Methodenartikel

Aufzeichnung von nach innen gerichteten gleichgerichteten k+ Strömen in frisch isolierten glatten Muskelzellen der Arteria basilaris mittels Patch-Clamp-Technik

DOI:

10.3791/67414

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7. Februar 2025

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Center, Fenyang College, Shanxi Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles und effizientes Verfahren zur Isolierung glatter Muskelzellen aus der Basilararterie der Ratte und zur Aufzeichnung von nach innen gerichteten gleichgerichteten Kaliumkanalströmen in diesen Zellen unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik. Es bietet einen neuartigen Ansatz für Forscher, die die Arteria basilaris und die Ionenkanäle untersuchen.

Zusammenfassung

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Zerebrovaskuläre Erkrankungen sind eine weit verbreitete Erkrankung bei älteren Menschen, deren Inzidenz stetig zunimmt. Die Arteria basilaris ist ein kritisches Hirngefäß, das die Pons, das Kleinhirn, die hinteren Hirnregionen und das Innenohr versorgt. Die Aktivität des Kaliumkanals (K+) spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Gefäßtonus, indem sie das Zellmembranpotenzial reguliert. Die Aktivierung der nach innen gerichteten gleichrichtenden K+ (Kir)-Kanäle führt wie andere K+ -Kanäle zu einer Hyperpolarisation und Vasodilatation der Zellmembran. In dieser Studie wurden frisch isolierte glatte Muskelzellen aus der Arteria basilaris verwendet, um Kir-Ströme mit Hilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik aufzuzeichnen. Es wurden die Auswirkungen von 100 μmol/L BaCl2, einem Kir-Kanal-Inhibitor, und 10 μmol/L Natriumnitroprussid (SNP), einem Nitro-Vasodilatator, auf die Kir-Kanalströme untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass BaCl2 die Kir-Kanalströme in glatten Muskelzellen der Basilararterie hemmte, während SNP diese Ströme verstärkte. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für die Aufbereitung frisch isolierter arterieller glatter Muskelzellen und die Aufzeichnung von Kir-Kanalströmen mit der Patch-Clamp-Technik und bietet eine wertvolle Ressource für Forscher, die diese Methode beherrschen möchten.

Einleitung

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Zerebrovaskuläre Erkrankungen sind eine weit verbreitete Erkrankung in der älteren Bevölkerung. Mit der Verbesserung des Lebensstandards, der gestiegenen Lebenserwartung und der alternden Bevölkerung steigt die Inzidenz von zerebrovaskulären Erkrankungen stetigan 1. Die Arteria basilaris, ein unpaariges Gefäß, das durch die Verschmelzung der beidseitigen Wirbelarterien gebildet wird, verläuft unter den Pons im Schädel und teilt sich in zwei hintere Hirnarterien. Es versorgt die Pons, das Kleinhirn, die hinteren Regionen des Gehirns und das Innenohr. Eine unzureichende Blutversorgung der Arteria basilaris kann zu episodischem Schwindel führen, der oft von Übelkeit und Erbrechen begleitet wird. Bei den Patienten können auch Symptome wie Tinnitus, Hörverlust und andere damit zusammenhängende Probleme auftreten. Diese Symptome sind häufig mit Erkrankungen wie zervikaler Spondylose, zerebraler Atherosklerose und abnormalem Blutdruck verbunden. Zerebrovaskuläre Erkrankungen, die besonders bei Menschen mittleren Alters und älteren Menschen auftreten, sind häufig mit diesen Grunderkrankungen verbunden 2,3,4.

Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle für die kardiovaskuläre Funktion und die Aufrechterhaltung der Homöostase des Körpers. Als primärer Ort des Gefäßwiderstands regulieren sie den Blutdruck und das Herzzeitvolumen und sorgen so für eine ausreichende Durchblutung, um den metabolischen und physiologischen Anforderungen von Geweben und Organen gerecht zu werden5. Die Arteria basilaris, die als Widerstandsarterie klassifiziert wird, reguliert in erster Linie den Blutfluss zum Hirnstamm6. Glatte Muskelzellen, die die Wände der Widerstandsarterien bilden, sind wichtige Mediatoren des Gefäßwiderstands durch die Regulierung der Steady-State-Kontraktion oder der Gefäßspannung. Diese Zellen beherbergen zahlreiche Ionenkanäle, darunter K+-Kanäle, Ca2+-Kanäle und Cl-Kanäle, die für die Modulation des Gefäßtonus entscheidend sind 5,7.

