Methodenartikel

Nachweis von regulierten Mutterkornalkaloiden in Lebensmittelmatrizen mittels Flüssigchromatographie-Mobilitätsspektrometrie-Flugzeitspektrometrie

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DOI:

10.3791/67484

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22. November 2024

 ,  ,  , 
1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, 2Department of Preventive Medicine and Public Health, Food Science, Toxicology and Forensic Medicine, Faculty of Pharmacy and Food Science, University of Valencia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine validierte Massenspektrometrie mit Flüssigchromatographie, Ionenmobilität und hoher Auflösung vor, um das Vorhandensein von Mutterkornalkaloiden in Lebensmitteln in Übereinstimmung mit der kürzlich veröffentlichten Verordnung (EU) 2023/915 der Kommission zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IMS) fungiert als zusätzliche Trenndimension, wenn sie in Arbeitsabläufe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) integriert wird. LC-IMS-MS-Methoden bieten im Vergleich zu herkömmlichen LC-MS-Methoden eine höhere Peakauflösung, eine verbesserte Trennung von isobaren und isomeren Verbindungen und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis (S/N). IMS bietet eine weitere molekulare Eigenschaft für die Identifizierung von Analyten, nämlich den Kollisionsquerschnittsparameter (CCS), der falsch positive Ergebnisse reduziert. Daher adressieren LC-IMS-MS-Methoden wichtige analytische Herausforderungen im Bereich der Lebensmittelsicherheit (d.h. Nachweis von Verbindungen in Spurenmengen in komplexen Lebensmittelmatrizen und eindeutige Identifizierung von isobaren und isomeren Molekülen).

Mutterkornalkaloide (EAs) sind eine Familie von Mykotoxinen, die von Pilzen produziert werden und eine Vielzahl von Grasarten befallen, darunter kleine Getreidesorten wie Roggen, Triticale, Weizen, Gerste, Hirse und Hafer. In mehreren Lebensmitteln wurden Höchstgehalte (ML) dieser Mykotoxine festgelegt, wie in der Verordnung (EG) 2023/915 der Kommission festgelegt. Diese neue Gesetzgebung umfasst sechs Haupt-EAs und ihre entsprechenden Epimere, so dass eine effiziente Methodik erforderlich ist, um diese isomeren Moleküle unter Berücksichtigung ihres gemeinsamen Auftretens richtig zu unterscheiden.

Daher ist es das Ziel dieses Protokolls zu zeigen, wie die Integration von IMS in LC-MS-Arbeitsabläufe zur Trennung isomerer EAs beiträgt und die Selektivität der Analysemethode erhöht. Darüber hinaus wird veranschaulicht, wie die Generierung von CCS-Bibliotheken durch die Charakterisierung analytischer Standards eine höhere Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Mykotoxinen bietet. Mit diesem Protokoll sollen die Vorteile der Umsetzung von IMS im Bereich der Lebensmittelsicherheit am Beispiel der Bestimmung von EA in Getreide klar erläutert werden. Eine QuEChERS-basierte Extraktion, gefolgt von einer LC-gefangenen Ionenmobilitätsspektrometrie (TIMS)-MS-Analyse, ergab Bestimmungsgrenzen von 0,65 bis 2,6 ng/g mit akzeptabler Genauigkeit (wenn auch geringe Wiederfindung für Ergotaminin) bei 1,5x, 1x und 0,5x der ML und zeigte einen vernachlässigbaren Matrixeffekt.

Einleitung

Die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IMS) wird zu einer zunehmend eingesetzten Analysetechnik, die oft als zusätzliche Trenndimension in die traditionelle Flüssigkeits-/Gaschromatographie (LC/GC) integriert und an MS-Arbeitsabläufe gekoppelt ist. IMS besteht aus der Trennung von Molekülen entlang einer Mobilitätszelle, die mit einem Puffergas gefüllt ist, unter einem elektrischen Feld und bei Atmosphärendruck1. Abhängig vom Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) und der geometrischen Konformation interagiert ein ionisiertes Molekül mit dem Puffergas, während es sich durch die Mobilitätszelle bewegt, was sich im Ionenmobilitätsparameter (K)2 widerspiegelt und durch die folgende Gleichung berechnet wird:

figure-introduction-1

Dabei steht D für die Gesamtdriftlänge, td für die Gesamtdriftzeit und E für das elektrische Feld. Daher wird K in m2 V−1 s−1 gemessen, obwohl es aus praktischen Gründen oft als cm2 V−1 s−1 ausgedrückt wird. Die intrinsische Fähigkeit, sich durch die Mobilitätszelle zu bewegen, kann anhand der Driftzeit gemessen und später in den sogenannten Kollisionsquerschnitt (CCS)-Wert umgerechnet werden, der für jedes Molekül unabhängig vom IMS-Instrument3 ein hochgradig reproduzierbarer Parameter ist. Die CCS kann aus der Mobilität nach folgender Gleichung abgeleitet werden:

figure-introduction-2

q ist die Ladung des Ions; N die Dichte der Puffergaszahl; μ die reduzierte Masse der Kollisionspartner puffert Gas-Ionen; kB die Boltzmann-Konstante; und T die Temperatur des Puffergases. Daher bietet IMS zusätzliche Informationen, die die analytischen Daten aus der Chromatographie und MS-Analyse ergänzen.

Es hat sich gezeigt, dass die Implementierung von IMS in LC-MS-Plattformen die Zuverlässigkeit analytischer Bestimmungen erhöht, insbesondere bei der Arbeit mit Verbindungen, die in Spurenkonzentrationen vorliegen. Mehrere Studien haben berichtet, dass LC-IMS-MS-Methoden die Qualität der Massenspektren verbessern, indem sie das Hintergrundrauschen reduzieren, was sich letztendlich auf die Empfindlichkeit der Methode auswirkt, und die Rate falsch positiver und negativer Ergebnisse durch LC-MS-Methoden mit mehreren Resten reduziert 4,5,6. Darüber hinaus ermöglicht die Reproduzierbarkeit der CCS-Werte den Vergleich nicht nur zwischen verschiedenen Instrumenten, die dieselbe Technologie verwenden, sondern auch zwischen verschiedenen Ionenmobilitätstechnologien, nämlich der Wanderwellen-Ionenmobilitätsspektrometrie (TWIMS), der Mobilitätsspektrometrie gefangener Ionen (TIMS) und der Driftröhren-Ionenmobilitätsspektrometrie (DTIMS)2,7, die die am häufigsten verwendeten Systeme sind 1. Eine bemerkenswerte Konsequenz des Potenzials von CCS als Identifikationsparameter liegt daher in der Möglichkeit, CCS-Bibliotheken aufzubauen, was sich in seiner Anwendbarkeit in Metabolomik-Studien widerspiegelt8. Nichtsdestotrotz ist eine der leistungsfähigsten Eigenschaften von IMS die Fähigkeit, isomere und isobare Verbindungen zu trennen, die mit LC-MS-Methoden möglicherweise nicht ausreichend aufgelöst werden können. Dies kann der Fall sein, wenn mit großen Mengen von Analyten von Interesse in komplexen Matrices gearbeitet wird, was in der Umwelt- und Lebensmittelanalytik häufig der Fall ist. In diesem Zusammenhang wurden LC-IMS-MS-Methoden für die Überwachung von Pestiziden und in geringerem Maße von Tierarzneimitteln und Mykotoxinen in Lebensmitteln vorgeschlagen9.

Aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens und ihrer Selektivität erweisen sich LC/GC-IMS-MS-Plattformen als die nützlichsten Werkzeuge, um einige der aktuellen Herausforderungen in der Lebensmittelsicherheit zu bewältigen, insbesondere im Zusammenhang mit isomeren Gemischen. Die gesundheitlichen Bedenken in Bezug auf isomere Gemische als Lebensmittelkontaminanten spiegeln sich in den geltenden europäischen Rechtsvorschriften wider, die beispielsweise die Höchstkonzentration von sechs Hauptmutterkornalkaloiden (EA) und den entsprechenden sechs Epimeren in mehreren Lebensmitteln begrenzen10.

