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Mukoviszidose-Aggregat-Biofilm-Modell zur Untersuchung der infektionsrelevanten Genexpression

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DOI:

10.3791/67477

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18. April 2025

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1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie skizziert einen Rahmen für die Entwicklung eines aggregierten polymikrobiellen Biofilmmodells und die Optimierung eines RNA-Extraktionsprotokolls zur Bewertung der Genexpression von Pseudomonas aeruginosa, die die Lungenumgebung der Mukoviszidose widerspiegelt. Zu den Anwendungen gehören die Bewertung antimikrobieller Wirkungen und die Untersuchung von Antibiotikaalternativen unter Bedingungen, die für Mukoviszidose relevant sind.

Zusammenfassung

Standard-präklinische Testmethoden für neuartige antimikrobielle Therapeutika, die zur Behandlung chronischer Lungeninfektionen bei Menschen mit Mukoviszidose verwendet werden, spiegeln nicht die Umweltbedingungen der feindlichen Lungennische wider. Die derzeitigen reduktionistischen Testbedingungen können dazu führen, dass Wirkstoffe entlang einer präklinischen Pipeline fortschreiten, ohne dass ihre Aktivität unter Mukoviszidose-Lungennischenbedingungen nachgewiesen wird. Mehrere Ansätze, die zur Untersuchung traditioneller antimikrobieller Wirkstoffe verwendet werden, sind möglicherweise nicht für Antibiotika-Alternativen geeignet, einschließlich Anti-Virulenz-Therapeutika wie Anti-Quorum-Sensing-Wirkstoffe und Siderophor-Inhibitoren. Dieses Protokoll dokumentiert ein aggregiertes Biofilmmodell von Pseudomonas aeruginosa zum Vergleich der Resistenz- und infektionsrelevanten Genexpression in Einzel- und Mehrspezieskulturen (Staphylococcus aureus und Candida albicans), wobei die Reduktion der koloniebildenden Einheit (KBE) und die Veränderungen der Genexpression am Beispiel von algD untersucht werden. Das Modell wurde für kleine, statische Volumina von Bakterienkulturen optimiert, um die Untersuchung neuartiger Verbindungen in der Entdeckungsphase der Arzneimittelentwicklungspipeline zu ermöglichen, in der die Wirkstoffmengen begrenzt sein können. Einzelspezies-Biofilme von P. aeruginosa wurden in synthetischem Mukoviszidose-Medium 2 (SCFM2) für 24 Stunden gebildet, bevor sie weitere 24 Stunden lang mit Meropenem in unterschiedlichen Konzentrationen (1, 16 und 256 μg/ml) behandelt wurden. Polymikrobielle Biofilme wurden etabliert, indem Staphylococcus aureus und Candida albicans zusammen in SCFM2 gezüchtet, dann weitere 24 Stunden mit P. aeruginosa geimpft und mit Meropenem behandelt wurden. Das Fehlen eines direkten Zusammenhangs zwischen den Wirksamkeitsmessungen von Wirkstoffen in präklinischen Tests und den Ergebnissen klinischer Studien hat Zweifel an der Anwendbarkeit der aktuellen Labor-Screening-Instrumente aufkommen lassen. Dieses Modell ermöglicht es uns, den Einfluss relevanter Faktoren auf die Genexpression von P. aeruginosa zu verstehen, einschließlich Genen, die zu Resistenz und Virulenz beitragen, und so diese Lücke zu schließen.

Einleitung

Mukoviszidose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessive Erkrankung in der kaukasischen Bevölkerung1. Mutationen im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) führen zu einer Reihe von klinischen Symptomen, einschließlich einer Überproduktion von Schleim in den Atemwegen. Ein gestörter Ionentransport führt dazu, dass diese Schleimhaut dehydriert, was dazu führt, dass sie vom mukoziliären System nicht ausreichend abgebaut wird, was die Anfälligkeit für chronische Lungeninfektionen erhöht1. Die Mikrobiologie der CF-Lunge besteht aus einer ausgeprägten Gruppe opportunistischer Krankheitserreger, wobei Haemophilus influenzae und Staphylococcus aureus als primäre Organismen gelten, die die Lungen von Säuglingen und Kindern mit CF infizieren, gefolgt von einem Rückgang dieser Organismen und einer anschließenden Besiedlung mit Burkholderia spp. oder Pseudomonas aeruginosa im Erwachsenenalter1,2,3,4. Neben Bakterienarten sind auch Pilzmikroorganismen in der CF-Lungenumgebung verbreitet, wobei Candida spp. und Aspergillus spp. zu den am häufigsten isolierten Pilzarten gehören3,4,5. Obwohl diese Organismen eine wichtige Rolle bei CF-Lungeninfektionen spielen, haben Fortschritte bei Kultivierungstechniken und kulturunabhängigen Methoden gezeigt, dass CF-Lungeninfektionen selten auf eine einzige Bakterienart beschränkt sind, was die komplexe, polymikrobielle Natur der CF-Lunge unterstreicht1,6.

Trotz dieses Wissens haben aktuelle in vitro und in vivo Methoden zur Entwicklung und Erprobung von Antibiotika für den Einsatz bei chronischen Lungeninfektionen keine vollständige Ähnlichkeit mit der CF-Lungennische7, wobei der Schwerpunkt auf der Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) des Medikaments gegenüber Ein-Spezies-Kulturen liegt. Dies ermöglicht eine eingeschränkte Berücksichtigung der infektiösen Mikroumgebung, die eine Schlüsselkomponente der CF-Lungenpathologie ist8. Daher beinhalten Methoden typischerweise das Wachstum von Bakterien als planktonische Kulturen, ein Wachstumszustand, der wahrscheinlich nicht den von Bakterien in der CF-Lunge widerspiegelt. Dies ist besonders wichtig für P. aeruginosa, das typischerweise als Biofilmaggregate vorliegt, die oft zusätzlich andere Bakterien- und Pilzarten enthalten9. Solche Faktoren stellen eine Herausforderung bei der Prüfung von Antibiotika auf chronische Lungeninfektionen dar und verdeutlichen eine Diskrepanz zwischen den Testmethoden für die Antibiotikaempfindlichkeit und der antimikrobiellen Aktivität in der CF-Lungenumgebung9,10. Diese Herausforderungen werden noch verschärft, wenn nach Antibiotika-Alternativen gesucht wird, wie z. B. Anti-Virulenz-Therapeutika, bei denen MHK-Assays kein Indikator für die Aktivität sind und kein Verständnis der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen liefern11.

