Modellierung des Alkoholkonsums bei Nagetieren unter Verwendung von Zwei-Flaschen-Choice-Käfigtrinken zu Hause und Mikrostrukturanalyse

Shikun Hou; Nathaly M. Arce Soto; Elizabeth J. Glover

doi:10.3791/67486

Methodenartikel

Modellierung des Alkoholkonsums bei Nagetieren unter Verwendung von Zwei-Flaschen-Choice-Käfigtrinken zu Hause und Mikrostrukturanalyse

DOI:

10.3791/67486

⸱

8. November 2024

Shikun Hou¹ , Nathaly M. Arce Soto¹ , Elizabeth J. Glover¹

¹Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein standardmäßiges Paradigma für das Trinken von Käfigen mit intermittierendem Zugang zu zwei Flaschen, um den Alkoholkonsum bei Ratten zu modellieren. Darüber hinaus bietet es eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um das Standardprotokoll um ein DIY-Leckerkennungssystem zu erweitern, das eine mikrostrukturelle Analyse des Trinkverhaltens ermöglicht.

Zusammenfassung

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Das Trinken von Käfigen mit zwei Flaschen zu Hause ist eines der am weitesten verbreiteten Paradigmen, um den Ethanolverbrauch bei Nagetieren zu untersuchen. In der einfachsten Form erhalten die Tiere Zugang zu zwei Trinkflaschen, von denen eine normales Leitungswasser und die andere Ethanol enthält, wobei die tägliche Aufnahme anhand der Veränderung des Flaschengewichts über einen Zeitraum von 24 Stunden gemessen wird. Folglich ist für diesen Ansatz keine spezielle Laborausrüstung erforderlich. Während eine solche einfache Implementierung wahrscheinlich den größten Beitrag zu seiner weit verbreiteten Akzeptanz durch präklinische Alkoholforscher leistet, ist die Auflösung der mit diesem Ansatz gewonnenen Trinkdaten durch die Anzahl der Messungen des Flaschengewichts durch den Forscher (z. B. einmal täglich) begrenzt. Der Wunsch, das Trinkverhalten im Kontext der Gesamtaufnahme, pharmakologischer Interventionen und neuronaler Manipulationen zu untersuchen, hat jedoch zur Entwicklung von Systemen zur Erkennung von Käfiglecken zu Hause geführt, die Daten auf der Ebene einzelner Lecks erfassen können. Obwohl eine Reihe dieser Systeme erst kürzlich entwickelt wurden, hat das Open-Source-System LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Benutzerfreundlichkeit in der Praxis große Aufmerksamkeit erregt. Obwohl dieses System spannend ist, wurde es für den Einsatz bei Mäusen entwickelt. Hier überprüfen wir geeignete Verfahren für das Trinken von Standard- und mit Leckometern ausgestatteten Zwei-Flaschen-Auswahlkäfigen für zu Hause. Wir stellen auch Methoden zur Anpassung des LIQ HD-Systems an Ratten vor, einschließlich Hardware-Modifikationen für größere Käfiggrößen und einen neu gestalteten 3D-gedruckten Flaschenhalter, der mit handelsüblichen Trinkflaschen kompatibel ist. Mit diesem Ansatz können die Forscher das tägliche Trinkverhalten zusätzlich zu den Aufnahmemengen bei vielen Ratten parallel untersuchen und so die Auflösung der gewonnenen Daten mit minimalem Aufwand an zusätzlichen Ressourcen erhöhen. Diese Methoden geben den Forschern die Flexibilität, entweder Standardflaschen oder ein mit einem Lickometer ausgestattetes Gerät zu verwenden, um die neurobiologischen Mechanismen zu untersuchen, die dem Alkoholkonsum zugrunde liegen, je nach ihren genauen experimentellen Bedürfnissen.

Einleitung

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Obwohl mäßiger Alkoholkonsum in der Vergangenheit mit mäßigen gesundheitlichen Vorteilen in Verbindung gebracht wurde, haben neuere groß angelegte umfassende Studien gezeigt, dass keine Menge Alkoholkonsum sicher ist¹^,². Tatsächlich ist Alkoholkonsum weltweit der siebthäufigste Risikofaktor für Tod und Behinderung¹, wobei Personen, die auch nur kleine Mengen Alkohol trinken, ein erhöhtes Risiko für Krebs, Infektionskrankheiten und Verletzungen haben¹^,³. In den Vereinigten Staaten sind die Todesfälle durch Alkoholkonsum zwischen 2016 und 2021 um fast 30 % gestiegen⁴. Wichtig ist, dass das Risiko von Tod und Invalidität mit zunehmendem Verbrauch monoton zunimmt¹.

