Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Zusammenfassung

Die translationale Kontrolle verschiedener Gene unter Hitzestress ist ein entscheidender Schritt für die Anpassung der Pflanzen an die Umwelt. Die Bewertung der translationalen Aktivitäten verschiedener Gene kann uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen zugrunde liegen, und zur Entwicklung von Nutzpflanzen mit erhöhter Stresstoleranz angesichts des globalen Klimawandels beitragen. In diesem Artikel wird eine detaillierte Methodik zur Bewertung der Translationseffizienz durch Polysomen-Profiling in Pflanzen vorgestellt, die Hitzestress ausgesetzt sind. Das Verfahren gliedert sich in drei Teile: Hitzestressbehandlung für Arabidopsis, Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen und Berechnung der Translationseffizienz durch Isolierung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA auf der Grundlage des Profils. Im ersten Teil werden Arabidopsis-Pflanzen kontrollierten Hitzestressbedingungen ausgesetzt, um Umwelteinflüsse nachzuahmen. Bei der Behandlung werden die Pflanzen für eine bestimmte Zeit hohen Temperaturen ausgesetzt, um eine konsistente und reproduzierbare Spannungsinduktion zu gewährleisten. Dieser Schritt ist entscheidend, um die physiologischen und molekularen Reaktionen der Pflanze auf Hitzestress zu untersuchen. Der zweite Teil befasst sich mit dem Test der Übersetzungseffizienz mittels Polysomenprofiling. Polysomen werden durch Saccharosegradientenzentrifugation extrahiert, bei der mRNAs basierend auf ribosomaler Beladung getrennt werden. Dies ermöglicht die Untersuchung der Ribosomenbelegung auf mRNAs und gibt Einblicke in die translationalen Kontrollmechanismen unter Stressbedingungen. Im dritten Teil wird RNA sowohl aus polysomalen als auch aus nicht-polysomalen Fraktionen isoliert. Spike-in-RNA wird verwendet, um die Menge an RNA in jeder Fraktion genau zu messen. Die Berechnung der Translationseffizienz erfolgt durch den Vergleich der Verteilung von mRNAs über diese Fraktionen unter Normal- und Hitzestressbedingungen. Die Translationsaktivitäten spezifischer Gene werden durch quantitative real-time PCR (qRT-PCR) mit Ribosomen-assoziierter RNA und Gesamt-RNA weiter bewertet. Diese Methodik konzentriert sich ausschließlich auf die Auswirkungen von Hitzestress und bietet ein detailliertes Protokoll zur Analyse der translationalen Regulation in Pflanzen.

Einleitung

Die Translation ist für Organismen von entscheidender Bedeutung, um funktionelle Proteine aus mRNA zu synthetisieren, die essentielle zelluläre Funktionen und biologische Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung unterstützen und Stressreaktionen ermöglichen. Ohne Translation können Zellen keine lebenswichtigen Proteine produzieren, was sich auf ihre Struktur, Funktion und Regulation auswirkt und dadurch die Erhaltung des Lebens und die Förderung der biologischen Vielfalt beeinträchtigt ^1,2. Daher ist die Untersuchung der translationalen Effizienz von Pflanzen von entscheidender Bedeutung. Die Übersetzung umfasst mehrere wesentliche Schritte. Zunächst erfolgt die Initiation, wenn mRNA an ein Ribosom bindet, was durch Initiationsfaktoren wie eIFs in Eukaryoten erleichtert wird, die das Startcodon, typischerweise AUG, identifizieren. Als nächstes verläuft die Elongation, indem Transfer-RNA (tRNA)-Moleküle, die jeweils spezifische Aminosäuren tragen, nacheinander an das Ribosom binden. Zwischen benachbarten Aminosäuren bilden sich Peptidbindungen, die die Polypeptidkette entsprechend der mRNA-Sequenz verlängern. Schließlich wird die Terminierung eingeleitet, wenn auf ein Stoppcodon (UAA, UAG oder UGA) trifft, das durch Freisetzungsfaktoren erkannt wird, die das Ribosom dazu veranlassen, das neu synthetisierte Protein freizusetzen. Während der Translation arbeiten verschiedene eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs), Elongationsfaktoren und ribosomale RNAs zusammen, um Genauigkeit und Effizienz zu gewährleisten ^3,4.