Alginat, ein extrazelluläres Polysaccharid, ist eine Schlüsselkomponente von P. aeruginosa-Biofilmen in der Lungennische und erhöht die bakterielle Toleranz gegenüber Antibiotika und Immunwirkstoffen sowie die Oberflächenadhäsion12. Alginat ist ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Antivirulenztherapien, und es wurden mehrere Therapeutika entwickelt, die auf die Alginatbiosynthese abzielen, wie z. B. solche, die auf algD abzielen, ein Schlüsselgen bei der Alginatbiosynthese13,14. Solche Therapeutika könnten in Verbindung mit Antibiotikatherapien bei Menschen mit Mukoviszidose eingesetzt werden, um die Biofilme von P. aeruginosa zu stören und Bakterien in einen planktonischen Zustand zu versetzen. Dies erhöht die Wirksamkeit des Antibiotikums, da die Störung der extrazellulären Matrix des Biofilms eine erhöhte Fähigkeit des Antibiotikums ermöglicht, das bakterielle Ziel zu erreichen15. Trotz des Hinweises auf eine In-vitro-Aktivität bleibt die Wirkung dieser Therapeutika in der CF-Lungennische unklar.

Das hier vorgestellte aggregierte Biofilmmodell löst diese Probleme durch die Hinzufügung von S. aureus und C. albicans, die häufige Co-Kolonisatoren mit P. aeruginosa in der CF-Lunge sind. Es ermöglicht P. aeruginosa auch, in Biofilmaggregaten zu wachsen, wie sie in der Atemwegsumgebung zu sehen sind. Die Verwendung des Sputum-ähnlichen Mediums Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) als Ernährungsumgebung für das Wachstum ermöglicht die Hinzufügung von Wirtseinflüssen, einschließlich Mucin, extrazellulärer (e)DNA und eines Aminosäureprofils, das das in der CF-Lunge repliziert16.

Um den Zustand der CF-Lunge weiter zu erfassen, werden Biofilme Meropenem ausgesetzt, einem Antibiotikum, das Menschen mit CF häufig während der Lungenexazerbation verschrieben wird. Die Verwendung eines Antibiotikums innerhalb dieses Modells wird empfohlen, um die klinischen Bedingungen zu replizieren, unter denen ein Antivirulenzmittel verschrieben werden kann, z. B. als Kombinationstherapie in Verbindung mit einer Antibiotikabehandlung zur Behandlung der Atemwegssymptome während der Exazerbation. Darüber hinaus ermöglicht die Einbeziehung von Meropenem die Beurteilung der transkriptionellen Reaktion von P. aeruginosa auf Antibiotika-Exposition unter infektionsrelevanten Bedingungen. Dieses Modell könnte verwendet werden, um Informationen darüber zu erhalten, welche Faktoren geeignete Angriffspunkte für Medikamente in der CF-Lunge wären. Das Modell könnte auch geändert werden, um andere relevante Antibiotika wie Tobramycin einzubeziehen und die Expression anderer Gene von Interesse zu bewerten.

Hier wird dieses aggregierte polymikrobielle Modell verwendet, um die Auswirkungen des Vorhandenseins von Staphylococcus aureus und Candida albicans und unterschiedlicher Konzentrationen von Meropenem (1, 16 und 256 μg/ml) auf die Expression von algD durch P. aeruginosa zu bewerten.Meropenem wird in erster Linie zur Behandlung von Lungeninfektionen von P. aeruginosa verschrieben und hat keine direkte Wirkung auf S. aureus oder C. albicans, wo die MHK für diese beiden zusammenlebenden Spezies >256 μg/ml beträgt.

Diese Arbeit wird das Verständnis dafür verbessern, wie relevante Faktoren, wie Wirtsfaktoren innerhalb von SCFM2 und co-kolonisierende Mikroorganismen, die Expression von P. aeruginosa-infektionsrelevanten Genen beeinflussen können, und wird die Grundlagen für die Entwicklung und Erprobung von Anti-Virulenz-Therapeutika für den Einsatz bei chronischen CF-Atemwegsinfektionen schaffen.

Protokoll

1. Herstellung von Biofilmen für einzelne Spezies

  1. P. aeruginosa PAO1 wird aus gefrorenen Bead-Stammkulturen wiederbelebt, indem eine einzelne Perle auf Lysogeny Broth (LB)-Agar gestreichelt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert wird.
  2. Bereiten Sie Übernachtkulturen von PAO1 vor, indem Sie eine einzelne Kolonie von der Streifenplatte nehmen und sie zu 5 mL LB-Medium hinzufügen. Über Nacht (18 h) inkubieren, dann auf OD600 von 0,05 verdünnen (entspricht 1 x 108 KBE/ml) und weiter 1:100 in SCFM2 verdünnen, das gemäß Palmer et al.16 hergestellt wurde.
  3. Geben Sie 180 μl des Inokulums in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden. Bereiten Sie Biofilme in biologischer Dreifachausfertigung für die Zählung durch koloniebildende Einheiten (KBE) vor. Insgesamt werden 3 Replikate pro biologischem Replikat nur für die qPCR durchgeführt. In 3 separate Vertiefungen werden 180 μl steriles SCFM2 gegeben, das für die Medienkontrollen verwendet wird.
    HINWEIS: Es wurden Platten mit rundem Boden im Gegensatz zu herkömmlichen Platten mit flachem Boden ausgewählt, da sie eine homogene Belichtung des gesamten Biofilms mit den umgebenden Wachstumsmedien ermöglichen17.
  4. Lassen Sie die Biofilme über 24 h bilden, inkubieren Sie bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 75 U/min.