K+-Kanäle sind entscheidend für die Etablierung des Membranpotentials und die Regulierung des kontraktilen Tonus der arteriellen glatten Muskelzellen8. Es gibt vier Arten von K+-Kanälen in der arteriellen glatten Muskulatur: spannungsabhängige K+ (Kᴠ), Ca2+-abhängige K+ (KCa), ATP-abhängige K+ (KATP) und nach innen gerichtete Gleichrichterkanäle K+ (Kir) 9,10,11. Kir-Kanäle werden in sieben Untertypen eingeteilt, wobei Kir2.x klassische Kir-Kanäle sind. Unter diesen sind die Kir2.x-Unterfamilien im Gefäßsystem am relevantesten. Kir-Ströme weisen bei negativen Spannungen eine Gleichrichtung nach innen auf, was auf einen Nettoeinstrom von K+ in die Zelle hinweist, während bei positiven Spannungen nur ein minimaler bis kein Netto-K+-Stromflussvorhanden ist 5. Im Herz-Kreislauf-System sind Kir-Kanäle essentiell für die Stabilisierung des Membranpotentials. Ihre Aktivierung induziert die Hyperpolarisation und Vasodilatation der Zellmembran 12,13,14.

Patch-Clamp-Experimente an frisch isolierten glatten Muskelzellen wurden in verschiedenen Arterien durchgeführt, darunter Koronararterien, Hirn-, Nieren- und Mesenterialarterien15,16. Während einige Methoden die gleiche Art von Kollagenase für die Zellisolierung verwenden, variieren die genauen Verfahren. Nur wenige Studien haben die Methoden zur Isolierung von glatten Gefäßzellen umfassend zusammengefasst. Daher konzentriert sich diese Studie auf die frische Isolierung primärer vaskulärer glatter Muskelzellen aus der Basilararterie der Ratte und die Aufzeichnung von Kir-Kanalströmen in diesen Zellen unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, um Forschern in verwandten Bereichen ein detailliertes und vollständiges Protokoll zur Verfügung zu stellen.

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Protokoll

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Das Tierprotokoll wurde von der Ethikkommission für Labortierschutz der Universität Chengdu (Aktenzeichen 2024035) genehmigt. In dieser Studie wurden männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 260-300 g und einem Alter von 8-10 Wochen verwendet. Die Tiere wurden ad libitum mit Wasser und Futter (SPF-Versuchsfutter) versorgt. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissektion der Basilararterie der Ratte

  1. Vorbereitung der Lösung
    1. Bereiten Sie Lösungen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
  2. Betäuben Sie die Ratte durch Inhalation von 2% Isofluran. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie mit einem Zehenkneifen. Verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche Betäubungsmittel. Fahren Sie sofort damit fort, den Schädel zu öffnen und das Gehirn auf dem tragbaren Operationstisch freizulegen.
  3. Übertragen Sie das Gehirn schnell in eine Petrischale, die PSS enthält, das mit 95 % O2 und 5 % CO2 bei 4 °C gesättigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen pH-Wert von 7,40 hat.
  4. Positionieren Sie das Gehirn ventral nach oben in einer Petrischale und sichern Sie es mit Nadeln. Lokalisieren Sie unter einem Lichtmikroskop die Arteria basilaris und entfernen Sie vorsichtig das umgebende Gewebe mit einer autoklavierten Pinzette und einer Schere (siehe Abbildung 1A).
  5. Führen Sie einen 2 cm langen Draht mit einem Durchmesser von 25 μm in die isolierte Arteria basilaris ein. Reiben Sie die Innenwand vorsichtig mit dem Draht ab, um das Gefäßendothel effektiv zu entfernen.
    HINWEIS: Die Arteria basilaris befindet sich bei Ratten in den basalen Sulci des Hirnstamms an der Basis des Gehirns und wird durch den Zusammenfluss der linken und rechten Wirbelarterien gebildet2. Gehen Sie während des Isolierungsprozesses vorsichtig mit der Arterie um, um übermäßige Dehnung oder Kompression zu vermeiden, die zu Schäden führen könnte.