Frühere Studien haben gezeigt, dass posttranslationale Modifikationen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Interaktionen zwischen eIFs spielen und damit die Translationseffizienz beeinflussen. In-vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass CASEIN-KINASE-2 (CK2)-Kinase eIF3c, eIF5 und eIF2β phosphoryliert, um ihre Wechselwirkungen untereinander und mit eIF1 zu verstärken ^5,6. Im Dunkeln unterdrückt die E3-Ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) die Translation, indem sie die TOR-vermittelte Phosphorylierung von S6K-RPS6 hemmt. Das nicht-phosphorylierte RPS6 ist nicht in der Lage, funktionelle Ribosomen zu bilden, wodurch die Translation gestoppt^{wird 7}. Umgekehrt phosphoryliert die Suppressor of Phya 105 (SPA1)-Kinase unter Lichtbedingungen eIF2α, um den eIF2-Komplexaufbau zu erleichtern und die Translationsinitiierung^{zu fördern 8}. Diese Ergebnisse unterstreichen die komplexen Kontrollmechanismen, die die Translation als Reaktion auf Umweltsignale regulieren.

Moderate Umweltreize können translationale Prozesse zur Erleichterung des Wachstums effektiv fördern, wie z. B. die Photomorphogenese ^8,9. Wenn jedoch die Umweltfaktoren übermäßig stark sind, müssen immobile Pflanzen geeignete Regulationsmechanismen entwickeln, um die durch Umweltstress verursachten Schäden zu mildern¹⁰. In früheren Studien, die sich mit pflanzlichen Stressreaktionen befassten, konzentrierte sich die Mehrheit auf die Regulation auf metabolischer, hormoneller und transkriptioneller Ebene 11,12,13,14. Neuere Forschungen haben jedoch begonnen, den Einfluss der translationalen Regulation auf die Stresstoleranz von Pflanzen hervorzuheben 15,16,17. Pflanzen können ihre Stresstoleranz erhöhen, indem sie die Translationseffizienz reduzieren und so unnötigen Energieverbrauch minimieren. Aufgrund der Bildung von nicht-membranösen Stressgranula in Pflanzenzellen aggregieren untranslatierte mRNA und assoziierte Proteine in ihnen, um die Translationseffizienz zu verringern¹⁸. Einer der häufigsten Umweltstresse, denen Pflanzen häufig ausgesetzt sind, ist Hitzestress, von dem berichtet wurde, dass er die Bildung von Stressgranulaten in Pflanzenzellen induziert^19,20. Der weltweite Anstieg der Durchschnittstemperaturen aufgrund der globalen Erwärmung wirkt sich stark auf die Ernteerträge^{aus 21}. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die physiologische Regulation von Pflanzen unter Hitzestress zu untersuchen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Wärmebehandlung von Weizen zu einer Abnahme der polysomengebundenen mRNA führte. In Stressgranula gespeicherte mRNAs wurden jedoch freigesetzt und wieder an Ribosomen gebunden, was die Translation nach der Genesung erleichterte²². Darüber hinaus wurde in früheren Forschungen die Genexpression zwischen gesamter mRNA und polysomgebundener mRNA in submersen Pflanzen verglichen¹⁶. Die Ergebnisse zeigten, dass die Steady-State-Spiegel von mRNA, die mit Abscisinsäure und abiotischen Stressantworten assoziiert sind, nach dem Untertauchen leicht anstiegen. Darüber hinaus nahm die Menge an polysomengebundenen mRNAs deutlich zu. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Translationsregulation eine wichtigere Rolle bei der Kontrolle der Stresstoleranz in Pflanzen spielen könnte. Daher ist eine effektive Methode zur Isolierung polysomaler RNA entscheidend für die Untersuchung des Translatoms von stressbehandelten Proben.

In diesem Protokoll haben wir die RNA-Isolierungsmethode von der risikoreichen und voluminösen Phenol/Chloroform-Extraktion mit der LiCl-Fällungsmethode auf die kleinskalige Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsmethode modifiziert, die weniger Volumen benötigt. Die erste Methode beinhaltet das direkte Mischen mit polysomalen Fraktionen, was zu einem größeren Versuchsabfall führt ^9,15,23. Im Gegensatz dazu nutzt dieser modifizierte Ansatz das Prinzip der differentiellen Dichte: Polysomale RNA wird zunächst mit einer salzreichen, zuckerfreien Lösung gemischt und dann durch Ultrazentrifugation gefällt. Anschließend wird die RNA-Extraktion unter Verwendung eines kleinen Volumens des Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Reagenzes durchgeführt. Diese Methode reduziert effektiv die Entstehung von organischem Abfall und macht unser Experiment umweltfreundlicher. Darüber hinaus weisen die verwendeten organischen Lösungsmittel eine geringere Toxizität auf. Diese Gründe haben uns dazu bewogen, die Versuchsverfahren entsprechend anzupassen und zu verbessern. Darüber hinaus lieferten frühere Methoden kein umfassendes Protokoll zur Berechnung der Translationseffizienz mithilfe der Spike-in-Normalisierung, die für tiefergehende translatomare Analysen unerlässlich ist.