2. Herstellung von Multispezies-Biofilmen

  1. Wiederbelebung von P. aeruginosa PAO1 und S. aureus SH1000 aus gefrorenen Perlenstammkulturen wie oben beschrieben. C. albicans CAF2.1 aus gefrorenen Perlenstammkulturen wird wiederbelebt, indem eine einzelne Kügelchen auf Saboraud-Dextrose-Agar gestreichelt und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wird.
  2. Bereiten Sie Übernachtkulturen mit SH1000 und CAF2.1 vor, indem Sie eine einzelne Kolonie von der Streifenplatte nehmen und 5 ml LB hinzufügen (separate Übernachtkulturen für jeden Organismus). Über Nacht 18 Stunden inkubieren. Standardisieren Sie Übernachtkulturen von S. aureus SH1000 und C. albicans CAF2.1 in LB- bis OD600-Werten von 0,1, was 1 x 109 bzw. 1,2 x 107 KBE/ml entspricht17,18.
  3. S. aureus und C. albicans werden zu einem einzigen Inokulum verdünnt, das beide Spezies in Konzentrationen von 1 x 106 bzw. 1 x 105 KBE/ml in SCFM2 enthält.
  4. Geben Sie 162 μl des Inokulums in Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Biofilme in biologischer Dreifachausfertigung für die Zählung durch koloniebildende Einheiten (KBE) inokulieren. Insgesamt werden 3 Replikate pro biologischem Replikat nur für die qPCR durchgeführt. Geben Sie in 3 separate Vertiefungen 180 μl steriles SCFM2, das für die Medienkontrollen verwendet wird.
  5. Lassen Sie die Biofilme 24 Stunden lang bilden, inkubieren Sie sie bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 75 U/min.
  6. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von PAO1 vor, indem Sie eine einzelne Kolonie von der Streifenplatte nehmen und sie zu 5 ml LB-Medium hinzufügen. Über Nacht (18 h) inkubieren, dann bei OD600 von 0,05 (entspricht 1 x 108 KBE/ml) zugeben und weiter auf 1 x 105 KBE/ml in SCFM2 verdünnen.
  7. Geben Sie 14,2 μl des PAO1-Inokulums in die Vertiefungen der 96-Well-Mikrotiterplatte, was dazu führt, dass das endgültige Inokulum des PAO1 1 x 104 KBE/ml beträgt.
    HINWEIS: Durch diese Variation der Konzentration des Impfstoffs zwischen den verschiedenen Spezies soll sichergestellt werden, dass S. aureus und C. albicans nicht von P. aeruginosa verdrängt werden und alle durch Spot-Plattieren aus dem 24-Stunden-Biofilm, in dem keine Antibiotika vorhanden sind, wiederhergestellt werden können.
  8. Lassen Sie die polymikrobiellen Biofilme über 24 Stunden bilden, inkubieren Sie bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 75 U/min.

3. DNase und Antibiotikabehandlung von Ein- und Mehrarten-Biofilmen

  1. 2 μl DNase I werden in einer Endkonzentration von 50 μg/ml direkt in die Vertiefungen mit den Biofilmen gegeben, 1 h bei 37 ΰC inkubiert und bei 75 U/min geschüttelt.
    HINWEIS: Dies wird hinzugefügt, um die viskosen Biofilme zu verdünnen, um eine bessere Penetration von antimikrobiellen Mitteln zu ermöglichen, was die Dosierung von rhDNase (rekombinante humane DNase) widerspiegelt, die von vielen Menschen mit Mukoviszidose als Behandlungsstrategie für pulmonale Exazerbationen eingenommen wird.
  2. Bereiten Sie einen antibiotischen Vorrat an Meropenem auf 2,56 mg/ml vor, wobei Sie destilliertes Wasser als Verdünnungsmittel verwenden. Seriell um den Faktor 2 verdünnen, um Konzentrationen von 0,01 mg/ml - 2,56 mg/ml zu erreichen.
  3. Geben Sie 20 μl jeder Meropenem-Verdünnung zu den Biofilmen, um einen Dosierungsbereich von 1 μg/mL bis 256 μg/mL zu erreichen. Anstelle des Antibiotikums werden 20 μl destilliertes Wasser zu den Negativkontroll-Biofilmen hinzugefügt.
  4. Verschließen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte mit transparenter Folie und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 75 U/min.

4. Aufzählung lebensfähiger Zellen und metabolischer Aktivität

HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten nur für die Biofilme, die für die KBE-Quantifizierung bestimmt sind.

  1. 10 μl Cellulase (100 mg/ml, 0,05 M Citratpuffer) zu Biofilmen geben und 1 h bei 37 °C inkubieren und bei 140 U/min schütteln. Cellulase wird regelmäßig verwendet, um die Zelluloseskelette in Biofilmen aufzubrechen19,20,21. Brechen Sie die Biofilme weiter auf, indem Sie bei Bedarf auf und ab pipettieren, bis keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden sind.
  2. 10 μl 0,02%ige Resazurinlösung zur Beurteilung der metabolischen Aktivität der Testbiofilme und Kontrollbiofilme zugeben und 1 h lang bei 37 °C inkubieren und bei 140 U/min schütteln.
  3. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm im Mikroplatten-Reader
    4. .
  4. Korrigieren Sie die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die Fluoreszenzwerte von den Proben des Blindmediums subtrahieren und berechnen Sie die prozentuale Reduktion als (Mittelwert der mitF-Antibiotika behandelten Biofilme/der mittlerenF-Negativkontrolle) x 100 %.
  5. Zählen Sie den Inhalt der Vertiefungen auf, die sowohl die gestörten Biofilme als auch die Planktonzellen enthalten, indem Sie den selektiven Agar wie folgt seriell verdünnen und punktuell plattieren:
    Pseudomonas-selektiver Agar, ergänzt mit 1% Glycerin und CN-Präparat zur Zählung von P. aeruginosa
    Mannitolsalz-Agar für die Zählung von S. aureus|
    Hefe-Pepton-Dextrose-Agar, ergänzt mit Penicillin (250 μg/ml), Streptomycin (250 μg/ml), Gentamycinsulfat (30 μg/ml) und Vancomycin (3 μg/ml) für die Zählung von C. albicans.
    HINWEIS: Der gesamte Inhalt der Vertiefungen wird aufgrund der Herausforderungen bei der Trennung des frei schwebenden Aggregat-Biofilms von den Planktonzellen aufgezählt. Dieser Ansatz spiegelt jedoch die Bedingungen in der Mukoviszidose-Lunge genauer wider. Nach der Inkubation kann Kondenswasser auf dem Deckel vorhanden sein. Um sicherzustellen, dass keine Kontamination zwischen den Vertiefungen stattfindet, werden die sterilen Kontrollen punktuell auf selektiven Agar aufgesetzt.
  6. Nach dem Aufpolieren des selektiven Agars werden die Platten vor der Zählung 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

5. Vorbereitung von Biofilmen für die RNA-Extraktion

HINWEIS: Alle Schritte ab diesem Zeitpunkt gelten nur für Biofilme, die für die RT-qPCR-Analyse bestimmt sind.

  1. Entfernen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte mit den Biofilmen aus dem 37 °C-Inkubator und geben Sie sie in ein 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie bei der Übertragung sicher, dass die Biofilmreplikate für jede durchgeführte biologische Wiederholung gepoolt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Biomasse für die RNA-Extraktion vorhanden ist.
  2. Zentrifugieren Sie die 1,5 mL Röhrchen mit den Biofilmen bei 16.000 x g für 5 min. Wenn Sie die RNA-Extraktion am selben Tag durchführen, fahren Sie mit Schritt 6.2.1 fort. Wenn die RNA-Extraktion nicht am selben Tag durchgeführt wird, entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet in 250 μl RNA-Stabilisierungslösung bei -20 °C. Diese Lösung wurde in mehreren Studien zur Lagerung von Bakterienpellets verwendet22,23.