Obwohl Studien am Menschen wertvolle Einblicke in die Neurobiologie von Alkoholkonsum und -missbrauch geliefert haben, ist die experimentelle Kontrolle durch Tiermodelle entscheidend für ein tiefgreifendes Verständnis der Mechanismen, die dem Trinkverhalten und dem Risiko für starken Alkoholkonsum zugrunde liegen. Diese Modelle sind auch wertvolle Instrumente für die Entwicklung von Behandlungen, die darauf abzielen, den unkontrollierten Konsum zu reduzieren. Das Trinken von Zwei-Flaschen-Käfigen zu Hause ist eines der am weitesten verbreiteten präklinischen Paradigmen zur Untersuchung des Alkoholkonsums bei Nagetieren. Dies ist zum großen Teil auf die einfache Implementierung zurückzuführen, da es die Messung des gesamten freiwilligen Alkoholkonsums und der Präferenz ermöglicht, ohne dass spezielle Forschungsgeräte oder komplexe Analysen erforderlich sind. Mit diesem Ansatz können Forscher Messungen in den gewünschten Intervallen (z. B. Stunden, Tage, Wochen) durchführen, indem sie die Veränderung des Flaschengewichts vom Anfang bis zum Ende einer Trinksitzung berechnen. Variationen dieser grundlegenden Methode wurden von vielen in der Branche verwendet, um einen niedrigen bis mäßigen bis übermäßigen Alkoholkonsum sowohl über kurze als auch über lange Zeiträume zu erleichtern. Zum Beispiel wurden kontinuierliche und intermittierende Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren verwendet, um sowohl bei mäusen^{5 als auch bei rats<}sup class="xref">6^,⁷^,^{8 einen niedrigen bzw. moderaten Alkoholkonsum zu ermöglichen}. Die gleichen Paradigmen können einen hohen Konsum bei alkoholbevorzugten Stämmen fördern⁷^,⁹. Alternativ hat sich gezeigt, dass eine Anpassung dieser Methode, die den Zugang zu Alkohol auf 2-4 Stunden täglich begrenzt, beginnend etwa 3 Stunden nach Beginn des Dunkelzyklus, bei Mäusen zu Rauschtrinken führt (d. h. Trinken im Dunkeln)¹⁰^,¹¹. Zusätzliche Variationen dieser Methoden wurden in Verbindung mit Methoden verwendet, die die Alkoholabhängigkeit erleichtern (d. h. chronische intermittierende Exposition gegenüber Ethanoldampf), um die Eskalation des freiwilligen Alkoholkonsums während des Entzugs zu untersuchen¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹.

Obwohl in der Praxis weit verbreitet, ist der Standardansatz zur Messung des Alkoholkonsums durch Änderung des Flaschengewichts in seiner Auflösung auf den Gesamtverbrauch pro Trinksitzung beschränkt. Folglich ist dieser Ansatz nicht in der Lage, Trinkmuster zu erfassen, von denen bekannt ist, dass sie sich sowohl auf das Risiko als auch auf den Schweregrad der Alkoholkonsumstörung (AUD) auswirken²⁰^,²¹^,²². In der Tat kann der durchschnittliche Konsum einer Person im Laufe der Zeit eine Folge mehrerer starker Trinkepisoden oder vieler Trinkepisoden sein, die jeweils mit einem relativ geringen Konsum verbunden sind, und diese Nuancen bleiben unentdeckt, wenn der Konsum als Gesamtaufnahme pro Trinksitzung gemessen wird. Wichtig ist, dass signifikant mehr Trinkepisoden im Zusammenhang mit großen Trinkattacken (d.h. Schlucken) bei Individuen mit AUD im Vergleich zu gesunden Kontrollen beobachtet werden²³ und Daten an nichtmenschlichen Primaten deuten darauf hin, dass Individuen, die früh in ihrer Trinkgeschichte ein Alkoholkonsummuster etablieren, das große Trinkanfälle beinhaltet, ein signifikantes Risiko für AUD²² haben. Darüber hinaus erhöhen Trinkepisoden, die große Konsumeinheiten beinhalten, das Risiko für Morbidität und Mortalität unabhängig von der AUD-Diagnose²¹. Insgesamt haben diese Daten zu einem erhöhten Interesse an der Untersuchung von Trinkmustern zusätzlich zu den Werten der Gesamtaufnahme in präklinischen Modellen geführt und die Entwicklung einer Reihe von Systemen unterschiedlicher Komplexität veranlasst, die in der Lage sind, Trinkdaten auf der Ebene einzelner Lecks zu erfassen.

