Extraktion und Charakterisierung des Flavonoids Rutin aus der Traditionellen Chinesischen Medizin Flos sophorae immaturus

Zusammenfassung

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) stellt einen reichen Schatz an natürlichen Behandlungsmöglichkeiten dar und spielt eine wichtige Rolle bei der Erfüllung vielfältiger Gesundheitsbedürfnisse weltweit. Diese Studie stellt eine umfassende experimentelle Untersuchung der Extraktion, Trennung und physikalisch-chemischen Eigenschaften von Rutin, dem wichtigsten Wirkstoff von Flos sophorae immaturus, dar.

Zusammenfassung

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) dient seit langem als reichhaltiger Fundus an natürlichen therapeutischen Lösungen und spielt eine zentrale Rolle bei der Erfüllung unterschiedlicher Gesundheitsbedürfnisse weltweit. Unter den verschiedenen Kräutern, die in der TCM verwendet werden, ist Sophora flavescens für seine vielfältigen medizinischen Eigenschaften bekannt. Seine Anwendung reicht Jahrhunderte zurück und wird in der modernen Medizin nach wie vor hoch geschätzt, insbesondere wegen seines therapeutischen Nutzens bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Rutin, eine bioaktive Flavonoidverbindung, ist im gesamten Pflanzenreich weit verbreitet, wobei die höchste Konzentration in Flos sophorae immaturus zu finden ist. Es wurde berichtet, dass Rutin die abnormale Durchlässigkeit und Zerbrechlichkeit der Kapillaren reduziert und als Schutzmittel für kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Gefäße wirkt. Diese Studie stellt ein detailliertes experimentelles Protokoll für die Extraktion, Trennung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Rutin aus Flos sophorae immaturus vor. Zusätzlich wird das Protokoll zur Extraktion von Flavonoiden aus der TCM mit der Methode der Alkaliextraktion und der sauren Fällung vorgestellt und beschrieben.

Einleitung

Flos sophorae immaturus (FSI), die getrocknete Blütenknospe von Sophora japonica L., ist seit Jahrhunderten ein Grundpfeiler der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM). Zu seinen Hauptwirkstoffen gehören Rutin, Isoquercitrin, Sophorae Flos und andere Flavonoide und Saponine. Diese Bestandteile verleihen zusammen eine Vielzahl von pharmakologischen Wirkungen, wie z. B. die Beseitigung von Hitze und Entgiftung, die Kühlung des Blutes und der Blutstillung sowie die Senkung des Blutdrucks. In der klinischen Praxis wird FSI vor allem für seine Fähigkeit geschätzt, die Kapillarpermeabilität^{zu schützen 1}, die Funktion des Herz-Kreislauf-Systems^{aufrechtzuerhalten 2}, das Blut zu kühlen, Blutungen zu stoppen und das Leberfeuer^{zu regulieren 3}. Seine therapeutischen Eigenschaften werden auf eine hohe Konzentration an Rutin (Quercetin-3-rutinosid) zurückgeführt, einem bioaktiven Flavonoid, das bis zu 20 % bis 30 % seines Trockengewichts ausmacht⁴.

Rutin ist ein Flavonoid, das in Pflanzen weit verbreitet ist. Seine chemische Bezeichnung lautet Que-3-O-rutin (C₂₇H₃₀O₁₆) (Abbildung 1). Bei Raumtemperatur erscheint Rutin als hellgelbes bis gelbgrünes kristallines Pulver. Sein Schmelzpunkt variiert je nach Kristallform und -reinheit und liegt typischerweise zwischen 125 °C und 195 °C. Rutin weist ausgeprägte polare Eigenschaften auf: Es ist schwer löslich in kaltem Wasser, gut löslich in polaren organischen Lösungsmitteln wie Ethanol und Methanol und nahezu unlöslich in unpolaren Lösungsmitteln wie Ether und Chloroform. Darüber hinaus ist seine Löslichkeit pH-empfindlich und nimmt unter alkalischen Bedingungen aufgrund der Dissoziation von phenolischen Hydroxylgruppen, die Natrium- oder Kaliumsalze bilden, deutlich zu. Diese physikalischen Eigenschaften sind eng mit den Polyhydroxyl- und Glykosidgruppen in ihrer Molekularstruktur^{verbunden 5} und beeinflussen direkt den Extraktionsprozess und die Anwendungen in der Medizin, der Lebensmittelindustrie und anderen Industrien⁶. Rutin ist zwar in Pflanzen allgegenwärtig, aber am häufigsten in FSI und weist mehrere pharmakologische Aktivitäten auf, darunter Kapillarstabilisierung⁷, entzündungshemmende, antioxidative^8, antimikrobielle⁹ und metabolische regulatorische Wirkungen¹⁰.