6. RNA-Extraktion

  1. Extrahieren Sie bakterielle RNA-Biofilme mit einer Spezies und mehreren Spezies mit einem kommerziellen Kit. Bereiten Sie die Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Entfernen Sie den Überstand des Nährmediums und entsorgen Sie ihn. Wenn das Pellet in einer Stabilisierungslösung gelagert wurde, tauen Sie es auf Raumtemperatur auf und zentrifugieren Sie es bei 16.000 x g für 5 min. Resuspendieren Sie das Pellet in 600 μl RNA-Extraktionsreagenz und brechen Sie es dann manuell mit einer 0,2-mm-Nadel auf, die an einer 2-ml-Spritze befestigt ist (aspirieren Sie 5x-10x oder bis das Pellet vollständig aufgebrochen ist).
  3. Führen Sie die RNA-Aufreinigungsschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  4. Quantifizieren Sie die RNA mit einem UV-Spektroskop, einem RNA BR Assay Kit und Röhrchen. Die nachweisbaren Grenzwerte für RNA mit dem Assay-Kit liegen bei 10 - 1200 ng/μl, daher beträgt die akzeptable Mindestausbeute an RNA für dieses Protokoll 10 ng/μl.
    1. Stellen Sie die erforderliche Anzahl von Röhrchen für Proben und Standards ein (2 Standards sind erforderlich).
    2. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie 199 μl Puffer und 1 μl Reagenz pro Probenanzahl (+ 2 Standards und 2 für Fehler) hinzufügen.
    3. 190 μl Arbeitslösung und 10 μl Standard 1 und Standard 2 in getrennte Röhrchen geben.
    4. 199 μl Arbeitslösung und 1 μl RNA-Probe in separate Röhrchen geben. 30 s vortexen und dann 5 min dunkel lagern.
    5. Wählen Sie auf dem Fluorometer RNA > Broad Range RNA aus und befolgen Sie die Anweisungen.
    6. Beurteilen Sie die Qualität der RNA mit einem Spektralphotometer. Blenden Sie das Spektralphotometer aus, indem Sie 1 μl DNase/RNase-freies Wasser auf das Spektralphotometer pipettieren. Wischen Sie das Wasser mit einem fusselfreien Tuch ab und stellen Sie das Absorptionsverhältnis auf 260/280 nM ein. Pipettieren Sie 1 μl RNA in das Spektralphotometer. Wenn die RNA rein ist, wird ein einzelner Peak zwischen 260 und 280 nM beobachtet und ein Verhältnis von ~ 2,0 gezeigt.
  5. Wandeln Sie extrahierte RNA mit einem cDNA-Synthesekit in komplementäre DNA (cDNA) um. RNA-Proben mit einem Gehalt von mehr als 50 ng/μl zunächst mit DNase/RNase-freiem Wasser auf 50 ng/μl verdünnen.
    1. Bereiten Sie das cDNA-Reaktionsgemisch mit Hilfe von Röhrchen gemäß Tabelle 1 vor.
    2. Legen Sie die Röhrchen unter den folgenden Bedingungen in einen Thermocycler: 25 °C für 5 Minuten, 42 °C für 30 Minuten, 85 °C für 5 Minuten. Verwenden Sie die cDNA entweder sofort oder lagern Sie sie gefroren bei -20 °C.

7. qPCR

  1. Führen Sie die qPCR mit einem qPCR-Mastermix durch. Verwenden Sie die folgenden Primer für algD und das Housekeeping-Gen (16S) (Tabelle 2).
    HINWEIS: Die Primer wurden unter Verwendung des Online-Tools NCBI-primer Blast unter Bezugnahme auf die gesamte Genomsequenz von P. aeruginosa entwickelt und dann über einen kommerziellen Anbieter synthetisiert. Die Spezifität der Primer in den polymikrobiellen Biofilmen wurde durch Sequenzabgleich mit dem NCBI-primer Blast-Tool validiert.
  2. Verdünnen Sie die Primer auf 4 μM (4 pm/μL), indem Sie 20 μl Primer in 480 μl DNase/RNase-freiem Wasser verdünnen. Diese können für mehrere Zwecke eingefroren werden.
  3. Bereiten Sie die Arbeitslösung des qPCR-Mastermixes gemäß den Anweisungen in Tabelle 3.
    HINWEIS: Die algD-Arbeitslösung enthält genügend Lösung für 3x biologische Wiederholungen und 3x technische Wiederholungen pro Meropenem-Konzentration, 6x Negativkontrollen und 2x Fehler. Die 16S-Arbeitslösungen enthalten genügend Lösung für 2x Standards bekannter RNA-Konzentration und 2x Fehler.
  4. Geben Sie 18 μl algD-Arbeitslösung in die entsprechenden qPCR-Reaktionsröhrchen. Dazu gehören insgesamt 36 Röhrchen für die Analyse der algD-Expression und 6 Röhrchen für die Negativkontrolle.
  5. Geben Sie 2 μl RNA in jedes der qPCR-Reaktionsröhrchen oder 2 μl DNase/RNase-freies Wasser in die Negativkontrollen.
  6. Geben Sie 18 μl 16S-Arbeitslösung in die entsprechenden qPCR-Reaktionsröhrchen. Dies wird insgesamt 2 Röhren umfassen. Geben Sie 2 μl RNA bekannter Konzentration in die qPCR-Reaktionsröhrchen.
  7. Führen Sie die qPCR unter folgenden Bedingungen durch: 2 min bei 95 °C, 15 s bei 95 °C (40 Zyklen), 1 min bei 60 °C.
  8. Analysieren Sie die qPCR-Ergebnisse mit der 2-ΔΔCt-Methode, wie zuvor beschrieben24. Bei der Analyse der algD-Expression ist die algD-Expression bei 0 μg/mL als Kontrolle für die jeweiligen Biofilmzusammensetzungen zu verwenden und die Expression von Faltenänderungen zu berücksichtigen, die für unbehandelte Kulturen relevant sind

Ergebnisse

Die in Abbildung 1A gezeigten Ergebnisse verdeutlichen die Widerstandsfähigkeit der Einzelspezies-Pseudomonas-Biofilme gegenüber einer Behandlung mit Meropenem, da bei keiner der getesteten Dosierungen ein signifikanter Rückgang beobachtet wurde. Die negative Kontrolle, die nicht Meropenem ausgesetzt war, wies eine Wiederfindungsrate von 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL auf, während die stärkste Verminderung an lebensfähigen Zellen bei 16 µg/mL auftrat und eine Wiederfindungsrate von 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL ergab. Dieses Ausmaß an Resistenz ist jedoch zu erwarten, da in der Literatur gezeigt wurde, dass P. aeruginosa-Biofilme gegenüber Meropenem deutlich resistenter sind als ihre planktonischen Formen, wobei zur Abtötung der Biofilme eine Konzentration von >256 µg/mL erforderlich ist25,26, verglichen mit planktonischen Zellen, die einen MHK-Wert von 2 µg/mL aufweisen.