Zu den ersten gehörte die Entwicklung eines Zwei-Flaschen-Systems mit Fotostrahl-Leckerkennung, das für den Einsatz bei Mäusen entwickelt wurde²⁴. Dieses System wurde anschließend von einer separaten Gruppe für die Verwendung in rats^{25 angepasst}. In den folgenden Jahren wurden Variationen dieses Themas verwendet, um ähnliche Systeme zu entwickeln, die in benutzerdefinierten Nagetierhaltungssystemen enthalten sind²⁶, die die Leckerkennung einzelner sozial untergebrachter Tiere ermöglichen²⁷^,²⁸, und die sowohl das Fress- als auch das Trinkverhalten erfassen²⁹. Unter diesen hat LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ große Aufmerksamkeit erregt, weil es ein System für den Einsatz in Mäusen anbietet, das der einfachen Implementierung und Erschwinglichkeit des von Godnyuck et al. entwickelten Systems entspricht²⁴. Dieses System verwendet kapazitive Sensorik, um den Kontakt zwischen der Zunge und der leitfähigen Metall-Sipper-Röhre direkt zu erkennen, im Gegensatz zu indirekten Messungen wie Sipper-Annäherung oder Interaktion, die mit dem Photobeam-Detection-System ermöglicht werden. Die Autoren liefern Daten, die zeigen, dass ihr kapazitives Sensorsystem eine deutlich höhere Präzision und Empfindlichkeit bei der Lecksteindetektion bietet und stärkere Korrelationen zwischen der Leckenzahl und der Änderung des Flaschengewichts als die Photostrahldetektion erzeugt. Die Autoren demonstrieren ferner die Fähigkeit, dieses System in Verbindung mit einem Paradigma für das Trinken von Heimkäfigen mit kontinuierlichem Zugang zu verwenden, um zusätzlich zu den Messungen der täglichen Gesamtaufnahme Messungen der Mikrostruktur des Alkoholkonsums zu erfassen³⁰.

Hier beschreiben wir Verfahren für den Alkoholkonsum in Zwei-Flaschen-Käfigen mit einem Standardansatz sowie Methoden, die eine Leckenerkennung ermöglichen (Abbildung 1). Wir stellen auch Methoden zum Erstellen und Implementieren von LIQ HDR vor - eine Anpassung von LIQ HD³⁰ für den Einsatz bei Ratten, die Hardware-Modifikationen für größere Käfiggrößen und einen neu gestalteten 3D-gedruckten Flaschenhalter umfasst, der mit Standardflaschen von der Stange kompatibel ist. Diese Methoden bieten den Forschern die Flexibilität, je nach ihren experimentellen Ressourcen und Datenerhebungsanforderungen entweder einen Standard- oder einen mit einem Lickometer ausgestatteten Ansatz zu verwenden.

Nachfolgend finden Sie eine Beschreibung der benötigten Materialien und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Erfassen des Käfigtrinkens zu Hause mit dem intermittierenden Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren, angepasst von Simms et al.⁷. Bei diesem Verfahren erhalten Ratten 24 h Zugang zu zwei Trinkflaschen an 7 Tagen in der Woche. Montags, mittwochs und freitags (MWF) erhalten Ratten eine Flasche mit Wasser (H₂O) und eine weitere Flasche mit Ethanol (EtOH). Diese Flaschen werden dienstags, donnerstags und samstags (TRS) entfernt und durch zwei Flaschen Wasser ersetzt. Ratten trinken samstags und sonntags aus den gleichen zwei Flaschen Wasser. Beachten Sie, dass diese Methoden bei Bedarf leicht für alternative Zeitpläne des Ethanolzugriffs (z. B. kontinuierlich, Binge, etc.) angepasst werden können. Für Standard- und mit Lickometern ausgestattete Ansätze werden separate Anweisungen bereitgestellt.

