). Die emittierte Fluoreszenzintensität hängt quantitativ mit der Konzentration des gebundenen Ca²⁺ zusammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Detektion der Temperaturreaktion von primären Keratinozyten. (A) Fura-2-Färbung von Keratinozyten aus neugeborenen Mäusen, beobachtet unter einer 20-fachen Objektivlinse. (B,C) Temperaturreaktion von WT-Keratinozyten (B) und STIM1-Knockout-Keratinozyten (C) unter Verwendung eines einzelligen Ca2⁺ -Bildgebungssystems. Vergrößerung: 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Temperaturerkennung von STIM1-GFP/Orai1-Dsred in HEK293T Zellen. (A) Eine repräsentative Abbildung mit positiven Zellen, die STIM1-GFP unter FITC exprimieren. (B,C) Temperaturreaktion von HEK293T Zellen, die das jeweilige Plasmid exprimieren, das mit einem einzelligen Ca²⁺ -Bildgebungssystem detektiert wurde. Vergrößerung: 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Nachweis des Wirkstoffansprechens mittels Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung. (A) SOCE-Reaktion von HEK293T Zellen, die STIM1/Orai1 überexprimieren. Der extrazelluläre Puffer wird mit Hilfe eines Perfusionssystems von Ca2⁺-haltig auf Ca2⁺-frei umgestellt. In Abwesenheit von Ca²⁺ wird CPA zugesetzt, um Ca²⁺ aus dem endoplasmatischen Retikulum zu depletieren. Der extrazelluläre Puffer wird dann durch einen Ca2⁺-haltigen Puffer ersetzt, um den extrazellulären Ca2⁺ -Einstrom zu induzieren, was den speicherbetriebenen Ca2⁺ -Eintritt darstellt. Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung wird verwendet, um die durch diese Prozesse induzierten Änderungen der zytosolischen^Ca2+ -Konzentration dynamisch aufzuzeichnen. (B) HEK293T Zellen, die TRPV1-mRuby überexprimieren, wobei mRuby ein fluoreszierendes Protein ist, das zur Überprüfung des Transfektionszustands des TRPV1-Proteins verwendet wird. Capsaicin wird mit einer Pipette zugegeben, während der Ca2⁺ -Einstrom durch Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung aufgezeichnet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Anwendung von Einzelzell-Ca2⁺-Bildgebungssystemen ist umfangreich und ermöglicht die Untersuchung von^Ca2+-Signalen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Keratinozyten, Stammzellen¹⁶, Leberzellen, Herzzellen¹⁷, Podozyten¹⁸, Immunzellen und Zelllinien, die Zielproteine überexprimieren^10,19. Diese Technik misst Änderungen und absolute Werte der zellulären Ca2⁺-Konzentrationen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von Ca2⁺-verwandten Ionenkanälen, was sie zu einem der wichtigsten Instrumente in Forschungslaboratorien für Ionenkanäle macht.

Im Laufe der Forschung hat die Bedeutung von Ca2⁺ -Signal-verwandten Ionenkanälen unter Forschern der traditionellen chinesischen Medizin zunehmend an Anerkennung gewonnen. Ihr Ziel ist es, die Kernfragen der Traditionellen Chinesischen Medizin durch die Linse von Ionenkanälen zu entschlüsseln. Zum Beispiel prägen die heißen und kalten Eigenschaften der chinesischen Medizin das Prinzip "Hitze mit Kälte behandeln und Kälte mit Hitze behandeln". Viele temperaturempfindliche Ionenkanäle, die Ca2⁺ -Signale vermitteln, stehen in engem Zusammenhang mit diesem Prinzip. Darüber hinaus üben zahlreiche chinesische Arzneimittel durch entzündungshemmende Wirkungen therapeutische Wirkungen aus, wobei mehrere Ca2⁺-verwandte Ionenkanäle eine wichtige Rolle bei der Regulation von Entzündungen spielen²⁰.

Es ist wichtig, die Auswirkungen wichtiger Bestandteile der traditionellen chinesischen Medizin auf die Eigenschaften von Ionenkanälen zu untersuchen, um die pharmakologischen Eigenschaften dieser Arzneimittel auf molekularer Ebene aufzudecken. Derzeit konzentrieren sich Forscher in der Traditionellen Chinesischen Medizin vor allem auf den Nachweis der Expression relevanter Ionenkanäle. Es gibt jedoch immer noch ein relativ begrenztes Echtzeit-Monitoring bezüglich der Auswirkungen der traditionellen chinesischen Medizin auf Ca2⁺-bezogene Ionenkanäle, und viele zugrunde liegende Mechanismen sind noch unklar.