Hier beschreiben wir das Polysomen-Profiling und das polysomale RNA-Isolierungsprotokoll zur Untersuchung der Translationseffizienz und translatomare Analysen in Arabidopsis unter Hitzeschockstress. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Translationseffizienz im Col-0-Wildtyp unter Normal-, Hitzeschock- und Nacherholungsbedingungen zu bewerten. Die Ergebnisse der Polysomen-Profilierung und der prozentuale Anteil an polysomaler RNA zeigten Veränderungen in der Translationseffizienz nach Hitzestressbehandlung bei Arabidopsis-Sämlingen .

Protokoll

1. Vorbereitung der mit Hitze behandelten Arabidopsis-Sämlinge

1. Platten 250 Samen für jedes Replikat und jeden Zustand mit einer Pipette auf das Filterpapier legen, das auf die Agarplatte des Basalmediums Murashige und Skoog (MS) ohne Saccharose (pH 5,6) gelegt wird, ergänzt mit 1,2 % Phytoagar.
   HINWEIS: Um Sämlinge auf MS-Platten zu pflanzen, wird steriles Filterpapier auf die Platte gelegt, um zu verhindern, dass die Sämlingswurzeln tief in das Medium eindringen, was die Probenahme erleichtert. Anschließend werden die Samen auf das Filterpapier gepflanzt. Um den Einfluss von Zuckern auf das Pflanzenwachstum und die Versuchsergebnisse auszuschließen, wird empfohlen, für den Anbau ein MS-Medium zu verwenden, das keine Saccharose enthält.
2. Wickeln Sie die MS-Platte mit den gepflanzten Samen mit Alufolie ein, um das Licht zu blockieren, und inkubieren Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C, um die Vernalisation zu induzieren.
3. Bringen Sie die vernalisierten Samen in eine Wachstumskammer, die unter einer 16 h: 8 h, Hell-Dunkel-Photoperiode bei 22 °C und einer Lichtintensität von 100 μmol/m²/s angebaut wird.
4. Für Hitzestressproben verschließen Sie die MS-Medium-Platten mit 5 Tage alten Sämlingen mit wasserfestem Klebeband und legen Sie sie für 1 h in ein 40 °C warmes Wasserbad.
5. Bei Proben, die sich nach der Wärmebehandlung erholen, kühlen Sie die Platten sofort nach der Wärmebehandlung ab. Legen Sie sie anschließend für 2 h in eine Wachstumskammer bei 22 °C.
6. Ernten Sie 250 behandelte oder unbehandelte Sämlinge in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Replikat und frieren Sie die Proben sofort in flüssigem Stickstoff ein.
   HINWEIS: Für jede Bedingung wurden zwei Gruppen von Proben vorbereitet. Einer ist für die Polysomen-Profiling-Analysen und der andere für die nicht-polysomale und polysomale RNA-Extraktion.

2. Vorbereitung des Saccharose-Gradienten

1. Bereiten Sie die Gradientenlösung vor, die die folgenden Saccharosekonzentrationen enthält: 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % und 60 %. Die Lösungszusammensetzung umfasst 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 100 μg/mL Heparin und 50 μg/mL Cycloheximid (CHX).
2. Laden Sie die Gradientenlösungen von hoher zu niedriger Konzentration, beginnend von unten nach oben. Nach jeder Zugabe jeder Konzentration der Gradientenlösung frieren Sie die Lösung in einen festen Zustand ein, bevor Sie die nächste Konzentration hinzufügen. Fügen Sie für jede Konzentration des Saccharosegradienten 2,2 ml hinzu. Dieser Prozess führt zu einem diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten.
3. Lagern Sie den vorbereiteten Saccharosegradienten vorübergehend bei -80 °C und tauen Sie ihn vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C auf.