Protokoll

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Alle repräsentativen Daten wurden mit alleingehaltenen erwachsenen Long-Evans-Ratten mit Genehmigung des University of Illinois Chicago Institutional Animal Care and Use Committee und in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren gesammelt. Ein einzelnes Gehäuse ist erforderlich, um den Flüssigkeitsverbrauch jedes Probanden genau zu überwachen. Erwachsene männliche (n = 38) und weibliche (n = 22) Long-Evans-Ratten waren bei ihrer Ankunft P50-80 und durften sich vor Beginn des Experiments eine Woche lang an das Vivarium akklimatisieren. Ratten hatten ad libitum Zugang zu Standardfutter (Teklad 7912, Envigo) und Wasser, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung vor dem Experiment

Trinkflaschen als H₂O oder EtOH kennzeichnen. Etikettieren Sie dann mit einem eindeutigen Identifikator für jede Ratte, eine H₂O- und eine EtOH-Flasche für MWF und zwei H₂O-Flaschen für TRS.
HINWEIS: Verwenden Sie optional ein andersfarbiges Klebeband, um H₂O- und EtOH-Flaschen zu identifizieren, um mögliche Fehler beim Flaschenwechsel zu vermeiden.
Füllen Sie H₂O Flaschen 1 Tag vor Beginn des Versuchs mit Trinkwasser. Bereiten Sie die EtOH-Lösung vor, indem Sie 190 proof EtOH 1 Tag vor dem Startdatum des Experiments mit Trinkwasser (20 % v/v) kombinieren.
ACHTUNG: Es ist wichtig, dass das verwendete EtOH nicht denaturiert ist, da denaturiertes EtOH giftig ist.
Bereiten Sie einen leeren Käfig auf demselben Regal vor wie die Ratten, die am Experiment teilnehmen. Dieser Käfig wird zur Berechnung des Verschüttens verwendet.
Rüsten Sie Käfige mit dem LIQ HDR-System aus, wenn Sie verwenden (siehe Schritt 3, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6 und ergänzende Abbildung 1).
Bestimmen Sie die genaue Tageszeit für den Flaschenwechsel vor Beginn der Studie. Die Flaschen sollten jeden Tag zur gleichen Zeit ausgetauscht werden, um eine genaue Messung der 24-Stunden-Aufnahme zu erhalten.
HINWEIS: Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Nagetiere früh nach Beginn des Dunkelzyklus den größten Konsum aufweisen¹⁰^,³¹. Um die Aufnahme während dieser hochaktiven Zeit zu erfassen (siehe Schritt 2.3.1 zur Erfassung von Rauschtrinken), wird daher empfohlen, den Flaschenwechsel 30-60 Minuten nach dem Ausschalten des Lichts durchzuführen. Verwenden Sie während des Flaschenwechsels rote Lampen, um eine Visualisierung ohne Unterbrechung des Hell-Dunkel-Zyklus zu ermöglichen.