EAs stellen eine Familie toxischer Sekundärmetaboliten dar, die von einer Vielzahl von Pilzen produziert werden, hauptsächlich aus der Familie der Clavicipitaceae (z. B. Claviceps purpurea, der aufgrund seines breiten Wirtsspektrums der wichtigste EA-Produzent ist), aber auch von Trichocomaceae, die den Samenkopf lebender Pflanzen (wie Roggen, Gerste, Weizen und Hafer) zum Zeitpunkt der Blüte parasitieren können11. 12. Schadenfreude Unter bestimmten Bedingungen, insbesondere bei Temperatur und Wasseraktivität, können Clavizeps-Pilze EAs produzieren, die sich in Fruchtkörpern, den sogenannten Sklerotien oder Mutterkorn, in der Wirtskultur anreichern. Bis zu einem gewissen Grad können EAs der Verarbeitung des Rohstoffs bis zum Erreichen des Endprodukts standhalten; daher in die Nahrungskette einzubrechen. Die Einnahme kontaminierter Lebensmittel kann zu einer EA-Vergiftung führen, die als Ergotismus bekannt ist und sich mit akuten Symptomen wie Bauchschmerzen, Erbrechen, Brennen der Haut, Schlaflosigkeit und Halluzinationen äußert13. Um die Auswirkungen von EA auf die menschliche Gesundheit zu verringern, hat die Europäische Kommission in mehreren Lebensmitteln Höchstgehalte für die Summe der wichtigsten EA festgelegt: die R-Epimere Ergometrin (Em), Ergotamin (Et), Ergosin (Es), Ergocristin (Ecr), Ergokryptin (Ekr) und Ergocornin (Eco) und die entsprechenden S-Epimere: Ergometrinin (Emn), Ergosinin (Esn), Ergotaminin (Etn), Ergocorninin (Econ), Ergokryptinin (Ekrn), und Ergocristinin (Ecrn). Diese Verbindungen können von R- in S-Formen und umgekehrt epimerisieren, insbesondere bei starker Lichteinwirkung, längerer Lagerung oder Kontakt mit einigen Lösungsmitteln bei hohem oder niedrigem pH-Wert von 12. Obwohl der Anteil der R- und S-Formen unter verschiedenen Bedingungen variieren kann, stellte das CONTAM-Gremium der EFSA nach Überprüfung der verfügbaren Literatur zu EA in Lebensmitteln ein höheres Vorkommen von R-Formen als von S-Formen fest 14. Daher variieren die MLs in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, wie z. B. der Anfälligkeit der Pflanze, dem Verarbeitungsgrad oder der Häufigkeit des Verbrauchs. Im EU-Rahmen wurden die Mindestwertmengen für gemahlene Erzeugnisse aus Gerste, Weizen, Dinkel und Hafer auf 50 bzw. 150 μg/kg (je nach Aschegehalt von weniger oder mehr als 900 mg/100 g) festgesetzt, während für Getreide, das direkt für den menschlichen Verzehr bestimmt ist, ein Mindestwert von 150 μg/kg erhoben wird, mit Ausnahme von Säuglingsnahrung auf Getreidebasis. in denen das ML auf 20 μg/kgreduziert wird 10.

Diese strenge Gesetzgebung erfordert Analysemethoden, die empfindlich genug sind, um die Spurenkonzentration (μg/kg) zu bestimmen und gleichzeitig regulierte EAs und ihre entsprechenden Epimere ordnungsgemäß zu identifizieren, da beide Formen, R- und S-Isomere, zusammen in kontaminierten Proben gefunden werden können. Diese Aufgabe stellt eine große Herausforderung dar, da jedes Toxin-Epimer-Paar genau die gleiche Masse und das gleiche Fragmentierungsmuster aufweist. Darüber hinaus kann eine ordnungsgemäße chromatographische Trennung zwischen beiden Verbindungen komplex sein. Daher sind gut optimierte LC-Gradienten erforderlich, um Fehlquantifizierungen zu vermeiden, wenn EA-Epimere in Lebensmittelproben gleichzeitig auftreten. Obwohl mehrere Studien über LC-MS-Methoden zur eindeutigen Bestimmung von EAs berichtet haben 15,16,17,18, muss die chromatographische Methode umfassend untersucht werden, um eine angemessene Trennung der chromatographischen Peaks zu erreichen und EAs eindeutig zu identifizieren. Dies ist jedoch bei Mehrklassenmethoden, bei denen Kontaminanten, die zu verschiedenen chemischen Familien gehören, gleichzeitig bestimmt werden, in der Regel nicht realisierbar. In diesem Zusammenhang berichtete eine kürzlich von Carbonell-Rozas, Hernández-Mesa et al.19 durchgeführte Studie über eine LC-IMS-MS-Methode zur Quantifizierung von EAs in Weizen- und Gerstenproben, bei der zwei verschiedene TWIMS-Instrumente verwendet wurden, die reproduzierbare CCS-Werte und niedrige Bestimmungsgrenzen (LOQs) lieferten, um eine Nichteinhaltung in Übereinstimmung mit den geltenden Rechtsvorschriften zu erkennen. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls zu zeigen, wie die Integration von IMS in LC-MS-Arbeitsabläufe zur Trennung isomerer EAs beiträgt und die Selektivität der Analysemethode erhöht. Darüber hinaus wird veranschaulicht, wie die Generierung von CCS-Bibliotheken durch die Charakterisierung analytischer Standards eine höhere Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Mykotoxinen bietet. Mit diesem Protokoll sollen die Vorteile der Implementierung von IMS in der Lebensmittelsicherheitsanalyse am Beispiel der Bestimmung von EA in Getreide klar erläutert werden. Dieses Protokoll befasst sich mit der Probenbehandlung auf der Grundlage eines QuEChERS-Verfahrens, der Probenanalyse mittels LC-TIMS-MS und der IMS-Datenextraktion und -interpretation.

Protokoll

1. Vorbereitung von Lager-, Zwischen- und Arbeitsstandardlösungen

HINWEIS: Verwenden Sie Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille.

  1. Bereiten Sie einzelne Stammlösungen der 12 EAs (siehe Materialtabelle) bei 10.000 ng/ml in 4-ml-Braunglasfläschchen mit Acetonitril her. Die R-Formen (-ine) wurden zuvor in 25.000 ng-Portionen aliquotiert, während die S-Formen (-inin) in 10.000 ng-Portionen verteilt waren. Diese Studie begann mit diesen Aliquoten und erreichte Konzentrationen von 10.000 ng/ml, indem die R- und S-Formen in 2,5 bzw. 1 ml Acetonitril verdünnt und anschließend 2 Minuten lang vortexiert wurden.
  2. Bereiten Sie eine Zwischenlösung mit 1.000 ng/ml Gesamt-EAs (jeweils 83,33 ng/ml) in einem 12-ml-Braunglasfläschchen vor, indem Sie 65 μl jeder einzelnen Alkaloidlösung und 7,02 mL Acetonitril hinzufügen.
    HINWEIS: Sobald die Zwischenlösung hergestellt ist, müssen die einzelnen Stammlösungen getrocknet und bei -20 °C mit Aluminiumfolie abgedeckt gelagert werden, um eine Epimerisierung zu vermeiden.
  3. Bereiten Sie funktionierende Standardlösungen aus der Zwischenlösung her, indem Sie 2,7, 1,8 und 0,9 ml in 4-ml-Braunglasröhrchen pipettieren. Bringen Sie sie unter einen sanften Stickstoffstrahl zum Trocknen und resuspendieren Sie sie in 600 μl Acetonitril.
    HINWEIS: Die resultierenden Konzentrationen erreichten das 1,5-, 1- und 0,5-fache des ml-Gehalts (150 ng/g), wenn 50 μl zu 1 g der Probe hinzugefügt wurden. Diese werden als Konzentrationsniveaus für Validierungsstudien (d. h. Wiederfindungen, Wiederholbarkeit usw.) ausgewählt.
  4. Teilen Sie die 600 μl jeder Arbeitsstandardlösung in drei 2-ml-Braunglasfläschchen auf, indem Sie 200 μl pipettieren und bis zum Trocknen bringen.
    HINWEIS: Die Schritte 1.2 bis 1.4 sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Durch die Teilung und Trocknung der Arbeitsstandardlösungen ist es möglich, an drei verschiedenen Tagen, wie in der Validierungsstudie gefordert, dreifach anzureichern, ohne die chemische Integrität der EAs zu verlieren.
  5. An jedem Validierungstag resuspendieren Sie ein 2-ml-Braunglasfläschchen jeder Anreicherungsstufe in 200 μl Acetonitril.
    HINWEIS: Jeder Anreicherungsgrad wird in dreifacher Ausfertigung mit 50 μl pro Probe bewertet; Daher werden insgesamt 150 μl der Lösung verwendet.

2. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen

HINWEIS: Verwenden Sie Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille.

  1. Bereiten Sie eine 5 mM Ammoniumcarbonatlösung her, indem Sie 24,02 mg Ammoniumcarbonat wiegen und in 50 mL Wasser auflösen. Wiegen Sie 24,02 mg Ammoniumcarbonat in ein Becherglas und fügen Sie ca. 5 ml Wasser hinzu. Lösen Sie das Ammoniumcarbonat auf, indem Sie die Lösung vorsichtig manuell umrühren, und geben Sie sie dann in einen 50-ml-Messkolben. Um das endgültige Volumen von 50 mL zu erreichen, spülen Sie das Becherglas mit zusätzlichem Wasser aus und übertragen Sie den Auftrieb in den Messkolben.
  2. 250 ml der Extraktionslösung [Acetonitril: 5 mM Ammoniumcarbonat (85:15, v/v)] werden durch Mischen von 212,5 ml Acetonitril und 37,5 ml der in Schritt 2.1 hergestellten Ammoniumlösung hergestellt.
  3. Bereiten Sie 100 ml eines Methanol-Wasser-Gemisches (1:1, v/v) vor, um die Probenextrakte zu resuspendieren (Schritt 8.8).
  4. Für jede Probe werden 150 mg eines dispersiven Festphasenmaterials C18:Zirkonoxid-basiertes Sorptionsmittelgemisch (1:1, w/w) in 15-ml-Zentrifugenröhrchen für die dispersive Reinigungsstufe (Schritt 8.5.) gewogen.
  5. Die Lösungsmittel werden für die chromatographische Trennung in zwei verschiedenen Flaschen vorbereitet, nämlich 1 l Reinstwasser (Lösungsmittel A) und Methanol (Lösungsmittel B), die beide 0,3 % (v/v) Ameisensäure enthalten. Um diese Konzentration zu erreichen, wurden 3,03 mL Ameisensäure (99 % Reinheit) in die Flaschen gegeben.
    HINWEIS: Lösungsmittel für die mobile Phase sollten kurz vor der Durchführung der LC-IMS-MS-Analysen vorbereitet werden.

3. Einstellen von instrumentellen Parametern

HINWEIS: Das Instrument, das zur Durchführung dieser LC-IMS-MS-Studie verwendet wurde, war ein UHPLC-Gerät, das mit einem IM-HRMS gekoppelt war und mit einer vakuumisolierten sonde mit beheizter Elektrospray-Ionisation (VIP-HESI) ausgestattet war. Das Gerät wurde im positiven Modus betrieben.

  1. Erstellen Sie mit der Erfassungssoftware eine chromatographische Methode für die Trennung der Analyten, indem Sie den folgenden Elutionsgradienten einstellen: 0 min, 10% B; 2 min, 10% B; 4,5 Minuten, 40% B; 9 min, 45% B; 11 min, 95% B; 12 min, 95% B; 13 Minuten, 10% B; 16 Minuten, 10% B.
  2. Stellen Sie die Flussrate der mobilen Phase auf 0,4 mL/min, die Säulentemperatur auf 35 °C und das Injektionsvolumen auf 5 μl ein. Wenn möglich, halten Sie eine feste Temperatur von 10 °C im Autosampler.
  3. Stellen Sie die IMS-Parameter wie folgt ein: Mobilitätswerte (1/K0) von 0,1 bis 1,5 Vμs/cm2; Rampenzeit, 100 ms; Genauigkeitszeit, 10 ms; Einschaltdauer, 10%; und Rampenrate von 9,05 Hz.
  4. Stellen Sie die Parameter der Ionenquelle für die MS-Detektion wie folgt ein: Kapillarspannung, 2.500 V; Verneblerdruck, 2,5 bar; Durchfluss bei trockenem Gas, 8 l/min; Temperatur des trockenen Gases, 200 °C; Temperatur des Mantelgases, 450 °C; Durchflussmenge des Mantelgases, 4 L/min. Für die MS-Erfassung wählen Sie die folgenden Parameter unter Berücksichtigung von zwei Scan-Ereignissen: vollständige Abtastung des gesamten Massenspektrums mit einem m/z von 20 bis 1.300 , gefolgt von bbCID (Broadband Collision-Induced Dissociation), die Produktionsionen aus einem beliebigen Vorläufer bei drei festen Kollisionsenergien von 24, 36 und 50 eV erzeugt. Führen Sie Ionisation und Datenerfassung im Modus mit positiver Polarität durch.
  5. Speichern Sie diese Datei mit der Erfassungsmethode zur weiteren Verwendung.

4. Datenerfassung aus analytischen Standards der Umweltverträglichkeitsprüfungen

HINWEIS: Verwenden Sie Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille nur für Schritt 4.1.

  1. Bereiten Sie zwei braune 1,5-ml-Fläschchen mit 500 μl Zwischenlösung bei 1.000 ng/mL und ein weiteres Fläschchen mit einer Mischung aus Lösungsmitteln A und B (1:1, v/v) als Waschlösung vor.
  2. Kalibrieren Sie das timsTOF-Gerät wie vom Hersteller angegeben und wählen Sie eine positive Polarität sowohl für IMS- als auch für MS-Erfassungen.
  3. Setzen Sie die C18-Säule (siehe Materialtabelle) in den LC-Ofen ein, wobei die Temperatur auf 35 °C eingestellt ist, wie in der in Schritt 3.5 gespeicherten Datei mit der Erfassungsmethode angegeben.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Enden gut angezogen sind. Andernfalls wird eine Leckage der mobilen Phase beobachtet.
  4. Konditionieren Sie die LC-Säule so, dass eine Flussrate der mobilen Phase von 0,1 ml/min möglich ist, und wählen Sie ein Lösungsmittel-A- und B-Mischungsverhältnis von 90:10 (%) als anfängliches Zusammensetzungsverhältnis der mobilen Phase.
  5. Warten Sie, bis der Säulendruck stabil ist (~130 bar).
  6. Erhöhen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase auf 0,2 mL/min, warten Sie, bis sich der Druck stabilisiert hat, und erhöhen Sie sie erneut auf 0,3 mL/min.
  7. Sobald sich der Druck wieder stabilisiert hat, stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 ml ein, was der Arbeitsdurchflussrate entspricht, wie in der in Schritt 3.5 gespeicherten Erfassungsmethodendatei beschrieben, und warten Sie, bis sich der Druck bei etwa 350 bar stabilisiert hat.
    HINWEIS: Es ist wichtig, den Durchfluss nicht direkt von 0,2 auf 0,4 ml/min zu erhöhen. Eine starke Änderung der Strömung provoziert Hochdruckspitzen, die die Chromatographiesäule beschädigen können.
  8. Während die Säule konditioniert wird, ist die Arbeitsliste zu schreiben, die zwei Proben enthält, die den beiden Fläschchen entsprechen, die die EA-Zwischenlösung bei 1.000 ng/ml enthalten, wie in Schritt 4.1 beschrieben, und das Waschfläschchen. Analysieren Sie das Waschfläschchen zweimal, zu Beginn und am Ende der Probencharge.
  9. Laden Sie in der Spalte Methodendatei des Arbeitsvorrats die zuvor in Schritt 3.5 gespeicherte Erfassungsmethodendatei.
  10. Erstellen Sie einen Ordner, in dem Sie alle erfassten Datendateien speichern und alle Samples weiterleiten können, indem Sie den Ordner in der Spalte Sample-Pfad auswählen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie denselben Ordner verwenden, um alle während der Validierungsstudie generierten Dateien für die weitere Verarbeitung zu speichern. Während der Säulenkonditionierung können die Werte, bei denen sich der Druck stabilisiert, leicht variieren. Stellen Sie jedoch sicher, dass der Druck stabil ist, bevor Sie die Durchflussrate erneut erhöhen, um die Integrität der Säule zu erhalten. Darüber hinaus muss bei Erreichen des Arbeitsdurchflusses auch der Druck stabil sein, um eine reproduzierbare chromatographische Trennung zu erreichen.
  11. Gehen Sie in die obere Symbolleiste der Software und führen Sie den Arbeitsvorrat aus.