Trotz seines klinischen Potenzials¹¹ stellen die schlechte wässrige Löslichkeit und Stabilität von Rutin eine Herausforderung für die Extraktion und Formulierung^{dar 5}. Um diese Einschränkungen zu beheben, hat sich die Alkali-Extraktions-Säure-Fällungsmethode (AEAP) als effektive Alternative herausgestellt, die das pH-abhängige Verhalten ihrer phenolischen Hydroxylgruppen nutzt.

Basierend auf den physikalischen Eigenschaften von Rutin hat sich die AEAP-Methode zu einer standardisierten Technik zur Isolierung von Rutin aus FSI entwickelt, wobei seine Löslichkeit in alkalischen Lösungen und die anschließende Kristallisation unter sauren Bedingungen genutzt werden¹². AEAP nutzt die pH-schaltbare Ionisation von phenolischen Hydroxylgruppen, um die Ausbeute zu verbessern und eine hochreine Rutin-Extraktion aus FSI zu erreichen. Unter alkalischen Bedingungen (pH >10) deprotonieren phenolische -OH-Gruppen zu hydrophilen -^O-Ionen , die eine vollständige Solubilisierung aus pflanzlichem Gewebe ermöglichen und gleichzeitig den oxidativen Abbau minimieren. Die Ansäuerung auf pH 2-3 kehrt diese Ionisation um und fällt die Zielphenole mit minimaler Co-Präzipitation polarer Verunreinigungen aus. Als Polyphenol mit pH-abhängiger Löslichkeit löst sich Rutin leicht in alkalischen Lösungen (z. B. Natriumhydroxid), fällt aber unter sauren Bedingungen aufgrund der Hydroxylgruppenprotonierung aus. AEAP bietet eine kostengünstige, skalierbare und umweltfreundliche Alternative, die sich an den Prinzipien der grünen Chemie orientiert, indem giftige Lösungsmittel vermieden^{werden 13}. Sie spiegelt einen breiteren Trend in der Naturstoffchemie wider, der pH-gesteuerte Trenntechniken bevorzugt¹⁴. Vergleichbare Methoden werden zur Isolierung von Curcumin (aus Kurkuma) und Berberin (aus Coptis chinensis) eingesetzt, wobei Löslichkeitsänderungen bei bestimmten pH-Werten für die selektive Extraktion genutzt werden. Die AEAP-Methode ist ideal für die ertragreiche Rutinproduktion aus flavonoidreichen Quellen wie FSI, für die nur grundlegende Laborgeräte (z. B. pH-Messgeräte, Zentrifugen) erforderlich sind. Bei pflanzlichen Matrices mit niedrigem Rutingehalt oder komplexen Störverbindungen kann in Zukunft eine enzymatische Hydrolyse-Vorbehandlung in Betracht gezogen werden, um die Extraktionseffizienz zu erhöhen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass AEAP einen bequemen Ansatz für die Rutinextraktion darstellt, der Wirksamkeit, Sicherheit und Skalierbarkeit in Einklang bringt. Seine Rolle bei der Modernisierung der TCM unterstreicht sein Potenzial, traditionelle Praktiken mit zeitgemäßen pharmazeutischen Standards zu verbinden.

Protokoll

Rutin ist ein Flavonoid, das mehrere phenolische Hydroxylgruppen enthält und in heißen alkalischen Lösungen löslich ist, gefolgt von Ansäuerung und Ausfällung. Es kann mit dem Alkali-Extraktions-Säure-Fällungsverfahren extrahiert werden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Besorgen Sie sich folgende Materialien: Flos sophorae immaturus (20 g), Borax (0,8 g), mehrere Becher, Kalkpulver (1,5 g), konzentrierte Salzsäure, Thermometer und pH-Teststreifen. In Abbildung 2 finden Sie eine größere Version dieses Bildes.

2. Extraktion von Rutin

HINWEIS: Verwenden Sie ein Borax-Wasser-Verhältnis von 0,8 g Borax zu 200 ml Wasser. Verwenden Sie ein Limettenmilchverhältnis von 1,5 g Limettenpulver zu 10 ml Wasser. Stellen Sie den pH-Wert schnell und genau ein. Füllen Sie verlorenes Wasser nach Bedarf auf.