Abbildung 1B zeigt den durchschnittlichen prozentualen Rückgang der metabolischen Aktivität der P. aeruginosa-Biofilme in Reinkultur bei jeder Antibiotikakonzentration im Vergleich zum Kontrollbiofilm, der keinem Meropenem ausgesetzt war. Eine Abnahme der Fluoreszenz entspricht einer geringeren metabolischen Aktivität, die als Indikator für eine Verringerung der lebensfähigen Zellen angesehen wird. Kulturen, die mit Meropenem behandelt wurden, wiesen eine erhöhte metabolische Aktivität auf (gekennzeichnet durch eine negative prozentuale Abnahme), was auf keinerlei (oder nur sehr begrenzte) bakterizide Wirkung hindeutet.

Die erhöhte Stoffwechselaktivität ohne Zunahme der CFU-Ausbeute könnte auf die metabolische Reaktion der Bakterien gegenüber Antibiotikabehandlung hindeuten. Zwischen den Einzelarten- und Mehrarten-Biofilmen (Abbildung 2) unterschied sich das Gesamtwachstum von P. aeruginosa nur geringfügig, wobei die Gewinnung lebensfähiger Zellen aus dem Einzelarten-Biofilm um 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL höher lag als in dem polymikrobiellen Biofilm, wenn kein Antibiotikum vorhanden war. S. aureus wurde aus dem polymikrobiellen Biofilm mit 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL isoliert, und C. albicans wurde mit 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL nachgewiesen. C. albicans war jedoch nur dort vorhanden, wo kein Meropenem zugegeben worden war, und wurde aus keinem Biofilm gewonnen, dem das Antibiotikum verabreicht worden war. Da Meropenem, wie in früheren im Labor durchgeführten MIC-Tests an C. albicans-Monokulturen gezeigt wurde, keine direkte Wirkung auf Candida ausübt (der MIC-Wert von Meropenem betrug hierbei >256 µg/mL), ist es wahrscheinlich, dass die bakterielle Stressreaktion der anderen gemeinsam lebenden Arten, S. aureus und P. aeruginosa, gegenüber der Antibiotikabehandlung zu ungünstigen Bedingungen für den Pilz führt.

Da bei P. aeruginosa-Biofilmen, sowohl in Monokultur als auch in Koinfektion mit anderen Pathogenen, keine Verringerung der lebensfähigen Zellanzahl bei Meropenem-Konzentrationen bis zu 256 µg/mL beobachtet wird, zeigt dies die Notwendigkeit alternativer Therapeutika wie Anti-Virulenz-Therapien auf, um derartige chronische Infektionen klinisch zu bekämpfen, die möglicherweise in Kombination mit antimikrobiellen Wirkstoffen wirken könnten, um die bakterielle Belastung effektiv zu reduzieren.

algD-Expression in P. aeruginosa-Biofilmen mit einzelnem Spezies
Die Expression von algD in P. aeruginosa PAO1, das verschiedenen Konzentrationen von Meropenem (1, 16 und 256 µg/mL) ausgesetzt war und in SCFM2 kultiviert wurde, wurde mittels SYBR-Green RT-qPCR bestimmt. Die Analyse erfolgte nach der 2-ΔΔCt-Methode, wobei 16S als Kontrollgen verwendet wurde (Abbildung 3). Die Expression von algD unterschied sich zwischen den verwendeten Meropenem-Konzentrationen nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass die algD-Expression in PAO1, wenn es als Biofilm mit einzelnem Spezies wächst, durch das Vorhandensein von Meropenem nicht stark beeinflusst wird.

algD-Expression in P. aeruginosa-Biofilmen mit mehreren Arten
Die Expression von algD wurde ebenfalls in P. aeruginosa PAO1 untersucht, das in Biofilmen gemeinsam mit S. aureus SH100 und C. albicans CAF2.1 wuchs, um zu prüfen, ob das Vorhandensein ko-kolonisierender Organismen die Expression von algD oder die Reaktion auf Meropenem in PAO1 beeinflusst. Zwischen den Meropenem-Konzentrationen von 0–16 µg/mL wurden keine signifikanten Unterschiede in der algD-Expression beobachtet. Bei 256 µg/mL war die Expression von algD jedoch signifikant höher im Vergleich zu den anderen Antibiotika-Konzentrationen (0 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,0075; 1 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,035; 16 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,0048), und lag etwa 7-fach über der Kontrollbedingung (Abbildung 4). Dies zeigt, dass bei Wachstum in Gegenwart von S. aureus und C. albicans die Expression von algD bei der höchsten Meropenem-Konzentration zunimmt, verglichen mit P. aeruginosa, das allein kultiviert wurde, was auf eine erhöhte Alginate-Produktion im polymikrobiellen Kontext hindeutet. Obwohl Unterschiede in der algD-Expression zwischen ein- und mehrartigen Biofilmen nachgewiesen wurden, ist unklar, ob diese erhöhte Expression durch das Vorhandensein einer bestimmten Art (S. aureus oder C. albicans) verursacht wird oder ob Wechselwirkungen zwischen beiden Mikroorganismen diese Genexpressionsänderung antreiben.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung eines Verständnisses der Auswirkungen von Therapeutika und Umwelt auf die Genexpression, insbesondere im Kontext zukünftiger Tests von Therapeutika, die auf Virulenzfaktoren abzielen.