2. Tägliche Abläufe und Wartung

Führen Sie am ersten Tag des Experiments die folgenden Schritte aus.
1. Entfernen Sie Standard-Wasserflaschen aus den Käfigen.
2. Optional: Ratten stoßen bei der Nahrungssuche oft gegen den Käfigdeckel, was zu Verschüttungen führen kann, die durch den leeren Verschüttungskäfig nicht korrigiert werden können. Die Verwendung von Futterbechern im Käfig kann dieses Problem lindern. Wenn Sie verwenden, entfernen Sie jetzt das Futter von der Käfigoberseite, fügen Sie einen Futterbecher in den Käfig hinzu und füllen Sie ihn mit Futter. Stellen Sie sicher, dass die der Ratte zugewiesene Stellfläche weiterhin den institutionellen Richtlinien entspricht, die auf der Größe des Rattenkäfigs und der Größe des Futterbechers basieren.
3. Gegebenenfalls dem Pflege- und Haltungspersonal ist mitzuteilen, dass das Forschungspersonal für die Dauer des Versuchs Futter und Wasser zur Verfügung stellen wird.
4. Käfigänderungen können die Datenerfassung stören. Führen Sie Käfigwechsel zusammen mit der Messung des Körpergewichts durch. Forschende, die sich dafür entscheiden, sollten ihr Pflege- und Haltungspersonal entsprechend informieren.
Befolgen Sie an den folgenden Tagen die unten beschriebenen Verfahren.
HINWEIS: Denken Sie daran, dass jede Bewegung von Käfigen und Flaschen zu Verschüttungen führen kann. Daher ist es wichtig, sanft mit Bewegungen umzugehen und die gleichen Methoden zum Anbringen und Entfernen von Flaschen auf den Verschüttungskäfig anzuwenden und zu verwenden, die für Rattenkäfige verwendet werden.
1. Betreten Sie den Raum vor dem Flaschenwechsel, stellen Sie sicher, dass genügend Zeit für die Durchführung der folgenden Schritte vorhanden ist, und legen Sie neue Flaschen zur entsprechenden Startzeit der Sitzung in die Käfige.
2. Entfernen Sie die Filterdeckel aus den Käfigen. Wenn MWF, fahren Sie mit Schritt 2.2.3 fort. Wenn TRS, fahren Sie mit Schritt 2.2.4 fort.
3. Entfernen Sie montags, mittwochs und freitags TRS-Flaschen von den Käfigdeckeln. Wiegen Sie MWF-Flaschen (eine EtOH und eine H₂O). Notiere das Startgewicht der Flasche für die heutige Trinksession. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Futter auf den Käfigdeckel oder die Futterbecher. Platzieren Sie die Flaschen zu Beginn der Sitzung mit Klebeband nach oben auf die Oberseite des Käfigs jeder Ratte, damit die Ratten das Flaschenetikett nicht zerkauen.
  HINWEIS: In der Regel wird der Wasserverbrauch für TRS nicht aufgezeichnet oder gemeldet, aber Forscher können diese Daten optional sammeln, indem sie auf und von der Flasche Gewicht erhalten, wie unten in Schritt 2.2.3 und Schritt 2.2.4 beschrieben, falls gewünscht. Die Seite für die EtOH-Flasche sollte nach jedem Trinken gewechselt werden, um die Entwicklung einer möglichen Seitenpräferenz zu vermeiden, die die Verbrauchsdaten versehentlich verzerren kann.
  1. Optional: Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass viele Ratten zu Beginn der Trinksitzung Rauschtrinken zeigen⁸^,³²^,³³. Die meisten Forscher, die während dieser Zeit Rauschtrinken erfassen, berichten von der Einnahme während der ersten 30-60 Minuten der Trinksitzung. Um Aufnahmedaten während dieser potenziellen Binge-Episode zu erhalten, befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
  2. Stellen Sie einen Timer ein, nachdem die Flaschen auf den letzten Käfig aufgesetzt wurden. Verlassen Sie den Raum während des angegebenen Zeitraums ungestört.
  3. Betreten Sie den Raum wieder, wenn der Timer abgelaufen ist. Entfernen Sie die EtOH- und H₂O-Flaschen und notieren Sie die Flaschengewichte. Bringen Sie EtOH- und H₂O-Flaschen in Käfige zurück.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, um Binge-Episoden zu erfassen, wenn ein System verwendet wird, das für die Leckenerkennung ausgestattet ist.
4. Entfernen Sie dienstags, donnerstags und samstags die MWF-Flaschen zur angegebenen Endzeit der Sitzung, die 24 Stunden nach der Startzeit entspricht, aus den Käfigen. Wiegen Sie jede Flasche und notieren Sie das Flaschenendgewicht für die MWF-Trinksitzung. Ermitteln und notieren Sie das Körpergewicht jeder Ratte. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Futter auf den Käfigdeckel oder die Futterbecher. Platzieren Sie die Flaschen TRS H₂O mit dem Klebeband nach oben auf den Käfigdeckel jeder Ratte, damit die Ratten das Flaschenetikett nicht zerkauen.
5. Setzen Sie die Filterdeckel wieder in die Käfige ein und verlassen Sie den Tierraum.
  HINWEIS: Decken Sie optional EtOH-Flaschensauger ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Wenn Käfigwechsel von Forschungspersonal durchgeführt werden, legen Sie während der TRS-Aufgaben 1 Tag pro Woche für diese Aufgabe fest. Setzen Sie jede Ratte in einen sauberen Käfig, nachdem sie das Körpergewicht erreicht hat.
Waschen Sie die Flaschen regelmäßig, wöchentlich oder zweiwöchentlich und erfrischen Sie die Flüssigkeiten gemäß den Tierpflege- und Haltungsverfahren der Einrichtung. Achten Sie darauf, diese Aufgaben so zu erfüllen, dass die Trinkgelage nicht unterbrochen wird. So können z.B. TS_{H 2}O Flaschen nach der Entnahme auf MWF gewaschen und wieder befüllt werden. Ebenso können MWF H₂O- und EtOH-Flaschen nach der Entnahme auf TRS gewaschen und wieder befüllt werden.