3. Probenvorbereitung für die Polysomenprofilierung

1. Mahlen Sie 250 5 Tage alte Col-0-Sämlinge, ob hitzegestresst oder unbehandelt, die zuvor mit einem Homogenisator mit einer Frequenz von 30 Zyklen/s für 1 Minute zu Pulver eingefroren wurden.
   HINWEIS: Wenn die Anzahl der Pflanzen mit gleichem Hintergrund gleich ist, haben sie die gleiche RNA-Extraktionsausbeute. Beim Vergleich von überexprimierenden transgenen oder mutierten Pflanzen mit unterschiedlichem Hintergrund sollte die Menge der verwendeten Pflanzen jedoch entsprechend den Pflanzenbedingungen angepasst werden.
2. Um eine Extraktionslösung zu erhalten, die nicht-polysomale und polysomale RNA enthält, geben Sie 500 μl Polysomen-Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg/ml Cycloheximid, 100 μg/ml Heparin, 2 % PTE, 10 % DOC, 400 U/ml Ribonuklease-Inhibitor) in jedes Röhrchen und mischen Sie die Proben durch Invertieren und Vortexen. Stellen Sie sicher, dass die Proben während des gesamten Prozesses bei 4 °C gehalten werden.
3. Die Extraktionslösung bei 4 °C, 12.000 x g für 10 min zentrifugieren. Filtrieren Sie dann den Überstand durch ein 100-μm-Zellsieb, um eine klare und partikelfreie Extraktionslösung zu erhalten.
   HINWEIS: Die in der Extraktionslösung vorhandenen Partikel können während der Ultrazentrifugation sedimentieren und möglicherweise ein Pellet bilden, das die Genauigkeit von Polysomen-Profilmessungen beeinträchtigen könnte.
4. Der gefilterte Überstand wird auf einen vorbereiteten Saccharosegradienten geladen und sichergestellt, dass er das Gleichgewicht erreicht.
   HINWEIS: Aufgrund der hohen Drehzahl der Ultrazentrifuge ist es wichtig, sowohl die Sicherheit als auch die ordnungsgemäße Funktion der Ultrazentrifuge zu gewährleisten. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, vor der Rotation zu bestätigen, dass die Probengewichte identisch sind. Daher verwenden wir eine Präzisionswaage, um zu überprüfen, ob die Gewichte der Gradienten völlig gleichmäßig sind.
5. Der mit Proben beladene Saccharosegradient wird bei 4 °C, 210.000 x g , 3,5 h lang mit einem Ultrazentrifugen-Ausschwingrotor zentrifugiert. Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsraten auf das Maximum ein. Nach der Ultrazentrifugation werden nicht-polysomale und polysomale RNA entsprechend ihrer Dichte in der entsprechenden Saccharose-Gradientenlösung verteilt.
   HINWEIS: Im Saccharosegradienten verteilt sich nicht-polysomale RNA mit geringerer Dichte in der oberen Schicht, während polysomale RNA, die durch eine höhere Dichte aufgrund des Vorhandenseins zahlreicher Ribosomen gekennzeichnet ist, die an der aktiven Translation auf mRNA beteiligt sind, in der unteren Schicht verteilt. Anschließend kann die Polysomenprofilierung mit Hilfe eines Dichtegradientenfraktionators gemessen werden.

4. Analyse der Polysomen-Profilerstellung

HINWEIS: Zur Messung der Polysomenprofilierung wird ein Dichtegradientenfraktionator mit einer Mikrovolumenspritzenpumpe verwendet.

1. Bereiten Sie die Chase-Lösung (70 % Saccharose, 10 % Glycerin und 0,02 % Bromophenolblau) für die Mikrovolumen-Spritzenpumpe vor.
2. Verwenden Sie eine Software, um den Dichtegradientenfraktionator zu steuern. Kalibrieren Sie die Maschine mit entionisiertem Wasser. Verwenden Sie es nach der Kalibrierung, um Polysomenprofile durchzuführen.
   1. Um die Grundlinienanpassung durchzuführen, schalten Sie den UV/VISDetector ein, bis das Licht von rot auf grün wechselt. Stellen Sie den Drehregler " Recorder Offset" ein, um die Markierungslinie auszurichten, und drehen Sie dann den Drehregler " Baseline Adjust " auf die minimale offene Position. Stellen Sie den Empfindlichkeitsregler am UV/VIS-Detektor auf Stufe 2.0 und drücken Sie die Auto Baseline-Taste . Verwenden Sie abschließend den Recorder-Offset-Regler , um die gewünschte Grundlinie auf 20 einzustellen. Der kalibrierte Prozess variiert je nach Marke des Mechanismus und verschiedenen Proben.
3. Nach der Ultrazentrifugation legen Sie die Röhrchen mit den Proben mit dem Röhrchendurchstechsystem auf den Dichtegradientenfraktionator, damit das Röhrchen mit der Spritzenpumpe mit der Spritzenlösung und dem UV-Detektor verbunden werden kann.
4. Schalten Sie den Dichtegradientenfraktionator in den Software-Steuerungsmodus (REMOTE) und stellen Sie die Injektionsflussrate der Mikrovolumen-Spritzenpumpe auf 3 mL/min ein.
5. Initiieren Sie die Softwareeinstellungen, um das Polysomenprofildiagramm mit dem Fraktionator zu beginnen und zu erhalten, indem Sie OD₂₅₄ messen.

5. Isolierung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA

HINWEIS: Für diesen Teil des Protokolls wurde eine andere Gruppe von Proben aus derselben Charge verwendet, nachdem die Ultrazentrifugation mit den gleichen Schritten wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde.