1. Alkali-Extraktion
   HINWEIS: Filtern Sie mit 6 cm rundem Filterpapier.
   1. Geben Sie 250 mL Wasser und 0,8 g Borax in ein 500 mL Becherglas. Zum Kochen bringen, dann 20 g Flos sophorae immaturus hinzufügen. 2-3 Min. weiterkochen.
   2. Nach dem Kochen den pH-Wert mit Limettenmilch unter Rühren auf 8-9 einstellen. 20 Min. weiter heizen. Im heißen Zustand durch die Gaze filtrieren, um ein gelb-braunes Filtrat zu erhalten.
2. Extraktion von saurer Fällung
   1. Stellen Sie den Extrakt mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2-3 ein und lassen Sie ihn absetzen. Der Wechsel von einer klaren gelbbraunen Lösung zu einer trüben Lösung zusammen mit der allmählichen Bildung von orange-gelbem Flockungsniederschlag am Boden des Behälters deutet auf eine effektive Rutinabscheidung hin.
   2. Nach 6 Stunden Standzeit den Niederschlag einer Atmosphärendruck-Saugfiltration aussetzen. Sammeln und trocknen, um rohes Rutin zu erhalten.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Filterfolie entsprechend der verwendeten Brinell-Trichtergröße (150 mm Durchmesser) ab.
   3. Waschen Sie den Niederschlag während der Atmosphärendruck-Saugfiltration mit Wasser, bis er neutral ist.

3. Raffination von Rutin

1. Nach dem Grobwiegen wird Rutin mit heißem Wasser bei einem Löslichkeitsverhältnis von 1:200 rekristallisiert. Die wässrige Lösung 30 min kochen und heiß filtrieren. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen der Rutinlösung 210 ml beträgt.
2. Filtern Sie die Rückstände heraus. Lassen Sie das Filtrat ungestört stehen, filtrieren Sie erneut und trocknen Sie es unter Vakuum in einem Ofen bei 60-70 °C, um raffiniertes Rutin zu erhalten (Abbildung 3).
   HINWEIS: Schneiden Sie die Filterfolie entsprechend der verwendeten Brinell-Trichtergröße (150 mm Durchmesser) ab.

4. Physikalisch-chemische Identifizierung von Rutin

1. Hydrochlorid-Magnesiumsalz-Reaktion - Identifizierung von Flavonoid-Elternkernen
   1. 1-2 mL der Probe werden in Methanol aufgelöst und 50 mg Magnesiumpulver hinzugefügt.
   2. Fügen Sie ein paar Tropfen konzentrierte Salzsäure hinzu. Leicht schütteln. Die Lösung sollte rot werden (Abbildung 4).
2. Molische Reaktion - Identifizierung von Zuckerverbindungen
   1. Fügen Sie eine 10%ige Ethanollösung aus α-Naphthol hinzu und schütteln Sie. Kippen Sie das Reagenzglas und fügen Sie konzentrierte Schwefelsäure vorsichtig tropfenweise entlang der Innenwand hinzu.
   2. Beobachten Sie die Bildung eines braunen Rings an der Grenzfläche (Abbildung 5).
3. Greening Zirkonoxid-Zitronensäure-Reaktion
   1. Geben Sie 1-2 ml 10%ige α-Naphthhollösung in die Ethanollösung der Probe. Gut schütteln. Geben Sie langsam 10 Tropfen konzentriertes H₂SO₄ entlang der Wand der Tube, ohne zu schütteln.
   2. 2%ige Zitronensäure-Methanollösung zugeben. Die Farbe der Lösung sollte heller werden (Abbildung 6).
4. Unterscheidung zwischen dünnen Schichten
   1. Verwenden Sie sowohl das raffinierte Rutin als auch den Rutin-Standard.
   2. Als Entwicklungsmittel wird Chloroform:Methanol:Ameisensäure (15:5:1) und als chromogenes Mittel 1%ige Ethanollösung von AlCl₃ verwendet. Beobachten Sie die Fluoreszenz unter einer UV-Lampe bei 365 nm.

5. TLC-Untersuchung von Rutin

HINWEIS: Zur Bewertung der Reinheit von Rutin wurde eine Methode der Dünnschichtchromatographie (DC) eingesetzt. Als stationäre Phase wurde eine Kieselgelplatte verwendet.