2. Isolierung der glatten Muskelzellen

  1. 1 ml Zelltrennlösung, 1 ml enzymatisches Hydrolysat I und 1 ml enzymatisches Hydrolysat II in den Reagenzgläsern 1, 2 und 3 auf 37 °C vorwärmen (siehe Abbildung 1B).
  2. Übertragen Sie die isolierte Arteria basilaris in das Reagenzglas 2. Injizieren Sie kontinuierlich ein Gemisch aus 95 %O2 und 5 % CO2 in das Röhrchen und halten Sie die enzymatische Behandlung 30 Minuten lang aufrecht (siehe Abbildung 1C).
  3. Übertragen Sie die Arteria basilaris aus dem Reagenzglas 2 in das Reagenzglas 3. Injizieren Sie weiterhin 95 %O2 und 5 % CO2 in die Sonde und setzen Sie die enzymatische Behandlung 5 Minuten lang fort (siehe Abbildung 1D).
  4. 1 ml 37 °C Zelltrennlösung aus dem Reagenzglas 1 in das Reagenzglas 3 geben. Setzen Sie die Injektion von 95 %O2 und 5 % CO2 fort, während die enzymatische Behandlung 3 Minuten lang aufrechterhalten wird. Zerreiben Sie das Präparat der Arteria basilaris, um Zellen freizusetzen (siehe Abbildung 1E).
  5. Geben Sie 4 °C Trennlösung in das Reagenzglas 3, um den enzymatischen Prozess zu beenden (siehe Abbildung 1F). Die Mischung bei 59 × g 6 min zentrifugieren. Der Überstand wird mit einer Pipette verworfen, die 4 °C-Trennlösung erneut zugegeben (siehe Abbildung 1G) und die Zentrifugation zweimal wiederholt, um die Enzymreste zu entfernen.
  6. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und lagern Sie 1 ml der Zellsuspension bei 4 °C für bis zu 6-8 h.
  7. Nehmen Sie 100 μl der Zellsuspension und legen Sie sie in das Bad (siehe Abbildung 1H). Geben Sie 1 ml extrazelluläre Flüssigkeit in das Bad und lassen Sie die Zellen 40 Minuten lang ruhen, um sich am Boden festzusetzen (siehe Abbildung 2).
    HINWEIS: Bei Zellen der Behandlungsgruppe (z. B. BaCl2 oder Natriumnitroprussid) wird die jeweilige Substanz während der Anheftungszeit 40 Minuten lang bei Raumtemperatur (22-26 °C) vorinkubiert.