5. Datenaufbereitung zur Erstellung einer Quantifizierungsmethode

  1. Sobald der Arbeitsvorrat ausgeführt ist, öffnen Sie die qualitative Software.
  2. Laden Sie alle analysierten Proben, indem Sie auf Datei | Arbeitsvorrat öffnen.
  3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine Probe, die der Zwischenlösung des EAs bei 1.000 ng/ml entspricht, gehen Sie zu Chromatogramm bearbeiten und wählen Sie dann Typ | Extrahiertes Ionenchromatogramm und Eingabe der theoretischen Molekülmasse des protonierten Ions in Bezug auf jedes EA. Klicken Sie dann auf Hinzufügen und schließlich auf OK. Da der Satz von Analyten aus sechs EAs und ihren verwandten Epimeren besteht, die genau die gleiche Masse haben, erscheinen sechs extrahierte Ionenchromatogramme.
    HINWEIS: Mit dem Parameter "Breite" wird geändert, wie schmal das m/z-Fenster ist. Es wird empfohlen, ein ausreichend breites m/z-Fenster zu wählen, falls es schwierig ist, den chromatographischen Peak des interessierenden Analyten zu finden. Es ist jedoch ratsam, schmale m/z-Fenster einzustellen, um mögliche Interferenzen zu vermeiden (unter 0,05 Einheiten).
  4. In jedem extrahierten Ionenchromatogramm erscheinen zwei chromatographische Peaks, die sich auf den Haupt-EA und sein Epimer beziehen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während Sie den gesamten Bereich eines Peaks auswählen. Folglich wird das Ionenmobilitätsspektrum direkt darunter auftauchen.
  5. Wechseln Sie zur x-Achse des Ionenmobilitätsspektrums, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und klicken Sie dann auf Kollisionsquerschnitt. Notieren Sie sich den CCS-Wert.
    HINWEIS: Wenn die CCS-Werte nicht automatisch angezeigt werden, gehen Sie in der oberen Symbolleiste zu Kalibrieren , dann zu Mobilitätsrechner und geben Sie den Mobilitätswert manuell ein, um den entsprechenden CCS-Wert zu erhalten.
  6. Wählen Sie den Bereich aus, der dem anderen chromatographischen Peak innerhalb desselben Ionenchromatogramms entspricht, und wiederholen Sie die Schritte 5.4. und 5.5.
  7. In ähnlicher Weise wird das Fragmentierungsmuster auch nach Schritt 5.4 angezeigt. Auf der Grundlage des in der Literatur und in Datenbanken berichteten Fragmentierungsmusters ist das intensivste Produktionsion als ergänzender Identifikationspunkt zu vergleichen und auszuwählen.
  8. Notieren Sie die Retentionszeit, den CCS-Wert und die genaue Masse des Hauptionenaddukts (in der Regel das protonierte Ion) jedes EA, um eine Quantifizierungsmethode zu erstellen.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 5.4 bis 5.8. für die übrigen Analyten.
  10. Wählen Sie alle in Schritt 5.3 erzeugten Molekülmassen aus, indem Sie sie bei gedrückter Strg-Taste anklicken. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Kopieren aus. Wechseln Sie zu dem anderen Beispiel, das der Zwischenlösung des EAs entspricht, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie Einfügen aus. Die Ionenchromatogramme und Mobilitätsspektren werden automatisch extrahiert.
  11. Überprüfen Sie die Identifizierungsparameter für alle Analyten in dieser zweiten Probe.

6. Erstellung eines Datenverarbeitungsverfahrens zur routinemäßigen Bestimmung von Mutterkornalkaloiden

  1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf die Registerkarte Methodenverwaltung .
  2. Klicken Sie auf Analyt-Einstellungen und geben Sie den Namen jedes EA zusammen mit seiner Retentionszeit, dem CCS-Wert und der Masse der protonierten Addukte ein, die in Schritt 5.4 gesammelt wurden. bis 5.9. Ändern Sie die Toleranz jedes Identifikationspunkts nach Bedarf, obwohl die Standardeinstellungen für die Anwendung dieses Protokolls empfohlen werden.
    HINWEIS: Je höher die eingestellten Toleranzwerte sind, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass es zu falsch positiven Ergebnissen kommt, da eine größere Abweichung von den theoretischen Werten akzeptiert wird. Ebenso können zu strenge Toleranzwerte zu falsch negativen Ergebnissen führen. Dies ist der Fall, wenn die Abweichung vom theoretischen Wert ausschließlich durch die Leistung des Instruments verursacht wird.
  3. Speichern Sie die Quantifizierungsmethode zur weiteren Verwendung.

7. Probenahme

  1. Sammeln Sie Proben von Weizen und Hafer in Supermärkten, vorzugsweise in 1-kg-Behältern, gemäß den von der Europäischen Kommission festgelegten Richtlinien für die Probenahme20. Wenn keine 1-kg-Packungen verfügbar sind, stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 50 g Proben haben, um die gesamte Analyse abzuschließen.
  2. Mahlen Sie die Proben mit einer Mühle. In dieser Studie wurde eine Messermühle verwendet, um den gesamten Inhalt der Verpackungen zu mahlen, die dann zur Homogenisierung in ihre ursprünglichen Verpackungen zurückgeführt wurden.
    HINWEIS: Reinigen Sie den Zerkleinerer zwischen den Proben gründlich, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie einen Laborkittel.
  3. Aliquotieren Sie die homogenisierten Proben in 50-ml-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie unter kühlen und trockenen Bedingungen.