1. Die raffinierte Rutinprobe und den Rutinstandard (1 mg/ml in Methanol) auf die Platte geben. Entwickeln Sie die Platte in einer mobilen Phase, bestehend aus Ethylacetat:Ameisensäure:Wasser (8:1:1, v/v/v).
2. Visualisieren Sie die Platte nach dem Trocknen unter UV-Licht bei 254 nm.
3. Berechnen Sie den Retentionsfaktor (Rf) des Probenflecks und vergleichen Sie ihn mit dem Standard.
   HINWEIS: Ein einzelner Fleck mit einem identischen Rf-Wert (ca. 0,35-0,50 unter diesen Bedingungen) weist auf eine hohe Reinheit hin, während zusätzliche Flecken auf das Vorhandensein von Verunreinigungen hinweisen.

6. Bestimmung der Rutinreinheit durch HPLC

HINWEIS: Die Reinheit von Rutin wurde quantitativ mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Die Analysebedingungen waren wie folgt: Chromatographische Säule - (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobile Phase-Acetonitril (A) und 0,2%ige Essigsäure wässrige Lösung (B). Lineares Gradienten-Elutionsprogramm: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Durchflussrate-1 mL/min. Injektionsvolumen-10 μL. Detektionswellenlänge-355 nm. Temperatur der Säule-40 °C.

1. Wiegen Sie 0,1 g Rutin-Probenpulver genau ab und geben Sie es in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 5,0 ml 60%ige Ethanollösung hinzu und schütteln Sie sie gründlich.
2. Stellen Sie das Wasserbad oder den Säulenofen mit konstanter Temperatur auf 30 °C ein und beschallen Sie die Probe 30 Minuten lang.
3. Die Probe wird bei 55.900 × g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwenden Sie den Überstand als Testlösung für die HPLC-Analyse.

7. Bestimmung von Rutin mittels LC-MS

HINWEIS: Die isolierten Verbindungen wurden mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) identifiziert. Die LC-Bedingungen stimmten mit der HPLC-Methode überein. Die Massenspektrometrie wurde mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) im negativen Ionenmodus mit einer Kapillarspannung von 3,5 kV durchgeführt. Desolvatisierungstemperatur -350 °C; Messbereich - M/Z 100-1000.

1. Wiegen Sie 10 mg der gereinigten Rutinprobe und geben Sie sie in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 0,6 ml deuteriertes DMSO mit einer Pipette hinzu, bis die Probe vollständig aufgelöst ist. Bereiten Sie Rutin-Standardlösungen nach dem gleichen Verfahren vor.
2. Analysieren Sie die behandelten Proben und Standards mit Hilfe der Protonenkernspinresonanzspektroskopie (¹H NMR).
3. Verarbeiten Sie die Spektraldaten mit kompatibler Software¹⁵.
4. Vergleichen Sie die Spektraldaten zur Verifizierung mit Literatur- oder Datenbankreferenzen wie NIST oder PubChem.

Ergebnisse

Im physikalisch-chemischen Identifizierungsexperiment von Rutin färbte sich die Lösung nach Zugabe von Magnesiumpulver und einer kleinen Menge konzentrierter Salzsäure rot, gefolgt von Schütteln, was auf das Vorhandensein eines Flavonoid-Elternkerns hinweist. Bei der Molisch-Reaktion bildete sich an der Grenzfläche ein violetter Ring, der auf ein positives Ergebnis und das Vorhandensein von Zuckeranteilen in der Molekülstruktur hinweist. Die Probenlösung färbte sich nach Zugabe von 2 % Chloroxidationsreagenz in Methanol ...

Diskussion

Die Extraktion von Rutin basiert in erster Linie auf der Alkali-Extraktions-Säure-Fällung (AEAP) Methode⁶, die die Vorteile einfacher Geräteanforderungen, einfacher Bedienung, hoher Effizienz und niedriger Kosten bietet. Diese Technik wird häufig durch die mikrowellengestützte Extraktion (MAE)⁷ und die ultraschallgestützte Extraktion (UAE)⁸ ergänzt, die den Reagenzienverbrauch reduzieren, die Extraktionszeit verkürze...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Naphthol	MACKLIN	C16245764
Essigsäure	MACKLIN	C12662811
Acetonitril	MACKLIN	C16129374
Aluminiumchlorid	MACKLIN	C16485922
Zitronensäure	MACKLIN	C16429480
DMSO	FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD	20230306
Ethanol	FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD	20250102
Ethylacetat	FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD	20240318
Flos sophorae immaturus	Beijing Tongrentang	10092026329782
Ameisensäure	FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD	20150402
‌ MestReNova	Mestrelab-Forschung	/
Methanol	innochem	C16365684
Silikagel 60F254	STEEMA	20210222
Xcalibur	Thermo Fisher Scientific	/
Zirkonylchloridokthydrat	MACKLIN	C15350627