3. Aufzeichnung des Kir-Stroms mit einer Ganzzell-Patch-Klemme

  1. Herstellung von Mikropipetten
    1. Schalten Sie den Mikropipettenabzieher ein (siehe Materialtabelle).
    2. Legen Sie ein Glasrohr (Außendurchmesser: 1,5 mm, Innendurchmesser: 1,10 mm, Länge: 10 cm) in den Abzieher. Wählen Sie Programm 1 aus, klicken Sie auf Enter und rufen Sie Programm 1 auf. Führen Sie einen Rampentest durch, indem Sie auf dem Bedienfeld auf Rampe klicken, um den Heizwert des Glasrohrs zu messen.
      HINWEIS: Bearbeiten Sie Programm 1 mit den folgenden Parametern: Wärme: Rampe, Zug: 0, Geschwindigkeit: 25, Verzögerung: 1, Druck: 500, Modus: Verzögerung, Sichere Hitze aktiviert. Der Rampentest muss beim Wechsel von Filamenten oder Glaspipettentypen durchgeführt werden. Mikropipetten sollten einen Spitzendurchmesser von ~1-2 μm und eine Konuslänge von ca. 5 mm haben. Kleinere Spitzendurchmesser und längere Konen führen zu einem höheren Pipettenwiderstand.
    3. Setzen Sie ein neues Glasrohr ein und wählen Sie Programm 1. Klicken Sie auf Enter , um die Mikropipette herzustellen.
  2. Aufnahme von Kir Current
    1. Schalten Sie die Hardwaregeräte nacheinander ein: Digital-Analog-Wandler, Signalverstärker, Mikromanipulator, Mikroskop, Kamera und Computer.
    2. Starten Sie die Software in der folgenden Reihenfolge: Kamera, Signalverstärker und Datenerfassungssoftware.
      HINWEIS: Wenn ein Mikroskop nicht mit einer Kamera ausgestattet ist, muss nur die Gerätesoftware aktiviert werden. Stellen Sie sicher, dass die Software nach der Hardwareinitialisierung geöffnet wird, um die ordnungsgemäße Funktionalität zu ermöglichen.
    3. Wählen Sie in der Datenerfassungssoftware Datei > Datendateinamen festlegen , um einen Datenspeicherpfad einzurichten.
    4. Bearbeiten Sie das Protokoll für die Aufzeichnung von Kir-Strömen wie folgt:
      1. Wellenform-Schnittstelle: Epoche A & D: Typ = Schritt; Erste Stufe = −60 mV; Delta-Pegel = 0 mV; Erste Dauer = 100 ms; Delta-Dauer = 0 ms. Epoche B: Typ = Schritt; Erste Stufe = −160 mV; Delta-Pegel = 0 mV; Erste Dauer = 1 ms; Delta-Dauer = 0 ms. Epoche C: Typ = Rampe; Erste Stufe = 40 mV; Delta-Pegel = 20 mV; Erste Dauer = 500 ms; Delta-Dauer = 0 ms.
      2. Modus/Rate-Schnittstelle: Verzögerung der Testversion = 0 s; Läufe = 1; Sweeps = 1; Sweep-Dauer = 0,8 s.
      3. Ausgänge Schnittstelle: Kanal #0; Haltehöhe = −60 mV. Speichern Sie das Protokoll, und benennen Sie es als "Kir-Protokoll".
        HINWEIS: Die Protokolleinrichtung ist auf bestimmte aktuelle Aufzeichnungen zugeschnitten und kann nach dem Speichern wiederverwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Ausgangsschnittstelle mit der Verkabelung des Instruments übereinstimmt (z. B. Kanal #0).
    5. Aktivieren Sie die Funktion Membrantest im Menü Extras der Datenerfassungssoftware.
    6. Positionieren Sie die Zelle für die Messung in der Mitte der Kameraansicht des Mikroskops.
    7. Tauchen Sie die Referenzdrahtspitze in die Badlösung. Füllen Sie 20 % der Mikropipette (hergestellt in Schritt 3.1) mit der intrazellulären Lösung und befestigen Sie sie auf dem Halter der Aufzeichnungselektrode.
      1. Üben Sie mit einer Spritze einen Überdruck aus, bewegen Sie die Pipettenspitze in die Badlösung und stellen Sie den Pipettenoffset an der Signalverstärkersoftware so ein, dass die Strombasis auf 0 pA eingestellt wird (siehe Abbildung 3A).
        HINWEIS: Verwenden Sie Ag/AgCl-Referenzdrähte. Der Pipettenwiderstand sollte 4-6 MΩ betragen.
    8. Drücken Sie die Pipette vorsichtig gegen die Zellmembran. Es ist eine Erhöhung des Dichtungswiderstands (Rt) auf mindestens 1 MΩ zu beobachten (Abbildung 3B). Entfernen Sie den Überdruck und wenden Sie einen Unterdruck an, um einen hohen Widerstand mit Rt ≥ 1 GΩ herzustellen (Abbildung 3C).
      1. Stellen Sie die Haltespannung auf -60 mV ein und kompensieren Sie die Elektrodenkapazität mit Cp Fast und Cp Slow (Abbildung 3D).
        HINWEIS: Wenn Rt über 1 GΩ bleibt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Andernfalls setzen Sie die Zelle oder Pipette wieder ein und wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 bis 3.2.8.
    9. Üben Sie einen kurzen Unterdruck aus, um die Zellmembran zu durchbrechen und eine Ganzzellkonfiguration zu bilden (Abbildung 3E). Wählen Sie in der Signalverstärkersoftware die Option Ganze Zelle , klicken Sie auf Auto für die Membrankapazitätskompensation (Abbildung 3F), laden Sie das Kir-Protokoll und beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung. Die Schritte 3.2.6 bis 3.2.9 für behandelte Zellen wiederholen.
      HINWEIS: Wenn der Serienwiderstand (Ra) >30 MΩ beträgt, wählen Sie eine neue Zelle aus. Bei 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, vor der Aufnahme eine Serienwiderstandskompensation anwenden. Dieses Protokoll erfordert Ra < 10 MΩ.
  3. Analysieren von Daten
    1. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware und laden Sie die aufgezeichneten Daten. Verwenden Sie Cursor, um aktuelle Kurven zu analysieren und Daten für die Darstellung von I-V-Kurven zu exportieren.
    2. Erstellen Sie ein Stimulus-Wellenformsignal, indem Sie Bearbeiten > Stimulus-Wellenformsignal erstellen auswählen und bestätigen.
    3. Exportieren Sie die Kir-Protokoll-Ablaufverfolgung, indem Sie Edit > Transfer Traces auswählen, den vollständigen Trace-Bereich und das Signal (A0 #0) angeben und die Daten zur weiteren Analyse kopieren.
    4. Exportieren Sie repräsentative Kir-Stromkurven, indem Sie Bearbeiten > Leiterbahnen übertragen, den vollständigen Leiterbahnbereich und das Signal (IN 0) angeben und Daten kopieren, um aktuelle Kurvendiagramme zu erstellen.
      HINWEIS: Normalisieren Sie die Stromdaten anhand der Stromdichte (pA/pF) für einen genauen Vergleich zwischen Zellen unterschiedlicher Größe. Es ist sicherzustellen, dass die Membrankapazität (Cm) während des Experiments aufgezeichnetwird 17.