1. Basierend auf den Messergebnissen des Polysomenprofils wird die nicht-polysomale und die polysomale RNA-Fraktion getrennt gesammelt. Berechnen Sie das Lösungsvolumen sowohl für die nicht-polysomale als auch für die polysomale Fraktion und sammeln Sie die nicht-polysomale Fraktion (oberer Teil).
   HINWEIS: Gemäß den Profilen wird die Fraktion mit mehr als zwei Ribosomen als polysomale Fraktion definiert, während die Fraktion mit den rRNA-Peaks 40S, 60S und 80S als nicht-polysomale Fraktion definiert ist.
2. Mischen Sie die Zielfraktionen der RNA gründlich mit vorkalter 2x hoher Salzlösung (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Fügen Sie 8 μl verdünnte Brühe Eukaryotic Poly-A RNA Control aus dem Kit hinzu.
   HINWEIS: Für die Spike-In-Normalisierung, die für den siebten Schritt erforderlich ist. Das Eukaryotische Poly-A RNA Control Kit enthält B. subtilis-Gene , wie z. B. das DAP-Gen , die in Pflanzen nicht vorkommen, als Referenzgene. Um den Anteil des Referenzgenverlusts während der Reaktion nach der Extraktion zu bestimmen, geben Sie vor der Extraktion eine gleiche Menge des Reagenzes, das die RNA-Probe des DAP-Gens enthält, in verschiedene Röhrchen mit nicht-polysomaler oder polysomaler RNA. Dies ermöglicht die Bestimmung des Anteils des Referenzgenverlusts während der Reaktion nach der Extraktion und kann zu Normalisierungszwecken verwendet werden.
4. Die mit hoher Salzlösung gemischte RNA wird 5 h lang bei 4 °C, 450.000 x g, mit einem Ultrazentrifugen-Ausschwingrotor zentrifugiert.
5. Nach der Ultrazentrifugation fällt die RNA am Boden des Zentrifugenröhrchens aus. Gießen Sie den Überstand vorsichtig von oben ab, um das RNA-Kügelchen am Boden zu erhalten.
6. Waschen Sie das RNA-Pellet schnell mit 500 μl vorkaltem, mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser und wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
   HINWEIS: Um zu verhindern, dass DEPC-behandeltes Wasser die RNA während des Waschvorgangs wieder auflöst, muss das DEPC-behandelte Wasser vor der Verwendung vorgekühlt werden, um seine Löslichkeit zu verringern. Zusätzlich soll die Kontaktzeit zwischen dem DEPC-behandelten Wasser und dem RNA-Pellet während des Waschens minimiert werden.

6. Extraktion nicht-polysomaler und polysomaler RNA

1. Fügen Sie 500 μl RNA-Extraktionsreagenz hinzu und mischen Sie es mit der zu extrahierenden RNA-Probe. 10 Min. inkubieren.
2. Fügen Sie 100 μl Chloroform hinzu, mischen Sie es gründlich und inkubieren Sie es 10 Minuten lang für die Phasentrennung.
3. Das Reaktionsgemisch bei 4 °C, 12.000 x g für 10 min zentrifugieren. Die obere durchsichtige wässrige Schicht, die die RNA enthält, wird in ein neues Röhrchen überführt, vorsichtig mit dem gleichen Volumen Isopropanol gemischt und 2 Stunden lang bei -20 °C für die RNA-Fällung inkubiert.
4. Nach der Fällung bei 4 °C, 12.000 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und belassen Sie das RNA-Kügelchen am Boden.
5. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 mL vorkaltem 75%igem Ethanol. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C, 12.000 x g , entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft.
6. Sobald das RNA-Pellet getrocknet ist, resuspendieren Sie das RNA-Pellet in 30 μl DEPC-behandeltem Wasser und messen Sie die RNA-Konzentration (OD₂₆₀) mit einem Vollspektrum-Spektrophotometer (220 nm-750 nm).

7. Spike-in-Normalisierung

1. Verwenden Sie 1000 ng extrahierte RNA für die reverse Transkription, die mit einem qPCR-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wird. Sowohl nicht-polysomale als auch polysomale RNA müssen in cDNA revertiert werden.
2. Mischen Sie 1 μl cDNA mit DAP-Genprimern und verwenden Sie SYBR-Puffer, um das Expressionsniveau des Zielgens gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Verwenden Sie als Nächstes die Echtzeit-PCR, um die DAP-Genexpression nachzuweisen.
   HINWEIS: Die Sequenzen der Primer des DAP-Gens lauten wie folgt:
   Vorwärts Fibel = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Reverse primer = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Vergleichen Sie die Expressionsniveaus von DAP-Genen in den gemessenen nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Gruppen und schätzen Sie den RNA-Gehalt unter Bedingungen des proportionalen Verlusts. Berechnen Sie anhand des normierten RNA-Gehalts das Verhältnis der RNA in den Polysomen.