Balkendiagramme zur bakteriellen Wachstumshemmung für P. aeruginosa, S. aureus und C. albicans in Abhängigkeit von der Konzentration.
Abbildung 1: Biofilme aus einer einzigen Spezies, bestehend aus Pseudomonas aeruginosa PAO1. Die Biofilme wurden 24 h in SCFM2 kultiviert, anschließend 1 h mit 50 µg/mL DNase I behandelt und danach weitere 24 h mit Meropenem in verschiedenen Konzentrationen behandelt. (A) Durchschnittlicher Log10CFU/mL. Die gestrichelte Linie kennzeichnet eine 2-log-Reduktion (entspricht einer 99-%-Reduktion) der Rückgewinnung von P. aeruginosa im Vergleich zur Negativkontrolle. (B) Prozentuale Reduktion der relativen Fluoreszenzeinheiten. Die gestrichelte Linie kennzeichnet eine 50-%-Reduktion der Fluoreszenz; der erste Punkt darüber wird als MIC50-Wert betrachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Konzentration von Meropenem im Vergleich zum bakteriellen Wachstum (A) und zur Fluoreszenzreduktion (B) in Diagrammen.
Abbildung 2: Multispezies-Biofilme bestehend aus Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 und Candida albicans CAF2.1. Die Biofilme wurden 24 h in SCFM2 kultiviert, für 1 h mit 50 µg/mL DNase I behandelt und anschließend weitere 24 h mit Meropenem in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Die gestrichelte Linie kennzeichnet eine 2-log-Reduktion (entspricht einer 99 %igen Reduktion) der Rückgewinnung von P. aeruginosa im Vergleich zur Negativkontrolle. Die statistische Signifikanz wurde mittels zweifaktorieller ANOVA bestimmt, wobei **** p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm der relativen Expression vs. Konzentration (µg/ml) mit Ergebnis der statistischen Analyse (ns).
Abbildung 3: Expression von algD aus einzelnen Spezies bestehend aus P. aeruginosa PAO1. Die Biofilme wurden 24 h in SCFM2 kultiviert, für 1 h mit 50 µg/mL DNase I behandelt und verschiedenen Konzentrationen von Meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL) ausgesetzt. Die Genexpression wurde mittels der 2-ΔΔCt-Methode analysiert. Das Housekeeping-Gen 16S wurde in der Analyse verwendet. Die Signifikanz wurde mittels Tukey’s Test für multiple Vergleiche bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm der relativen Expression im Vergleich zur Konzentration; statistische Signifikanz; Genexpressionsanalyse.
Abbildung 4: Expression von algD aus multizellulären Biofilmen, bestehend aus P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 und C. albicans CAF2.1. Die Biofilme wurden in SCFM2 kultiviert, für 1 h mit 50 µg/mL DNase I behandelt und anschließend 24 h mit Meropenem in verschiedenen Konzentrationen (0, 1, 16, 256 µg/mL) behandelt. Die Genexpression wurde mittels der 2-ΔΔCt-Methode analysiert. Das Housekeeping-Gen 16S wurde in der Analyse verwendet. **p < 0,01, bestimmt mittels Tukey’s Test für multiple Vergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Volumen pro cDNA-Reaktion (μL)
5X iScript-Reaktionsmix4
iScript-Reversetran-scriptase1
DNase-/RNase-freies Wasser14
2,5 ng RNA1
Gesamtvolumen der Reaktion20

Tabelle 1: Arbeitslösungen der cDNA-Master-Mix. Komponenten und Volumina, die pro cDNA-Reaktion benötigt werden.

GenForward-PrimerReverse-Primer
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Tabelle 2: algD- und 16S-Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die qPCR.

Volumen pro Reaktion (µL)algD-Arbeitsvolumen (µL)16S-Arbeitsvolumen (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
Forward-Primer1444
Reverse-Primer1444
DNase/RNase-freies Wasser626424
Gesamt 1879272

Tabelle 3: Arbeitslösungen der qPCR-Master-Mix. Erforderliche Komponenten und Volumina für die algD- und 16S-qPCR-Master-Mix-Lösungen.

Zusätzliche Informationen Abbildung 1: Multispezies-Biofilme, bestehend aus Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000, und Candida albicans CAF2.1. Die Biofilme wurden 24 h lang (n = 3) in SCFM2 kultiviert und behandelt mit 50 µg/mL DNase I für 1 h und anschließend mit Meropenem in verschiedenen Konzentrationen weitere 24 h behandelt. Die gestrichelte Linie bezeichnet eine 2-log-Stufen-Reduktion (entspricht einer 99 %igen Reduktion) in P. aeruginosa Wiederfindung aus der Negativkontrolle. Die statistische Analyse wurde mittels zweifaktorieller ANOVA durchgeführt. *p=0.0242, **p=0.0013, ****p <0.0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass Meropenem trotz seiner häufigen Anwendung bei der Behandlung von Lungenexazerbationen bei Menschen mit Mukoviszidose das Wachstum von P. aeruginosa im Einzel- oder Mehrarten-Biofilmmodell nicht signifikant beeinflusste. In beiden Modellen wurde nach der Behandlung mit 128 μg/ml und 256 μg/ml Meropenem ein leichter Anstieg der Wiederfindung von P. aeruginosa beobachtet, wie dies auch bei S. aureus im Multispezies-Biofilm zu beobachten war; Diese Zuwächse waren jedoch unbedeutend. Die Abnahme von C. albicans bei der Behandlung mit Meropenem kann auf feindliche Bedingungen für den Pilz zurückzuführen sein, die von den Bakterien als Reaktion auf den Stress des antimikrobiellen Mittels gebildet werden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der algD-Expression zwischen den Meropenem-Konzentrationen beobachtet, wenn P. aeruginosa als Einzelspezies-Biofilm gezüchtet wurde. Die algD-Expression war jedoch in Multispezies-Biofilmen signifikant höher, wenn sie mit 256 μg/ml Meropenem behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Alginatproduktion unter diesen Bedingungen erhöht sein könnte. Die beobachteten Unterschiede in der algD-Expression zwischen Biofilmzusammensetzungen und Meropenem-Konzentrationen zeigen, wie das Vorhandensein relevanter Faktoren die infektionsrelevante Genexpression beeinflussen kann, und unterstreicht, wie wichtig es ist, bei der Entwicklung und Erprobung von Antibiotikaalternativen den Einsatz von Antibiotika und den polymikrobiellen Infektionsstatus zu berücksichtigen.