3. Leckerkennung bei Zwei-Flaschen-Auswahlexperimenten

HINWEIS: Forscher, die daran interessiert sind, hochauflösende Trinkdaten zu erfassen, können das obige Verfahren ändern, indem sie den Flaschen Funktionen zur Leckerkennung hinzufügen. LIQ HD³⁰ ist ein kostengünstiges Do-it-yourself-System (DIY), das diese Art der Datenerfassung bei Mäusen ermöglicht. Die im Folgenden beschriebenen Verfahren beschreiben die Modifikationen, die erforderlich sind, um LIQ HD für die Anwendung bei Ratten anzupassen (als LIQ HDR bezeichnet). In der Materialtabelle finden Sie eine Liste aller kommerziell verkauften und kundenspezifischen 3D-gedruckten Teile, die für den Bau eines Leckerkennungssystems erforderlich sind, das Daten zur Auswahl von zwei Flaschen für bis zu 18 Ratten erfassen kann. Die 3D-Druck-.stl-Dateien und Anweisungen finden Sie auf der Website des Autors (www.ejgloverlab.com/3dprints).

Einrichten von kapazitiven Sensoreinheiten
HINWEIS: Jedes LIQ HDR-System besteht aus drei kapazitiven Sensoreinheiten, die zusammen Leckdaten von 36 Flaschen parallel erfassen, was 18 Ratten mit einem Stall entspricht. Jede Sensoreinheit besteht aus einer differentiellenI 2C-Kommunikations-Breakout-Karte und einer kapazitiven Sensorplatine mit 12 Tasten, die über sechs Paare 2-poliger Kabel, die für jedes Lickometer farbcodiert sind, von sechs separaten Käfigen aus mit Lickometern verbunden werden können (Abbildung 2A).
1. Sammeln Sie die Materialien, die für den Bau aller drei kapazitiven Sensoreinheiten erforderlich sind, wie in Abbildung 2B gezeigt, zusammen mit den erforderlichen Lötwerkzeugen.
2. Um mit dem Bau von Sensoreinheit A zu beginnen, decken Sie eine 2-polige Buchse mit einem 7 Zoll langen, roten Schrumpfschlauch ab, stecken Sie die roten und schwarzen Drahtenden an die Pins #0 und #1 auf der Sensorplatine (Abbildung 2C-1) und löten Sie sie fest (Abbildung 2C-2). Stellen Sie sicher, dass sich das Kabel wie abgebildet an der Vorderseite der Sensorplatine befindet, um die Käfige in numerischer Reihenfolge von links nach rechts im Vivarium anzuordnen, ohne die Kabel zu überlappen und die Aufzeichnung möglicherweise zu stören (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6).
3. Decken Sie fünf weitere Kabel mit einem deutlich farbigen Schrumpfschlauch ab und löten Sie ihn wie gezeigt an Pin #2-11 (Abbildung 2C-3). Stelle sicher, dass alle roten Drähte an geradzahlige Pins gelötet sind, die mit allen Flaschen auf der linken Seite verbunden sind, und alle schwarzen Drähte an ungerade Pins gelötet sind, die mit allen Flaschen auf der rechten Seite verbunden sind.
4. Decken Sie die Lötstellen zum Schutz allseitig mit Heißkleber ab (Abbildung 2C-4). Beschriften Sie die Steckverbinder in numerischer Reihenfolge und geben Sie für jedes Lickometer eine eindeutige ID an (Abbildung 2C-4).