Ergebnisse

Der Wildtyp von Arabidopsis, Col-0, wurde auf MS-Medium unter einer Lichtphotoperiode von 16 h:8 h gezüchtet. Zur Kontrolle wurden 5 Tage alte Sämlinge ohne Hitzestressbehandlung verwendet. Die Hitzestressgruppe wurde 1 h lang einer Wärmebehandlung bei 40 °C in einem vorgewärmten Wasserbad unterzogen, während die Erholungsgruppe unmittelbar nach der Wärmebehandlung 2 h lang bei 22 °C behandelt wurde. Durch den Einsatz unterschiedlicher Wärmebehandlungsbedingungen und Rückgewinnungsbedingungen können wir nachfolgende Schritte nutzen, um ihre translationale Effizienz zu messen.

Vor der RNA-Extraktion muss zunächst der Saccharosegradient vorbereitet werden. Um die nicht-polysomale und polysomale RNA anhand ihres Dichteunterschieds zu trennen, stellten wir eine Gradientenlösung mit Saccharosekonzentrationen von 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % und 60 % her. Dann luden wir die Gradientenlösungen von hoher zu niedriger Konzentration, beginnend von unten (Abbildung 1A). Anschließend können wir diesen Gradienten nutzen, um die nicht-polysomale RNA mit niedrigerer Dichte in der oberen Schicht zu trennen, während die polysomale RNA mit höherer Dichte in der unteren Schicht mit höheren Saccharosekonzentrationen verteilt wird. Die nicht-polysomale und polysomale RNA wurden aus dem behandelten oder unbehandelten Col-0 extrahiert. Um zu verhindern, dass Partikel in der Lösung die Ergebnisse der Polysomen-Profiling-Analyse beeinflussen, sollte die RNA-haltige Lösung durch ein Zellsieb filtriert werden, um eine partikelfreie Extraktionslösung zu erhalten. Der filtrierte Überstand wurde auf einen vorgefertigten Saccharosegradienten geladen und äquilibriert. Nach der Ultrazentrifugation von Saccharosegradienten beladenen Proben wurden die nicht-polysomale und polysomale RNA entsprechend der Dichte innerhalb des Saccharosegradienten verteilt. Anschließend wurde die Polysomenprofilierung mit einem Dichtegradientenfraktionator durchgeführt (Abbildung 1B). Der Dichtegradientenfraktionator wird mit Hilfe einer Software gesteuert, die zunächst mit deionisiertem Wasser kalibriert wurde. Nach der Kalibrierung werden die Proben nach der Ultrazentrifugation auf den Fraktionator geladen. Im Softwaresteuerungsmodus injiziert die Mikrovolumen-Spritzenpumpe Saccharoselösung mit Konzentrationen, die höher als der Saccharosegradient sind, in den Gradienten und drückt die Probe. Auf diese Weise kann die Messung am oberen Rand des Saccharosegradienten beginnen, wo die Dichte niedriger ist, und nach unten gehen, wo die Dichte höher ist. Anschließend werden Softwareeinstellungen aktiviert, um die Datenerfassung zu starten und das Polysomenprofildiagramm durch OD_254-Messung zu generieren (Abbildung 1B). Wenn wir eine höhere Signalintensität in der polysomalen Fraktion beobachten, deutet dies darauf hin, dass die Probe eine höhere Translationseffizienz aufweist.

Die Flächen der Polysomenprofilierung für 5 Tage alte Col-0-Sämlinge unter verschiedenen Behandlungen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Ergebnisse der Kontrollgruppe zeigen eine klare Trennung zwischen der nicht-polysomalen Fraktion und der polysomalen Fraktion (Abbildung 2A). Nach 1 h Hitzestress bei 40 °C nahm die Signalintensität der polysomalen Fraktion jedoch signifikant ab (Abbildung 2B). Wenn die wärmebehandelten Sämlinge 2 h lang bei 22 °C regenerieren konnten, erholte sich die Signalintensität der polysomalen Fraktion auf ein ähnliches Niveau wie in der Kontrollgruppe (Abbildung 2C). Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine 1-stündige Hitzestressbehandlung die Translationseffizienz von Arabidopsis-Sämlingen signifikant reduzierte. Die Pflanzen benötigten jedoch eine 2-stündige Erholungsphase, um die Translationseffizienz wieder auf ein Niveau zu bringen, das mit dem von Sämlingen vergleichbar ist, die nicht unter Hitzestress leiden.