Trotz der Nützlichkeit der Modelle gibt es einige Überlegungen, um eine erfolgreiche Anwendung zu gewährleisten. Die Etablierung von S. aureus und C. albicans innerhalb der Biofilme ist vor einer Infektion mit P. aeruginosa unerlässlich, da das Risiko besteht, dass S. aureus und C. albicans durch das Gram-Negativ verdrängt werden. In diesem Biofilmmodell scheint C. albicans ein schlechter Partner zu sein, da seine Überlebensraten im Vergleich zu S. aureus und P. aeruginosa auch ohne Antibiotika deutlich niedriger sind. Dies deutet darauf hin, dass die Hefe entweder um Ressourcen konkurriert oder durch Wechselwirkungen zwischen den Spezies innerhalb des Biofilms negativ beeinflusst wird27,28. Das Fehlen von C. albicans in Gegenwart von Meropenem, obwohl das Antibiotikum keine direkte antimykotische Wirkung hat, unterstützt die Annahme, dass die Stressreaktion von S. aureus auf Meropenem eine Umgebung schaffen kann, die für C. albicans unwirtlich ist 29,30. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Wahl des Stammes einen Einfluss auf die Menge an C. albicans haben kann, die aus dem polymikrobiellen Biofilmmodell gewonnen werden kann. Unterschiedliche Trends sind bei der Verwendung von P. aeruginosa LESB58 anstelle von PAO1 zu beobachten (Ergänzende Abbildung 1). Mit LESB58 ist C. albicans bei allen Konzentrationen von Meropenem rückgewinnbar und zeigt sogar einen leichten Anstieg, da die Konzentration von P. aeruginosa infolge des antimikrobiellen Mittels abnimmt, wodurch sich die Zusammensetzung der Gemeinschaft ändern kann. Trotz dieser Unterschiede wird PAO1 in diesem Modell verwendet, da es sich um einen Laborreferenzstamm handelt, der eine konsistente und gut charakterisierte Ausgangsbasis für vergleichende Studien darstellt. Diese Konsistenz ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit und um verlässliche Rückschlüsse auf die Wechselwirkungen innerhalb des Biofilms zu ziehen.

Aufgrund der viskosen Beschaffenheit des Mediums kann es schwierig sein, große Mengen an RNA aus Bakterien zu extrahieren, die in SCFM2 gezüchtet wurden. Daher ist das Aufbrechen des Biofilms mit 0,2-mm-Nadeln vor der RNA-Extraktion ein wichtiger Schritt, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen und sicherzustellen, dass ausreichende Konzentrationen (≥10 ng/μl) für die RT-qPCR extrahiert werden. RNA ist sehr anfällig für den Abbau31, daher sollte nach der Extraktion sichergestellt werden, dass alle nachgelagerten Aktivitäten, bei denen RNA verwendet wird, auf Eis durchgeführt werden. Regelmäßiges Gefrierauftauen von RNA-, cDNA- und qPCR-Primern kann die Wahrscheinlichkeit einer Produktdegradation erhöhen. Daher sollte es so weit wie möglich begrenzt werden. Eine weitere häufige Herausforderung bei der Anwendung dieser Modelle ist das Risiko einer Kontamination während der RNA-Extraktion oder des qPCR-Assays. Dieses Risiko kann minimiert werden, indem das Gerät vor der RNA-Extraktion mit DNA-Abbaulösung besprüht wird und während des gesamten Verfahrens DNase/RNase-freie Pipettenspitzen verwendet werden. Der regelmäßige Austausch von DNase/RNase-freiem Wasser trägt ebenfalls dazu bei, das Risiko einer Kontamination innerhalb des qPCR-Assays zu verringern.

Dieses Protokoll konzentrierte sich auf algD als das interessierende Gen, da es für die Produktion von Alginat notwendig ist, das als wichtiger Virulenzfaktor von P. aeruginosa sowohl bei akuten als auch bei chronischen Infektionen beschrieben wird32. Daher wird Alginat zunehmend als Ziel für Antivirulenztherapeutika untersucht33,34. Obwohl dieses Modell zur Beurteilung der Expression von algD verwendet wurde, kann es auch zur Beurteilung der Expression anderer P. aeruginosa-Gene für verschiedene Anti-Virulenz-Wirkstoffziele verwendet werden. Meropenem wurde in dieser Studie verwendet, da Hinweise darauf hindeuten, dass das Antibiotikum die Expression von Alginat-Biosynthese-Genen beeinflusst, insbesondere wenn P. aeruginosa in Gegenwart von C. albicans gezüchtet wird 35. Darüber hinaus wird Meropenem häufig klinisch verschrieben, um Atemwegsinfektionen von P. aeruginosa zu behandeln und zu behandeln, was seine relevante Anwendung in diesem Modell unterstreicht36. Aber auch die Zugabe verschiedener Antibiotika oder sogar duale Behandlungen ist bei diesen Modellen möglich. Die Einbeziehung von Antibiotika in dieses Modell würde es auch ermöglichen, dieses Modell zur Untersuchung evolutionärer Veränderungen der bakteriellen Resistenzmechanismen zu verwenden, wie z. B. die Entwicklung einer Porin-vermittelten Resistenz von P. aeruginosa gegen Carbapeneme37. Dieses polymikrobielle Biofilmmodell könnte angepasst werden, um andere relevante Spezies einzubeziehen, beispielsweise kommensale Bakterien wie Rothia sp. und Streptococcus sp., oder durch andere infektionsverursachende Mikroben wie Aspergillus sp. ersetzt werden, um die Anforderungen des zu untersuchenden Arzneimittelkandidaten widerzuspiegeln.

Polymikrobielle Biofilmmodelle, die die CF-Lunge nachahmen, wurden bereits entwickelt38. Das hier beschriebene Modell baut auf früheren Arbeiten auf, um den Durchsatz durch die Verwendung eines Aufbaus zu erhöhen, der für kleinvolumige mikrobielle Kulturen geeignet ist. Dies ist vorteilhaft für die Prüfung neuartiger Verbindungen, bei denen das verfügbare Material begrenzt sein kann. Da das Modell kleinräumig und statisch ist, ist es möglich, die Biofilme in verschiedenen Sauerstoffverfügbarkeiten zu züchten, um die mikroaerophile Umgebung in der Lunge besser widerzuspiegeln39,40. Um die Reproduzierbarkeit zu erleichtern und aus Gründen der Kosteneffizienz wurden die in dieser Studie berichteten Biofilme aerob gezüchtet.

Trotz der wertvollen Erkenntnisse, die aus dieser Studie gewonnen wurden, müssen einige Einschränkungen anerkannt werden. Erstens schränkt das Fehlen von Wirtszellen ihren Nutzen für die Untersuchung von Virulenzfaktoren ein, die ein direktes zelluläres Ziel von Säugetieren haben. Dies skizziert die Herausforderungen bei der Etablierung von in vitro-Modellen , die für die Untersuchung von Virulenzfaktoren geeignet sind, und unterstreicht die Notwendigkeit der Weiterentwicklung von Modellen, die das feindliche Umfeld chronischer Infektionen nachbilden. Darüber hinaus ist Alginat, obwohl es als Virulenzfaktor gilt, ein Schlüsselmerkmal von Biofilmen und wird von P. aeruginosa sowohl im Labor als auch in der Umwelt produziert. Die Verwendung von In-vitro-Modellen zur Untersuchung von Antibiofilm-Wirkstoffen kann weniger schwierig sein als die Verwendung der Modelle zur Untersuchung anderer Anti-Virulenz-Therapien, wie z. B. Anti-Exotoxin-Wirkstoffe, bei denen das Ziel eine direkte Wirkung auf eukaryotische Zellen hat41.