8. Vorbereitung der Probe

  1. Erstellen Sie einen Zeitplan für die Durchführung der Validierungsstudie an drei nicht aufeinanderfolgenden Tagen (um die interne Reproduzierbarkeit zu bewerten). Bestimmen Sie jeden Tag drei Konzentrationsstufen, indem Sie die Proben mit 225 ng/g (1,5 ml), 150 ng/g (ML) und 75 ng/g (0,5 ml) anreichern. Untersuchen Sie jede Ebene in dreifacher Ausfertigung, was neun dotierten Proben plus weiteren drei Blindproben pro Tag entspricht.
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung der 3 Validierungstage werden insgesamt 36 Proben benötigt, zusammen mit weiteren 8 Leerproben, die für die Erstellung der matrixangepassten Kalibrierkurve bestimmt sind. Verwenden Sie Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille für diesen gesamten Abschnitt des Protokolls.
  2. 1 g der Probe wird in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gewogen.
    HINWEIS: Bei der Durchführung der Validierungsstudie sind die Proben unmittelbar nach dem Wiegen mit 50 μl der entsprechenden Arbeitsstandardlösung gemäß Schritt 1.3 anzureichern. und 1.5.
  3. Fügen Sie 4 mL der Extraktionslösung hinzu [Acetonitril: 5 mM Ammoniumcarbonat wässrige Lösung (85:15, v/v)]. Die Probe 1 Minute lang vortexen.
  4. Die Probe wird 5 Minuten lang bei 9.750 × g und 4 °C zentrifugiert.
    HINWEIS: Die Kapazität der Zentrifuge kann ein limitierender Faktor im Verfahren sein, daher wird empfohlen, gleichzeitig nur die genaue Anzahl von Proben zu extrahieren, die in die Zentrifuge passen.
  5. Der gesamte Überstand wird in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, das 150 mg des Reinigungssorbens (1:1, w/w) enthält. Die Probe 1 Minute lang vortexen.
  6. Das Röhrchen wird 5 min lang bei 9.750 × g und 4 °C zentrifugiert.
  7. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein 4-ml-Braunglasfläschchen. Verdampfen Sie den Extrakt unter einem sanften Stickstoffstrahl.
    HINWEIS: Die Proben müssen bei -20 °C getrocknet werden, wenn sie nicht am selben Tag analysiert werden.
  8. Die Probe wird in 750 μl des Methanol-Wasser-Gemisches (1:1, v/v) rekonstituiert.
  9. Übertragen Sie den Extrakt in eine 2-ml-Spritze und filtrieren Sie ihn durch einen 0,22-μm-Nylonfilter in ein 1,5-ml-Bernstein-Chromatographiefläschchen.
  10. Sammeln Sie die rekonstituierten Extrakte der acht Blindproben, die für die matrixangepasste Kalibrierkurve vorgesehen sind, in ein 12-ml-Braunglasfläschchen (jede Probe wird in 750 μl resuspendiert, was einem Gesamtvolumen von 6 mL entspricht).
  11. 1 ml der Zwischenlösung mit 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml für jedes Mutterkornalkaloid) (Schritt 1.2) in ein 2-ml-Braunglasfläschchen pipettieren, das Lösungsmittel unter einem sanften Stickstoffstrahl trocknen und den zuvor entnommenen Blindprobenextrakt in 1 ml resuspendieren.
    HINWEIS: Diese Mischung in einer Konzentration von 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml für jeden EA) wird verwendet, um die matrixangepasste Kalibrierkurve zu erstellen.
  12. Bereiten Sie zehn 2-ml-Braunglasfläschchen vor und geben Sie jeweils 450 μl Blindprobenextrakt (Schritt 8.10) hinein und markieren Sie sie mit Ziffern von 1 bis 10. Jedes Fläschchen ist ein Punkt der Kalibrierkurve.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 450 μl verwendet, da dies der niedrigste Wert war, den das LC-Gerät ohne Verwendung von Einsätzen im Inneren des Fläschchens erreichen konnte. Wenn die Nadel nicht so weit in das Fläschchen hineinreicht, vergrößern Sie das Volumen und berechnen Sie daher, wie viele zusätzliche Blindproben entnommen werden sollten, wobei zu berücksichtigen ist, dass jede einzelne in 750 μl Methanol:Wasser-Gemisch (1/1, v:v) resuspendiert wird.
  13. Erstellen Sie die Kalibrierkurve durch serielle Verdünnung. 450 μl der in Schritt 8.11 hergestellten Mischung werden übertragen. in Fläschchen 1, das bereits 450 μl Blindprobenextrakt enthält, um eine Konzentration von 41,67 ng/mL (den höchsten Kalibrierpunkt) zu erreichen. Das Fläschchen 2 Min. lang einreiben.
    HINWEIS: Das Volumen der Mischung muss mit dem Volumen des Leerprobenextrakts übereinstimmen, um in jedem Schritt zweimal verdünnt zu werden.
  14. Übertragen Sie 450 μl aus Fläschchen 1 in Fläschchen 2, das bereits 450 μl Blindprobenextrakt enthält, um eine Konzentration von 20,83 ng/ml (den zweithöchsten Kalibrierpunkt) zu erreichen.
  15. Wiederholen Sie Schritt 8.14 (d. h. von Fläschchen 2 zu Fläschchen 3 usw.) und fahren Sie anschließend fort, bis die zehn Kalibrierpunkte erreicht sind. Der Konzentrationsbereich für jeden EA beträgt dann: 41,67, 20,83, 10,42, 5,21, 2,60, 1,30, 0,65, 0,33, 0,16 und 0,08 ng/ml.
  16. Eine Standardmischung mit 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml für jeden EA) wird wie in Schritt 8.11 beschrieben, jedoch unter Verwendung von 1 ml Methanol:Wasser-Gemisch (1:1, v/v) hergestellt.
  17. Bereiten Sie eine Standardkalibrierkurve vor, wie in den Schritten 8.13 bis 8.15 beschrieben, jedoch unter Verwendung von 450 μl Methanol:Wasser-Gemisch (1:1, v/v) für die seriellen Verdünnungen. Diese Kalibrierkurve wird verwendet, um den Matrixeffekt zu bewerten, indem sie mit der matrixangepassten Kalibrierkurve verglichen wird.

9. Quantitative Datenaufbereitung

  1. Initialisieren Sie das Gerät und führen Sie es gemäß den in Schritt 4.1 beschriebenen Anweisungen aus. bis 4.11. In Abbildung 2 finden Sie den Arbeitsvorrat, der in diesem Protokoll verwendet wird.
    HINWEIS: Wenn Sie die Arbeitsliste für Kalibrierkurven schreiben, injizieren Sie diese vor den angereicherten Proben, beginnend mit der Standard-Kalibrierkurve von der niedrigsten zur höchsten Konzentration, einem Waschfläschchen mit Methanol:Wasser (1:1, v/v) und der matrixangepassten Kalibrierkurve von der niedrigsten zur höchsten Konzentration.
  2. Öffnen Sie die quantitative Software und navigieren Sie zum TASQ-Quick-Tab | Stapel importieren unten links.
  3. Wählen Sie den Ordner aus, der in Schritt 4.10 erstellt wurde. mit allen Rohdaten (Dateien, die sich auf die Informationen beziehen, die nach der LC-IMS-MS-Analyse für alle in der Arbeitsliste enthaltenen Proben erfasst wurden).
  4. Gehen Sie nach dem Import in die Software zu Stapel verarbeiten, direkt unter Stapel importieren.
  5. Wählen Sie die zu verarbeitenden Proben (d. h. die 27 dotierten Proben, 9 Leerproben und beide Kalibrierungskurven) und die Datenverarbeitungsmethode, die zuvor in Schritt 6.1 erstellt wurde. bis 6.3. Es öffnet sich ein Fenster mit verschiedenen Parametern, die eingestellt werden können (z. B. die Art des Integrators zur Bewertung der chromatographischen Peaks oder die Art des zu berücksichtigenden analytischen Signals). Ändern Sie diese Parameter wie gewünscht, obwohl die Standardwerte für die Ausführung dieses Protokolls geeignet sind.
  6. Gehen Sie nach Abschluss der Datenverarbeitung zu Screening überprüfen und prüfen Sie, ob es Probleme im Zusammenhang mit der automatischen Integration gibt, z. B. die Auswahl falscher chromatographischer Peaks, die möglicherweise zu nahe beieinander liegen. Wenn dies der Fall ist, schränken Sie die Werte ein, die sich auf die Toleranz der Verweildauer, die Toleranz der CCS-Werte und/oder den Massenfehler beziehen, die ursprünglich in der Datei mit der quantitativen Methode festgelegt wurden, und verarbeiten Sie die Daten erneut. Wenn die automatische Peakintegration immer noch falsche Peaks auswählt, integrieren Sie den Peak manuell, indem Sie den Bereich im Chromatogramm auswählen, der im Fenster "Screening überprüfen " angezeigt wird (berücksichtigen Sie dazu die analytischen Parameter, die für die EA-Standards in Abschnitt 5 erhalten wurden).
    HINWEIS: Es ist sehr wichtig, jede Probe zu überprüfen, da einige Haupt-EA-Epimer-Paare sehr ähnliche Retentionszeiten haben und von der Software falsch identifiziert werden können.
  7. Wenn alle Peaks für alle Proben erfolgreich integriert wurden, klicken Sie auf die Registerkarte Chargenverwaltung in der oberen linken Ecke und geben Sie die Art der Probe an, die mit jeder Analyse verbunden ist: Lösungsmittel, Leerprobe, Qualitätskontrolle, Probe oder Kalibrierpunkt. Im letzteren Fall weisen Sie jedem Kalibrierungspunkt eine Ebene mit einer Zahl zu.
  8. Navigieren Sie auf derselben Registerkarte "Chargenverwaltung " zum unteren Fenster mit dem Namen "Chargenkonzentration" und geben Sie einen Konzentrationswert für jede im vorherigen Schritt festgelegte Stufe an. Sobald dies erledigt ist, klicken Sie auf Konzentrationen speichern.
  9. Klicken Sie auf Batch quantifizieren und ändern Sie die Parameter wie gewünscht (d. h. das Modell, das an die Kalibrierungsdaten angepasst werden soll, die Gewichtung, ob das Modell gezwungen ist, Null zu überschreiten usw.). Für die Ausführung dieses Protokolls eignen sich die Standardwerte, mit Ausnahme der Gewichtung der Kalibrierkurven, die auf 1/x umgestellt wurde.
    HINWEIS: Da die Software jeweils nur eine Kalibrierkurve berücksichtigen kann, ist es notwendig, Schritt 9.9 zweimal zu wiederholen, um Informationen über Standard- und Matrix-angepasste Kalibrierkurven zu erhalten. In diesem Protokoll wurden matrixangepasste Kalibrierkurven für die Quantifizierung von Analyten verwendet, so dass zuerst die Lösungsmittel-Kalibrierkurven bewertet, Kalibrierdaten extrahiert wurden, wie später in Schritt 9.13 erläutert, und schließlich die matrixangepassten Kalibrierkurven ausgewählt wurden, um die Quantifizierung der Proben durchzuführen.
  10. Sobald die Quantifizierung der Mutterkornalkaloide gemäß der Datei mit der Quantifizierungsmethode durchgeführt wurde, klicken Sie auf die Registerkarte Quantifizierung im oberen Teil des Bildschirms.
  11. Wenn die in Schritt 9.9 eingestellten Standardparameter keine gute Linearität und Genauigkeit bieten, passen Sie die Kalibrierkurven an, indem Sie die Anpassung und das Gewicht ändern, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm klicken, mit dem Ziel, ein gutes lineares Modell (R2 > 0,99) mit ausreichender Genauigkeit auf jeder Kalibrierstufe (Abweichung unter 20%) zu erhalten.
    HINWEIS: Die Software markiert die Zellen der Kalibrierungsstufen, die nicht die richtige Genauigkeit bieten, rot.
  12. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Batch-Ordner ganz links auf dem Bildschirm und wählen Sie Bericht generieren. Wählen Sie dann Quantifizierung analysieren , um den Bericht in das gewünschte Format zu exportieren.