Um weitere Beweise für den Vergleich der Translationseffizienz von Col-0-Keimlingen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu sammeln, haben wir die nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Fraktionen isoliert und extrahiert. Die Entnahme von nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Fraktionen orientierte sich an den Ergebnissen der Polysomenprofilmessungen. Für die Extraktion von nicht-polysomalen und polysomalen RNAs verwenden wir das Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Reagenz, um die isolierten nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Proben zu extrahieren. Mit der von uns verwendeten RNA-Extraktionsmethode können wir stabile und qualitativ hochwertige RNA für unsere folgende Analyse erhalten (Tabelle 1). Normalisieren Sie anschließend die extrahierte RNA mit dem GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit, um Fehler zu mindern, die durch unterschiedliche Extraktionsverluste verursacht werden. Als nächstes wurde die Echtzeit-PCR verwendet, um die Expression von DAP-Genen zu quantifizieren, die in den dem Kit hinzugefügten B. subtilis-Genen enthalten sind. Eine vergleichende Analyse der DAP-Genexpressionsniveaus zwischen nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Gruppen wurde durchgeführt, um den RNA-Gehalt unter Bedingungen des proportionalen Verlusts abzuschätzen (Abbildung 3A). Wir berechneten das Verhältnis von normalisierter polysomaler RNA zu Gesamt-RNA, um die Translationseffizienz zwischen ihnen zu klären (Abbildung 3B). Schließlich wurde das Verhältnis von RNA in Polysomen unter Verwendung des normierten RNA-Gehalts berechnet (Abbildung 3C). Die Ergebnisse des RNA-Verhältnisses in Polysomen unter verschiedenen Behandlungen von Col-0 zeigten ein Muster, das mit den in Abbildung 2A gezeigten Ergebnissen des Polysomenprofils übereinstimmte. Beide Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hitzestress das RNA-Verhältnis in der polysomalen Fraktion signifikant reduziert und dieser Effekt nach einer 2-stündigen Erholung bei 22 °C wieder rückgängig gemacht werden kann (Tabelle 1).

Mit diesem Verfahren können wir die gesamte nicht-polysomale oder polysomale RNA-Fraktion mit hoher Qualität erhalten, anstatt die RNA in zusätzliche Fraktionen zu trennen²³. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass sowohl Polysomenprofile als auch der Anteil an RNA in Polysomen die Translationseffizienz in Arabidopsis unter verschiedenen behandelten Bedingungen effektiv widerspiegeln können.

Abbildung 1: Workflow-Diagramm für die Polysomenprofilierung. (A) Schematische Darstellung der Vorbereitung des Saccharosegradienten in einem 13-ml-Zentrifugenröhrchen. (B) Das Flussdiagramm veranschaulicht den experimentellen Prozess der Polysomenprofilierung. Zunächst wird das Translatom extrahiert. Anschließend werden nicht-polysomale und polysomale RNA anhand ihrer Dichteunterschiede mittels Ultrazentrifugation in Saccharosegradienten unterschiedlicher Dichte getrennt. OD₂₅₄ wird mit einem Dichtegradientenfraktionator gemessen, um das untenstehende Ergebnisdiagramm der Polysomenprofilierung zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Polysomen-Profilierung von Col-0 unter verschiedenen Bedingungen. (A, B, C) Die Polysomenprofilierung von Col-0 ergibt sich unter den Bedingungen (A) keine Wärmebehandlung (Kontrolle), (B) Wärmebehandlung bei 40 °C für 1 h und (C) Rückgewinnung bei 22 °C für 1 h nach der Wärmebehandlung. Die nicht-polysomale und polysomale RNA wurden unter Verwendung eines Saccharosegradienten von 12,5 % bis 60 % fraktioniert. Die Positionen der nicht-polysomalen (NP) und polysomalen (PL) RNA sind auf den Profilen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Workflow-Diagramm für die nicht-polysomale und polysomale RNA-Extraktion. (A) Eine Illustration der RNA-Normalisierung durch Spike-in. (B) Eine Veranschaulichung der Trennung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA und die Berechnung des Prozentsatzes polysomaler RNA. (C) Der prozentuale Anteil an polysomaler RNA in Col-0, die unter verschiedenen Bedingungen behandelt wurde. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD an (n=3 biologische Wiederholungen). *p-Wert < 0,01, Schüler-t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

		Inhalt (ng)	260/280	260/230
Steuerung	RNA-NP	758.3	2.19	2.16
	RNAPL	302.3	2.21	2.13
Hitzestress	RNA-NP	821.5	2.2	2.15
	RNAPL	174.3	2.19	2.21
Genesung	RNA-NP	797.2	2.17	2.16
	RNAPL	300.9	2.19	2.18

Tabelle 1: Gehalte und Qualitäten an nicht-polysomaler und polysomaler RNA. Diese Tabelle zeigte, dass die RNA-Gehalte und -Qualitäten analysiert wurden. Der RNA-Gehalt wurde nach der Extraktion mit modifizierten Methoden normalisiert.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und standardisierte Methode zur Messung der Translationseffizienz von Arabidopsis-Sämlingen. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die Sicherstellung der RNA-Stabilität durch Sekundärzentrifugation und RNA-Extraktionsreagenzienextraktion sowie die sorgfältige Vorbereitung des Saccharosegradienten. Darüber hinaus bieten wir kritische Schritte zur Normalisierung und Quantifizierung der nicht-polysomalen und polysomalen RNA mit der Spike-in-Normalisierungsmethode an. Es ist sehr wichtig, dass alle Eingriffe auf Eis mit RNase-freien Puffern und Werkzeugen durchgeführt werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Saccharosekonzentration genau vorbereitet wird, und minimieren Sie das Schütteln, um die Auswirkungen auf den Gradienten zu reduzieren. In früheren Studien 24,25,26 konzentrierte sich die Forschung zu Stressreaktionen hauptsächlich auf transkriptionelle und phänotypische Analysen. Mit Polysomenprofilanalysen können wir die Regulation von Translationsprozessen in Pflanzen unter Stress oder anderen Umweltreizen weiter untersuchen.