Während die Wahl des P . aeruginosa-Stammes von PAO1 für die Reproduzierbarkeit und Standardisierung des In-vitro-Modells geeignet ist, könnte es wünschenswert sein, Isolate aus chronischen Infektionen einzubeziehen. Zukünftige Experimente mit diesem Modell mit einem Stamm, der aus Patientenproben isoliert wurde, sollen durchgeführt werden, um die Wirkung von Antibiotika auf Stämme zu beobachten, die an die Atemwegsnische angepasst sind.

Die Verwendung von SCFM2 als Sputum-Imitat in diesem in vitro-Modell ermöglicht eine standardisierte und replizierbare Beobachtung der Verhaltensänderungen von aggregierten Biofilmen, die im Verlauf einer Antibiotikabehandlung in einer atemwegsrelevanten Umgebung kultiviert wurden. SCFM2 wurde der ursprünglichen Version von SCFM vorgezogen, da extrazelluläre DNA (eDNA) und Mucin enthalten sind, die wichtige Faktoren bei der Unterstützung der Bildung von Biofilmen sind. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass auch andere Varianten des synthetischen Sputummediums verfügbar sind, wie z. B. SCFM3, das p-Aminobenzoesäure, NAD+, Adenin, Guanin, Xanthin und Hypoxanthin42 enthält, und SCFM4, eine eisenarme Version. Darüber hinaus würde die Verwendung von synthetischen Sputummedien, wie z. B. Mukoviszidose-Lungenmedien (CFLM) und Mukoviszidose-Sinusmedien (CFSM), die von Ruhluel und Kollegenentwickelt wurden 43, eine Kompartimentierung der Atemwege ermöglichen, um das Verhalten und die Wirkung von Antivirulenztherapeutika auf polymikrobielle Biofilme in verschiedenen Umgebungen zu visualisieren.

Obwohl AlgD ein Schlüsselenzym im Biosyntheseweg von Alginat ist, sollte sein Expressionsniveau allein nicht als Hinweis auf die Produktion von Alginat angesehen werden. Andere Faktoren, wie posttranskriptionelle und posttranslationale Modifikationen sowie regulatorische Mechanismen, können die Menge des produzierten Alginats beeinflussen, was zu einer verminderten Biofilmbildung, einer erhöhten Anfälligkeit für Umweltstress und einer erhöhten Antibiotikaempfindlichkeit führt, wenn die Alginatproduktion reduziert ist12,14. Es gibt mehrere Antivirulenztherapeutika in der Entwicklung, die auf das Alginatprotein abzielen, wo dieses Modell nicht geeignet wäre, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen, und bei denen es vorteilhafter wäre, die Alginatproduktion direkt zu messen oder eine funktionelle Auslesungdurchzuführen 44. Darüber hinaus können einige Antivirulenztherapien auf verschiedene Stadien der Alginatbiosynthese oder -regulation abzielen, so dass die Messung der Alginatproduktion den Nettoeffekt der Therapie auf den Virulenzfaktordirekt erfasst 44. Nichtsdestotrotz zielen einige der Anti-Virulenz-Therapien in aktuellen Studien auf wichtige Alginatgene ab, und Genexpressionsmodelle wie diese wären geeignet, um die Auswirkungen solcher Therapien zu untersuchen13,14. Techniken wie diese können auch leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden, da sie eine schnelle Beurteilung mehrerer Proben oder Erkrankungen ermöglichen, was in groß angelegten Studien mit einem ersten Screening potenzieller Anti-Virulenz-Verbindungen von Vorteil ist.

Insgesamt stellen Einzel- und Mehrspezies-Biofilmmodelle wertvolle Werkzeuge dar, um die Expression infektionsrelevanter Gene von P. aeruginosa unter CF-geeigneten Bedingungen zu untersuchen. Die groß angelegte Einführung der Modulatortherapie hat die Landschaft der CF-Gesundheitsversorgung revolutioniert. Trotz des vielfältigen klinischen Nutzens von CF-Modulatoren haben Studien jedoch gezeigt, dass klonale Linien von Pseudomonas bis heutezirkulieren, was unterstreicht, dass neue Therapien zur Behandlung von P. aeruginosa-Lungeninfektionen noch erforderlich sind45,46. Trotz der diskutierten Einschränkungen könnte die Anwendung dieser Modelle in der Entdeckungsphase der Wirkstoffentwicklungspipeline nützlich sein, um die Wirksamkeit von Wirkstoffen in der CF-Lungennische und die Wechselwirkungen neuartiger Antivirulenzsubstanzen mit bekannten Antibiotika in diesem Umfeld zu bewerten.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

HL, DN und JF erhielten Zuschüsse für das Strategic Research Centre (SRC) Ein evidenzbasierter präklinischer Rahmen für die Entwicklung von antimikrobiellen Therapeutika bei Mukoviszidose (PIPE-CF; Projekt-Nr. SRC 022) des UK Cystic Fibrosis Trust und der US Cystic Fibrosis Foundation. TH wird durch ein Doktorandenstipendium der MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership unterstützt. Wir danken der CF Trust and CF Foundation (SRC022) und dem MRC DiMEN DTP-Programm für die Finanzierung

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Breathe-Easy-Dichtungsmembran für Multiwell-PlattenSigma Aldrich 
Bunsenbrenner
Cellulase (100 mg/ml)Cambridge Bioscience HY-B2220-5g
CN Ergänzung Sigma Aldrich 1.07624
Direct-Zol RNA Miniprep KitZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
DNase/Rnase-freies WasserVWRJ60610. XC
Gentamycinsulfat (30 & Mikro; g/mL)Sigma Aldrich G3632
Glycerin (1 %)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master MixPromega A6101
iScript Cdna-Synthese-Kit Bio-Rad1708890
Penicillin (250 U/ml)Wissenschaftliches LaborzubehörP3032-10MU
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit Thermo Fisher ScientificQ10210
Qubit-RöhrchenThermo Fisher ScientificQ32856
Resazurin-Lösung (0,02 %)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomycin (250 & Mikro; g/mL)Sigma Aldrich S9137
Thermocycler (wir haben den T100 Thermocycler verwendet)Biorad1861096
TRIzol Reagenz Invitrogen15596026
Vancomycin (3 & Mikro; g/mL)Sigma Aldrich 
Z7636241709007

Referenzen

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