Ergebnisse

Zunächst wurden funktionierende Standardlösungen in das LC-IMS-MS-Instrument injiziert, um alle Identifikationsmerkmale (d.h. Retentionszeit, CCS und Massenspektren) jedes hier analysierten EA zu erhalten. Da die Identifikationsparameter, mit Ausnahme der genauen Masse, zunächst unbekannt waren, basierte die Erfassungsmethode auf einem Two-Scan-Ereignis, beginnend mit einem vollständigen Scan des gesamten Massenspektrums, gefolgt von einer bbCID. Die retrospektive Herangehensweise an diese Studie wird durch das hochauflösende Massenspektrometer Q-TOF ermöglicht, das Daten ohne Eingabe oder vorherige Information über die Analyten erfasst und generiert. Die exakte Masse jedes EA-Epimerpaares wurde in den erfassten Daten durchsucht, um auch ihre anderen Identifikationsmerkmale (d.h. Retentionszeiten und CCS-Werte) zu erhalten, die zur Erstellung einer quantitativen Methode für die Probendatenverarbeitung verwendet werden. Die experimentellen Parameter, die nach der Analyse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die chromatographische Trennung lieferte klare und gut aufgelöste Peaks für jedes Haupt-EA-Epimer-Paar mit Ausnahme von Et und Etn (Abbildung 3). Die Ähnlichkeiten zwischen den Retentionszeiten der chromatographischen Peaks von Et (6,85 min) und Etn (6,98 min) führten zu einer unzureichenden Auflösung zwischen ihnen, was eine leichte Überlappung aufweist und folglich zu einer Fehlquantifizierung führen kann, da die Retentionszeiten über die Läufe hinweg driften können. Nichtsdestotrotz wird in den Ionenmobilitätsspektren eine Basislinientrennung desselben Molekülpaares beobachtet (Abbildung 4), wodurch für jeden Analyten unterscheidbare CCS-Werte erhalten werden; Dies zeigt die Vorteile der Implementierung von IMS bei der Arbeit mit einer Reihe strukturell ähnlicher Verbindungen.

Nachdem die Identifizierungsparameter für jede EA festgelegt waren, wurde der Probensatz in Übereinstimmung mit den geltenden europäischen Rechtsvorschriften für die Validierung von Analysemethoden20 erstellt. Basierend auf dem von den europäischen Behörden festgelegten ML wurden drei Kalibrierstufen ausgewählt: der Grenzwert selbst (150 μg/kg), das 1,5-fache des ML (225 μg/kg) und das 0,5-fache des ML (75 μg/kg). Es ist sehr wichtig zu bedenken, dass dieses ML der Gesamtsumme der 12 EAs entspricht. Zu Validierungszwecken wurde ein gleicher Beitrag für die ML in Betracht gezogen; somit korrelierten die getesteten Konzentrationen mit 12,50, 18,75 bzw. 6,25 μg/kg für jeden EA. Darüber hinaus wurde ein Satz von acht Blindproben und zwei Kalibrierkurven in sauberem Lösungsmittel (Standard-Kalibrierkurve) zusammen mit einer matrixangepassten Kalibrierkurve hergestellt und innerhalb derselben analytischen Charge analysiert. Der lineare Bereich wurde über sieben Punkte im Konzentrationsbereich von 0,08 bis 41,6 ng/L ausgewertet (instrumentelle Konzentrationsniveaus für jeden EA). Die Leistung der Methode ist in Tabelle 2 dargestellt.

Zunächst wurden die Kalibrierungskurven für jede Verbindung in der quantitativen Software erstellt und der lineare Bereich anhand der Peakfläche in Abhängigkeit von der Analytkonzentration bewertet. Es ist wichtig, eine gute lineare Anpassung (R2 > 0,99) zu erreichen und gleichzeitig eine relative Standardabweichung von weniger als 20 % in Bezug auf die Genauigkeit für jedes Konzentrationsniveau zu gewährleisten. Dazu kann die Gewichtung der Kurve auf "1/x" umgeschaltet werden. Eine gute Linearität wurde für alle Analyten im linearen Bereich von 2,6-41,3 ng/ml (1,95-31,2 g/kg in Proben) beobachtet; Bei einigen Analyten war der lineare Bereich mit einer unteren Grenze bei 0,65 ng/mL sogar noch breiter, während ein Signal-Rausch-Verhältnis von über 10 beibehalten wurde. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für die (a) Standard- und (b) matrixangepasste Kalibrierkurve für Econ.

Der Vergleich zwischen den Steigungen von Standard- und matrixangepassten Kalibrierkurven gibt Aufschluss darüber, wie sich die potentiellen Ko-Elutanten aus der Matrix auf die Analyse auswirken können. Diese Störung wird als Signalunterdrückungs-/Verstärkungseffekt (SSE) bezeichnet und kann durch Vergleichen der Steigungen beider Kalibrierkurven und Anwendung der folgenden Gleichung beurteilt werden:

figure-results-1

Wie in Tabelle 2 gezeigt, lag der SSE zwischen -23 und 18 %, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein der Matrix fast keinen Einfluss auf die Ionisation der Analyten hat; Daher kann ihre Quantifizierung anhand der Standardkalibrierkurve erfolgen.

Da der Einfluss der Matrix bekannt ist, besteht der nächste Schritt in der Quantifizierung der dotierten Proben auf den drei zuvor genannten Konzentrationsniveaus unter Verwendung der Kalibrierungskurven, um zu bewerten, wie viel des anfänglichen EA nach dem Extraktionsprozess wiedergewonnen wird. Aufgrund des gezeigten niedrigen SSE wurden die in Lösungsmittel erstellten Kalibrierkurven in der quantitativen Software verwendet, um die Konzentration der dotierten Proben automatisch zu bestimmen. Zur Berechnung der Wiederfindung wurde dann die gemessene Konzentration mit der theoretischen Konzentration nach dieser Gleichung verglichen:

figure-results-2

Alle Analyten zeigten Wiederfindungswerte im Bereich von 72-117% für alle Konzentrationsniveaus. Dies bedeutet, dass die Methode Messungen der Konzentration in den dotierten Proben lieferte, die nahe genug an den theoretischen Werten lagen, und somit eine korrekte Richtigkeit zeigte. Nichtsdestotrotz zeigte die Methode eine begrenzte Genauigkeit für Etn, dessen Konzentrationswerte zwischen 43 % und 45 % lagen, bezogen auf die theoretischen Anreicherungswerte. Die Genauigkeit der Messungen wurde durch Berechnung der relativen Standardabweichung (RSD) der Wiederfindungsraten für jeden Anreicherungsgrad überprüft, der innerhalb desselben Tages (RSDr, n = 3) und während der gesamten Studie (RSDWR, n = 9) erzielt wurde. Es wurde eine akzeptable Genauigkeit beobachtet, wenn man bedenkt, dass alle Werte unter 20 % schwankten.