Um translationale Prozesse zu verstehen, müssen nicht nur Polysomen-Profiling-Experimente durchgeführt werden, sondern diese auch durch Azidohomoalanin (AHA)-Markierungsexperimente ergänzt werden. Die AHA-Markierung wird eingesetzt, um die Proteinsynthese und die translationale Aktivität zu untersuchen²⁷. Die Methode ersetzt Methioninreste in neu synthetisierten Proteinen durch AHA, ein Methionin-Analogon, das eine Azidgruppe enthält. Zellen integrieren AHA während der Translation in neu synthetisierte Proteine. Anschließend können mit Hilfe von auf Azidchemie basierenden Techniken wie der Click-Chemie Proteine, die AHA enthalten, selektiv markiert und nachgewiesen werden, was eine quantitative Analyse und Visualisierung von aktiv translatierenden Proteinen ermöglicht²⁸. Durch die Kombination von AHA-Markierung mit Polysomen-Profiling können Forscher tiefere Einblicke in die Dynamik der Proteinsynthese in Pflanzenzellen gewinnen⁸.

Mit dieser Methode der polysomalen RNA-Isolierung und Spike-in-Normalisierung können wir die extrahierte RNA auch für die RNA-Sequenzierungsanalyse verwenden. Durch die Analyse von polysomengebundener mRNA können wir feststellen, welche mRNAs aktiv in der Translation sind. Darüber hinaus ermöglicht uns der Vergleich von Steady-State-mRNA mit polysomgebundener mRNA, Gene zu identifizieren, die auf Translations- oder Transkriptionsebene überexprimiert sind. Das Expressionsniveau von Steady-State-mRNA spiegelt die transkriptionelle Aktivität wider, während Polysom-gebundene mRNA auf Gene hinweist, die aktiv in der Translation sind. Die Translationseffizienz wird durch Umweltreize und posttranslationale Modifikationen beeinflusst 7,8,9,16. Daher bietet diese Methode ein umfassendes Verständnis dafür, ob das Zielprotein von Interesse effektiv translatiert wird. Die Grenze dieser Methode besteht jedoch darin, dass es während des Extraktionsverfahrens immer noch zu einem Verlust von RNA kommt. Die relative Expression von Spike-in-RNA, die durch qRT-PCR gewonnen wird, kann ebenfalls zu leichten Messfehlern führen. Weitere Forschung und Validierung mittels Proteomik oder Western Blot sind erforderlich, um die funktionellen Aspekte des Zielproteins zu untersuchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine einfache Methode darstellt, die einen unkomplizierten Ansatz mit klaren Ergebnissen für die Bewertung der Übersetzungseffizienz bietet. Wichtig ist, dass seine Anwendbarkeit über hitzestressbehandelte Sämlinge hinausgeht und auch Sämlinge umfasst, die verschiedenen anderen Umweltreizen ausgesetzt sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Eppendorf-Röhrchen	Labcon	3012-870-000-9	RNA-Extraktion
13,2 mL Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372	Ultrazentrifugation
Bromphenolblau	Honeywell	32712	Polysomenprofil
Chloroform	Honeywell	32211	RNA-Extraktion
Cycloheximid (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysomenprofil
Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA-Extraktion
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA-Extraktion
GeneChip Eukaryotische Poly-A RNA Kontrollkit	Invitrogen	900433	Normalisierung
Glycerin	Honeywell	15523	Normalisierung
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysomenprofil
HiScript III RT SuperMix für qPCR-Kit	Vazyme	R323-01	Normalisierung
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysomenprofil
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysomenprofil
MS Basalmedium	Phyto	M524
Pflanzenkultur Peak Chart Spritzenpumpe	Brandel	SYN4007LS	Polysomenprofil
Polyoxyethylen-10-Tridecylether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysomenprofil
RNasin	Promega	N251B	Polysomenprofil
Natriumdesoxycholat (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysom-Profil
Saccharose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysom-Profil
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalisierung
TRI Reagenz	MRC	TR118	RNA-Extraktion
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysom-Profil
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	Ultrazentrifugation
UV/VIS-Detektor	Brandel	UA-6	Polysomenprofil