5. Um Sensoreinheit A zu montieren, verbinden Sie die Sensorplatine A mit einem 4-poligen 50-mm-Kabel mit einem Kommunikations-Breakout-EndPoint und verbinden Sie den EndPoint mit einem 4-poligen 100-mm-Kabel mit dem 3,3-V-Ausgang des 5-V-auf-3-V-Schalthebels (Abbildung 2D-1). Obwohl sowohl die Sensorplatine als auch die Kommunikations-Breakout-Platine über zwei identische 4-polige Anschlüsse verfügen, ist es dennoch wichtig, sicherzustellen, dass die Verkabelung genau wie gezeigt ist (Abbildung 2D-1 und Abbildung 2F), um die 3D-gedruckten Sensorgehäuse und den vorgeschlagenen Vivarium-Aufbau zu verwenden (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6). Unterbringen Sie die Sensoreinheit A im 3D-gedruckten Gehäuse (Abbildung 2D-2). Schließen Sie die Oberseite vorsichtig und achten Sie darauf, das Kabel des Pegelschalthebels nicht zu zerquetschen (Abbildung 2D-3).
6. Ändern Sie die I²C-Adressen der Sensorplatinen B und C, indem Sie wie angegeben einen Überbrückungsdraht vom ADDR-Pin an den 3Vo- oder SDA-Pin löten (Abbildung 2E).
7. Löten Sie sechs farbcodierte Buchsenkabel an die Sensorplatinen B und C in der gleichen Reihenfolge, die für Platine A verwendet wird. Beschriften Sie jeden Steckverbinder mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer. Verbinden Sie Platine B mit dem Kommunikations-Breakout MidPoint und C mit einem EndPoint mit 50 mm 4-poligen Kabeln (Abbildung 2F).
8. Unterbringen Sie die Sensoreinheiten B und C in ihren jeweiligen 3D-gedruckten Gehäusen. Verbinden Sie alle drei Sensoreinheiten mit Ethernet-Kabeln, um die Sensoreinrichtung abzuschließen (Abbildung 2G).
Einrichten der Mikrocontroller-Schnittstelle
HINWEIS: Die LIQ HDR-Mikrocontroller-Schnittstelle (Ergänzende Abbildung 1A) ist die gleiche wie für LIQ HD^{30 beschrieben}, mit sehr geringfügigen Änderungen. Die im Folgenden beschriebenen Verfahren geben einen allgemeinen Überblick über die Schritte, die zum Einrichten der Schnittstelle mit den in den Schritten 3.2.6 und 3.2.8 beschriebenen Änderungen erforderlich sind. Forscher werden auf das Originalprotokoll und das Video-Tutorial verwiesen, das auf der GitHub-Seite des Autors bereitgestellt wird, um detailliertere Schritt-für-Schritt-Anweisungen zu erhalten³⁰.
1. Sammeln Sie die Materialien und Lötwerkzeuge, die zum Erstellen der Mikrocontroller-Schnittstelle erforderlich sind (Ergänzende Abbildung 1B). Erstellen Sie auf der Rückseite des Berührungsschutzes (Ergänzende Abbildung 1C-1) einen Lötjumper über die hinteren Lite-Lötpads (Ergänzende Abbildung 1C-2).
2. Trennen Sie auf der Rückseite des Datenprotokollierungsschirms die Jumper-Pad-Leiterbahn des CS-Pins (Ergänzende Abbildung 1D-1). Löten Sie auf der Vorderseite des Datenloggers einen kurzen Überbrückungsdraht vom CS-Pin an Pin #7 (Ergänzende Abbildung 1D-2).
3. Um die Stapelköpfe für das Shield zu installieren, stapeln Sie sie zuerst auf der Rückseite des Touchscreen-Shields (Ergänzende Abbildung 1E-1). Stapeln Sie den Datenlogger auf den Touchscreen, verwenden Sie Klebeband zur Stabilisierung und löten Sie alle Stifte an den Datenlogger (Ergänzende Abbildung 1E-2). Entfernen Sie dann den Touchscreen.
4. Stapeln Sie den restlichen 2 x 3-Header auf den Mikrocontroller (Ergänzende Abbildung 1F-1) und stapeln Sie dann den Datenlogger auf den Mikrocontroller, bevor Sie die Header-Pins festlöten (Ergänzende Abbildung 1F-2).
5. Legen Sie die Knopfbatterie in den Datenlogger ein (Ergänzende Abbildung 1G-1). Stapeln Sie den Touchscreen auf den Datenlogger (Ergänzende Abbildung 1G-1). Setzen Sie die microSD-Karte zusammen mit dem Adapter in den Datenlogger ein (Ergänzende Abbildung 1G-2).