Um die Sensitivität der vorgeschlagenen Methode zu bewerten, wurden schließlich LOQs auf der Grundlage der matrixangepassten Kalibrierungskurve geschätzt. In diesem Protokoll wurden diese Werte als die niedrigste Konzentration innerhalb des linearen Bereichs der Kurve bestimmt, die eine Abweichung von unter 20 % vom theoretischen Wert und ein Signal-Rausch-Verhältnis von über 10 aufwies. Wie in Tabelle 2 gezeigt, lagen die LOQs zwischen 0,65 und 2,60 ng/ml (0,49 bis 1,95 μg/kg in Proben).

figure-results-3
Abbildung 1: Schematischer Arbeitsablauf für die Erstellung von Zwischen- und Arbeitsstandardlösungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 2: Arbeitsliste für die LC-IMS-MS-Analyse in der Validierungsstudie von gepoolten Getreideproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 3: Überlappende extrahierte Ionenchromatogramme der analysierten EAs. Abkürzungen: EAs = Mutterkornalkaloide; Öko = Ergocornin; Econ = Ergocorninin; Ecr = Ergokristin; Ecrn = Ergokristinin; Ekr = Ergokryptin; Ekrn = Ergokryptinin; Emn = Ergometrinin; Es = Ergosine; Esn = Erosiinin; Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 4: Extrahiertes Ionenchromatogramm (oben) und Ionenmobilitätsspektren (unten) von Et und Etn. Abkürzungen: Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 5: Kalibrierkurven von Econ. (A) Reines Lösungsmittel und (B) matrixangepasst. Abkürzung: Econ = Ergocorninin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

AnalytenRt (min)CCS (Å2)[M+H]+ (m/z)
Öko6.95231.67562.3029
Econ8.21229.96562.3029
Ecr8.61237.74610.3029
Ercn9.85235.56610.3029
Ekr8.15233.61576.3185
Ekrn9.38229.93576.3185
Em3.57179.35326.1668
Emn4.48179.01326.1668
Es6.41229.29548.2872
Esn6.54226.65548.2872
Et6.85230.33582.2716
Etn6.98228.3582.2716

Tabelle 1: Charakterisierte LC-IMS-MS-Parameter zur eindeutigen Identifizierung von Mutterkornalkaloiden unter Anwendung des in diesem Protokoll beschriebenen Verfahrens. Abkürzungen: Rt = Retentionszeit; CCS = Kollisionsquerschnitt; LC-IMS-MS = Flüssigkeitschromatographie-Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie.

Rückgewinnung (%)Genauigkeit (%) [RSDr, (RSDWR)]
AnalytenLinearität (R2)SSE (%)0,5 MLML1,5 ML0,5 MLML1,5 MLLOQ in der Probe (μg/kg)
Öko0.9937-231141111006 (15)4 (19)13 (17)0.49
Econ0.9915-121051171246 (10)7 (18)8 (14)0.49
Ecr0.9965187910711013 (19)13 (18)6 (18)0.49
Ercn0.9906-209911010410 (15)11 (10)12 (10)0.49
Ekr0.992-10106101936 (9)7 (7)10 (9)0.49
Ekrn0.9925-16971181145 (11)7 (4)9 (9)0.98
Em0.9947-97279747 (8)6 (5)9 (9)0.98
Emn0.9909-328387846 (5)11 (10)7 (9)1.95
Es0.9953-16891121115 (7)8 (5)15 (8)0.98
Esn0.9971-138690813 (6)14 (12)10 (10)0.49
Et0.9953-1679888112 (15)19 (18)11 (20)0.98
Etn0.9997-14543449 (12)5 (13)12 (17)0.98

Tabelle 2: Methodenleistung von EAs in Bezug auf Linearität, Matrixeffekt, Wiederfindung, Präzision und Quantifizierungsgrenzen. Abkürzungen: Eco = Ergocornine; Econ = Ergocorninin; Ecr = Ergokristin; Ecrn = Ergokristinin; Ergokryptin = Ekr; Ergokryptinin = Ekrn; Emn = Ergometrinin; Es = Ergosine; Esn = Erosiinin; Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin; LOQ = Bestimmungsgrenze; ML = Maximaler Pegel; RSDr = relative Standardabweichung der Wiederholbarkeit; RSDWR = innerhalb der relativen Standardabweichung des Labors; SEE = Unterdrückungs-/Verstärkungseffekt.

Diskussion

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls basiert auf der Optimierung des Extraktionsverfahrens, die zuvor von Carbonell-Rozas et al.17 durchgeführt wurde, die die Verwendung eines Extraktionslösungsmittels implementierten, das wirksam genug ist, um EAs aus komplexen Lebensmittelmatrizes wie Gerste und Weizen zu extrahieren, und einer Reinigung, die relativ niedrige SSE-Werte lieferte. Die Wahl des Extraktionslösungsmittels stellt einen kritischen Schritt dar, wenn man die chemischen Eigenschaften der Analyten und die Labilität der EAs gegenüber Zersetzung und Epimerisierung, aber gleichzeitig die Zusammensetzung der zu analysierenden Matrix berücksichtigt. In diesem Fall bieten EAs (und Mykotoxine im Allgemeinen) sehr gute Wirkungsgrade, wenn Acetonitril (ein nicht-protisches Lösungsmittel, das die Epimerisierung verhindern könnte) das gewählte Lösungsmittelist 21,22,23,24. Darüber hinaus erhöht die Zugabe von Ammoniumcarbonat bei EAs die Extraktionseffizienz, indem ein basischer pH-Wertvon 25 bereitgestellt wird. Darüber hinaus ist das Lösungsmittel-Proben-Verhältnis zu berücksichtigen, da die Verwendung geringer Lösungsmittelmengen zu einer Sättigung26 führen kann, was sich in schlechten Wiederfindungswerten widerspiegelt. Darüber hinaus implizieren hohe Lösungsmittelvolumina eine stärkere Verdünnung der Analytlösungen, was ihren Nachweis erschwert und/oder die Extraktion von Matrixverbindungen begünstigt, die ihre Bestimmung beeinträchtigen können. Der nächste Schritt in dieser Extraktionsmethodik - der Clean-up-Schritt - muss unter Berücksichtigung der Zusammensetzung der Matrix aus einer zweckmäßigen Perspektive entworfen werden. Davon hängt letztlich ab, wie sauber die Extrakte sind und wie stark die Matrix die analytische Bestimmung beeinflusst. In diesem Protokoll wurde ein C18:Z-Sep+-Gemisch (1:1, w/w) erfolgreich als dispersives Festphasensorbens verwendet, was sich in der relativ niedrigen SSE widerspiegelt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass EAs gut mit Acetonitril extrahiert sind, können auch andere schwache oder unpolare Co-Elutanten in dem Extrakt erwartet werden. In diesem Zusammenhang ist C18 ein reinigendes Sorptionsmittel, das traditionell für allgemeine Zwecke verwendet wird und unpolare Verbindungen aus der Matrix zurückhält, während Z-Sep+ normalerweise für Matrices mit einem hohen Anteil an Fett oder Pigmenten empfohlenwird 27. Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Sorptionsmittel, auch das weit verbreitete primär-sekundäre Amin (PSA) oder der graphitisierte Ruß (GCB), mit den Analyten interagieren können, was zu ihrem Verbleib in der festen Phase und ihrem Verlust für eine spätere analytische Bestimmung führt28. Mögliche Wechselwirkungen zwischen Analyten und Sorptionsmitteln können bei der Optimierung des Reinigungsschritts ebenfalls eine Frage der Untersuchung sein, so dass eine Änderung der Typologie oder, was noch wichtiger ist, der Menge des Sorptionsmittels ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung sein kann. In diesem Protokoll wurde eine zuvor entwickelte Extraktionsmethode angewendet, obwohl sich die hier beobachtete Richtigkeit für Etn stark von den in der vorherigen Studie erhaltenen Werten unterschied. Obwohl das Paar Et/Etn als chemisch stabil berichtet wurde29, wurden zuvor Inkonsistenzen nach Langzeitlagerung beobachtet30. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Integrität der Analysestandards zu wahren, indem es am selben Tag der Analyse getrocknet, gelagert und dann wieder suspendiert wurde. Dennoch sollte die Integrität der analytischen Standards von EAs überprüft werden, bevor mit dem Versuchsteil begonnen wird.