Diese Forschungsgruppe widmet sich der Erforschung von Ca2⁺-verwandten Ionenkanälen wie STIM1/Orai1, STIM1/Orai3, TRPA1¹⁰ und TRPV1 und ist mit der Anwendung und detaillierten Verwendung von einzelzelligen Ca2⁺ -Bildgebungssystemen bestens vertraut. Diese Studie zeigt die spezifische Verwendung der Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung für verschiedene Forschungszwecke und zielt darauf ab, den Lesern ein umfassendes Verständnis ihrer umfangreichen Anwendungen und ihrer detaillierten Verwendung zu vermitteln. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten verwandten Studien²¹ bietet diese Forschung eine neue Perspektive und Methodik für die Anwendung der Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung aus verschiedenen Blickwinkeln und in Verbindung mit anderen Systemen. So können beispielsweise Primärzellen oder Zelllinien mit endogener Expression von Zielgenen direkt mit der Fura-2-Sonde beladen werden, um Veränderungen der intrazellulären^Ca2+ -Signale in Echtzeit unter verschiedenen stimulierenden Faktoren unter Verwendung des Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebungssystems zu überwachen. Zusätzlich kann eine Überexpression von Plasmiden, die fluoreszierende Proteine enthalten, in Zelllinien durchgeführt werden. Zunächst werden die Zellen mit der Fura-2-Sonde bestückt, wie bereits beschrieben. Als nächstes werden Zellen mit erfolgreicher Expression des Zielproteins auf der Grundlage von FITC- oder TRITC-Signalen ausgewählt, die dann für die anschließende Echtzeitüberwachung der Fura-2^Ca2+ -Signale hervorgehoben werden.

Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung ist ein Detektionssystem, das je nach Versuchszielen mit verschiedenen anderen Versuchsaufbauten integriert werden kann. Wenn beispielsweise die Reaktion temperaturempfindlicher Ionenkanäle auf Temperaturänderungen detektiert werden muss, kann das System mit einem Temperaturregelungsbetriebssystem und einer Perfusionsvorrichtung kombiniert werden, um gleichzeitig Änderungen in intrazellulären^Ca2+ -Signalen zu überwachen, indem die Temperatur der extrazellulären Pufferlösung¹⁹ gesteuert wird. Dieser Ansatz bestätigt die Reaktion der relevanten Ionenkanäle auf die Temperatur. Darüber hinaus kann die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung auch mit relevanten Wirkstoffverabreichungsgeräten oder anderen Zellstimulationsgeräten für verwandte Experimente gekoppelt werden.

Das Einzelzell-Bildgebungssystem Ca²⁺ ermöglicht nicht nur die Echtzeitüberwachung des Verhältnisses 340/380, sondern auch die Werte von FITC oder TRITC durch bestimmte Einstellungen. Darüber hinaus ist die Einzelzell-Calcium-Imaging-Technologie anwendbar, um Änderungen der Kalziumionenkonzentration nicht nur im Zytoplasma, sondern auch im endoplasmatischen Retikulum (ER) zu detektieren und ihre weitreichenden Anwendungen zu demonstrieren¹⁹. Die von diesem System erhaltenen Daten werden einheitlich in einem ".xlsx"-Format gespeichert, das schnell analysiert werden kann, um Ergebnisse zu erhalten. Die Änderungskurve ermöglicht ein schnelles Verständnis des Aktivierungsstatus und der Eigenschaften von Zellen und etabliert ein komfortables Ca²⁺ -Signalüberwachungssystem. Es wird erwartet, dass dieser Forschungsbericht die breite Anwendung des einzelligen Ca2⁺ -Bildgebungssystems im Bereich der traditionellen chinesischen Medizin effektiv fördern und zur Entschlüsselung der traditionellen chinesischen Medizin beitragen wird.

Die Anwendung der Einzelzell-Calcium-Imaging-Technologie hat jedoch gewisse Einschränkungen, wie z. B. die Unfähigkeit, ein Hochdurchsatz-Screening zu erreichen. In einigen Experimenten, wenn es beispielsweise notwendig ist, nach Agonisten oder Antagonisten eines bestimmten Kanals zu suchen, erfordert die Kalziumbildgebung ein Screening einzeln, was sehr zeitaufwändig ist. In solchen Fällen muss diese Technik möglicherweise mit anderen Technologien wie dem FLIPR²² kombiniert werden, um ein Hochdurchsatz-Screening durchzuführen, bevor die Ergebnisse mit Einzelzell-Calcium-Imaging weiter validiert werden. Darüber hinaus werden die Bilder aus der Einzelzell-Calcium-Bildgebung mit der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie erzeugt, die im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie eine geringere Auflösung aufweist¹⁵. Daher ist die effektive Kombination der Einzelzell-Calcium-Imaging-Technologie mit anderen Techniken, um ihre jeweiligen Vorteile zu nutzen, ein wichtiger Ansatz, um die Herausforderungen in diesem Bereich zu bewältigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kamera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 Temperaturregler	Warner Instruments
Cyclopiazonsäure (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 Licht	Sutter Instrument Company
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluoreszenz-Bildgebungssoftware (MetaFluor, kostenpflichtige Software)	Molecular Devices
Fluoreszenzmikroskop	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS Puffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
Poly-D-Lysin	Beyotime	ST508
SC-20 Heiz-/Kühlgerät für Flüssigkeitszirkulation	Harvard Apparatur
Weißlichtquelle	Nikon