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Ergebnisse

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Isolierung von arteriellen glatten Muskelzellen
Der erste Abschnitt des Verfahrens beschreibt den Prozess der Isolierung glatter Muskelzellen aus der zerebralen Basilararterie der Ratte. Dieser Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Verfahren umfasst enzymatische Verdauungs- und Zelltrennungsschritte, um glatte Muskelzellen aus der Arterie freizusetzen.

Repräsentative Bilder von isolierten glatten Muskelzellen
Der zweit...

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Diskussion

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Die Ganzzellaufzeichnung mit frisch isolierten Zellen geht auf die frühen 1980er Jahre zurück18, und die Aufzeichnung von Kanalströmen aus basilären glatten Muskelzellen von Nagetieren wurde in den 1990er Jahren weit verbreitet19. Mit dem technologischen Fortschritt konzentrieren sich die Forscher zunehmend auf die Ergebnisse, die durch diese Technologien erzielt werden. Die Aufmerksamkeit, die der Aktualisierung und Zusammenfassung der tec...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Special Talent Program der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für den "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan" (33002324) und das Key Research and Development Project for Introducing High-level Scientific and Technological Talents in Luliang City (2022RC28).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RinderserumalbuminSigma, USAB2064
BariumchloridMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
KameraHamamatsu, JapanC11440
KamerasoftwareImage J, USAMikromanager 2.0.0-gammal
Kollagenase FSigma, USAC7926
Kollagenase HSigma, USAC8051
ComputerLenovo, China~
DatenerfassungssoftwareMolecular Devices, USAClampex 10.4
DatenanalysesoftwareAxon, USAclampfit 10.4
D-GlukoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
Digital-Analog-WandlerMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
ZeichensoftwareSan Diego, Kalifornien, USAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600077
GlasröhreDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
MikromanipulatorSutter, USAMP285A
Mikropipette PullerSutter, USAP1000
MikroskopOlympus, JapanIX73
Na2-ATPSigma, USAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Kalium-D-gluconatSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
SignalverstärkerMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Software für SignalverstärkerMolecular Devices, USAMultiClamp Commander Software
NatriumnitroprussidSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
Statistische AnalysesoftwareSan Diego, Kalifornien, USAGraphPad 

Referenzen

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Einw rtsgleichrichtende Str meZellen der Arteria basilarisKaliumkanalaktivit tWhole Cell RecordingZellmembranpotenzialBariumchlorid InhibitionEffekt von NatriumnitroprussidZellisolierungsprotokoll

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