Dieses Protokoll wählt LC-IMS-MS als analytische Plattform, um seine Anwendbarkeit und verbesserte Leistung im Vergleich zu herkömmlichen LC-MS-Ansätzen, bei denen dieselben EAs bestimmt werden, zu demonstrieren. Wie in Abbildung 3 gezeigt, ist die chromatographische Trennung der untersuchten EAs für fünf der sechs Haupt-EA-Epimer-Paare optimal, was bedeutet, dass eine noch optimierte chromatographische Methode zu einer vollständigen Trennung der Peaks führen kann. Nichtsdestotrotz war kein zusätzlicher Aufwand erforderlich, um die chromatographische Trennung zu verbessern, da die IMS-Dimension in der Lage war, die in LC gezeigte schlechte Auflösung zu beheben. Der Nachteil der reduzierten Optimierung bei der chromatographischen Trennung ist die erhöhte Komplexität der Datenverarbeitung, die durch die Einführung einer zusätzlichen Trennstufe verursacht wird, die eine weitere Dimension hinzufügt. Obwohl dieses Protokoll theoretisch als zielgerichtete Methode zur spezifischen Bestimmung von EAs konzipiert ist, wurde die Datenerfassung in der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) als nicht-zielgerichtetes Screening durchgeführt. Das bedeutet, dass das Instrument ständig jedes Merkmal aus der Probe scannte und retrospektiv EAs identifiziert und quantifiziert wurden. Es ist bekannt, dass dieser Ansatz die Sensitivität der Methode verringert, aber im Gegenteil die Identifizierung unbekannter Verbindungen ermöglicht. Nichtsdestotrotz sind die in Tabelle 2 angegebenen LOQs [0,65 - 2,6 ng/ml (0,49 - 1,95 μg/kg in Proben)] vergleichbar mit denen, die mit herkömmlichen LC-MS-Methoden zur Bestimmung von EAs berichtet werden, die durch gezielte Akquisitionen erfolgen31. Dies kann bedeuten, dass die Implementierung von IMS ein verbessertes analytisches Signal liefert, das eine bessere Unterscheidung vom Hintergrundrauschen ermöglicht, was sich direkt auf die Empfindlichkeit des Verfahrens auswirkt. Ein entscheidender Faktor, der sich auch auf die Intensität des analytischen Signals auswirkt, hängt von der Effizienz der Ionisation in der Quelle ab. Wenn die Quelle keine optimalen Bedingungen bietet, hauptsächlich in Bezug auf Spannung, Gasbedingungen und Temperatur, werden nicht alle Analytmoleküle ionisiert und detektiert. Dies führt zu einem Verlust der absoluten Intensität. Daher wird empfohlen, die Parameter der Ionenquelle zu untersuchen, um ein verbessertes analytisches Signal zu erhalten.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorteile des Einsatzes von LC-IMS-MS in der Lebensmittelsicherheitsanalyse aufzuzeigen, wobei die EA-Bestimmung als Fallstudie verwendet wird. Die Integration der Ionenmobilitätsspektrometrie in die Arbeitsabläufe der Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie bietet eine erhöhte Sensitivität und eine bessere Auflösung bei der Trennung dieser Verbindungen, was angesichts der Isomerie regulierter Mutterkornalkaloide besonders komplex werden kann. Wie gezeigt, überwand diese analytische Plattform erfolgreich chromatographische Herausforderungen, die durch die teilweise Trennung der chromatographischen Peaks von den Epimeren verursacht wurden, während gleichzeitig die nicht-zielgerichtete Erfassung LOQs lieferte, die mit denen vergleichbar waren, die mit gezielten Methoden berichtet wurden. Aufgrund seiner nachgewiesenen Leistungsfähigkeit erweist sich LC-IMS-MS als leistungsstarke analytische Plattform für die Entwicklung von Multi-Rückstandsmethoden für Lebensmittelkontaminanten unter Verwendung nicht-zielgerichteter Ansätze.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía (PROYEXCEL_00195) und dem Postdoktorandenstipendium der Generalitat Valenciana und des Europäischen Sozialfonds+ (CIAPOS/2022/049) finanziert. Die Autoren danken dem "Centro de Instrumentación Científica (CIC)" an der Universität Granada für den Zugang zu den in diesem Protokoll verwendeten analytischen Instrumenten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonitrilVWR83640.32
Braunglasröhrchen 4 mLVWR548-0052
Braunglasröhrchen 12 mLVWR548-0903
Braune Fläschchen 1,5 mLAgilent5190-9063
AmmoniumcarbonatFluka9716
Analysenwaage BAS 31 Boeco4400519
Waage CP 323 S Sartorius23-84182
C18Supelco52604-U
Zentrifugenröhrchen, 15 mLVWR525-1082
Zentrifugenröhrchen, 50 mLVWR525-0155
Zentrifuge Universal 320 RHettich1406
Kompass HyStar BrukerErfassungssoftware
DatenanalyseBrukerQualitative Software
Elue PLUS  UHPLCBruker
EVA EC-S VerdampferVLMV830.012.12
Ameisensäure GR für die Analyse ACS, Reag. Ph EurMerck100264
Grinder TitanMill300Cecotec1559
MethanolVWR83638.32
Milli-Q Wasseraufbereitungssystem (18,2 MΩ cm)MilliporeZD5211584
Pipettenspitzen 1- 5 mLLabortecnic162005
Pipettenspitzen 100 - 1000 & Mikro; LLabortecnic1622222
Pipettenspitzen 5 - 200 µ LLabortecnic162001
Pippette Transferpette S variabel, DE-M 10 - 100 & micro; LMARKE704774
Pippette Transferpette S variabel, DE-M 100 - 1000 & micro; L MARKE704780
Pippette Transferpette S variabel, DE-M 500 - 5000 & micro; LMARKE704782
Spritze 2 mLVWR613-2003
Spritzenfilter 13 mm, 0,22 Mikro; mPhenomenexAF-8-7707-12
TASQBrukerQuantitative Software
timsTOFPro2 IM-HRMSBruker
Vortex Genie 2Scientific Industries15547335
Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 Säule (50  x  2,1 mm, 1,8 & Mikro; m Partikelgröße)Agilent 959757-902
Z-Sep+Supelco55299-USorptionsmittel auf Zirkonoxidbasis
Mutterkornalkaloide<strong>CAS Register Sorptionsmittel
Ergocornine (Eco)Techno SpecE178564-36-3
Ergocorninin (Econ)Techno SpecE130564-37-4
Ergocristin (Ecr)Techno SpecE180511-08-0
Ergocristinin (Ecrn)Techno SpecE188511-07-9
Ergokryptin (Ekr)Techno SpecE198511-09-1
Ergopkryptinin (Ekrn)Techno SpecE190511-10-4
Ergometrin (Em)Romer Labs"002067"60-79-7
Ergometrinine (Emn)Romer LabsLMY-090-5ML479-00-5
Ergosin (Es)Techno SpecE184561-94-4
Ergosinin (Esn)Techno SpecE194596-88-3
Ergotamin (Et)Romer Labs"002069"113-15-5
Ergotaminin (Etn)Romer Labs"002075"639-81-6

Referenzen

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