6. Um das zusätzliche Erdungskabel herzustellen, schneiden Sie einen Stecker von einem Überbrückungskabel ab und isolieren Sie das Ende auf ~1/4 Zoll ab (Ergänzende Abbildung 1H-1). Löten Sie einen Strang abisolierten Massivkerndrahtes an den Überbrückungsdraht und decken Sie die Lötstelle mit einem Schrumpfschlauch ab (Ergänzende Abbildung 1H-2).
7. Stecken Sie die 4-poligen Überbrückungskabel und das zusätzliche Erdungskabel in den Mikrocontroller (Schwarz - GND, Rot - 5V, Gelb - Pin #21, Blau - Pin #20, Ergänzende Abbildung 1I-1). Befestigen Sie die Anschlüsse mit Heißkleber (Ergänzende Abbildung 1I-2). Wickeln Sie die Überbrückungsdrähte optional mit einem Schrumpfschlauch ein (Ergänzende Abbildung 1I-2).
8. Beherbergen Sie die fertig montierte Mikrocontroller-Schnittstelle in einem 3D-gedruckten Gehäuse, wobei die 4-poligen Überbrückungskabel und das Erdungskabel durch die Öffnung an der Oberseite gefädelt werden (Ergänzende Abbildung 1J).
9. Befolgen Sie das Originalprotokoll für die Installation der Mikrocontroller-Schnittstellensoftware³⁰.
Erstellen von LIQ HDR lickometers
HINWEIS: Der benutzerdefinierte 3D-Druck, der die Flaschen hält, ist für die Verwendung mit einer Standard-Nagetier-Trinkflasche mit einem Sipper-Rohrdurchmesser von 8 mm konzipiert (siehe Materialtabelle, Abbildung 3A). Dieser Flaschenhalter kann mit geringfügigen oder keinen Modifikationen leicht für die Verwendung mit ähnlichen Flaschen und Sipper-Tuben angepasst werden.
1. Sammeln Sie die Materialien, 3D-Drucke und Lötwerkzeuge, die für den Bau eines Lickometers erforderlich sind, wie in Abbildung 3B gezeigt. Beachten Sie, dass jedes LIQ HDR-System maximal 18 Lickometer für 36 Flaschen aufnehmen kann.
2. Um das Steckerkabel zu verlängern, isolieren Sie beide Enden auf eine Länge von ~1/4 Zoll ab, ebenso wie die schwarzen und roten Verlängerungsdrähte (Abbildung 3C-1).
3. Löten Sie die Verlängerungsdrähte an das Anschlusskabel (Abbildung 3C-2) und decken Sie die Lötstellen mit einem Schrumpfschlauch ab (Abbildung 3C-3). Decken Sie das männliche Anschlusskabel mit einem Schrumpfschlauch ab, der farblich auf eine entsprechende Buchse an der Sensoreinheit abgestimmt ist (Abbildung 3C-4).
4. Um mit der Verkabelung der Sensorplatine konsistent zu sein (Abbildung 2), führen Sie das rote und das schwarze Kabel durch den linken bzw. rechten internen Kabeldurchgang des Flaschenhalters (Abbildung 3D-1).
5. Löten Sie jeden Draht bis zum äußersten Ende des 1 3/4 Zoll leitenden Kupferbandes (Abbildung 3D-2) und falten Sie die Kupferbänder in zwei Hälften (Abbildung 3D-3).
6. Lösen Sie das Kupferband und manövrieren Sie es vorsichtig mit einer Pinzette in die Sipper-Halterung (Abbildung 3E-1), bevor Sie es fest an den Innenwänden der Sipper-Halterung befestigen (Abbildung 3E-2). Stellen Sie sicher, dass die Lötseite des Kupferbandes wie angegeben an der Wand näher an der Mittellinie des Flaschenhalters befestigt ist (Abbildung 3E-2). Schieben Sie ein Sipper-Rohr durch die Halterung, um das Klebeband fest gegen die Wand zu drücken und die Halterung zu grundieren.
7. Um die Lötseite des Kupferbandes zu verstärken, die nicht so klebend ist und zum Ablösen neigt, tragen Sie einen Klecks Heißkleber auf die Lötstelle auf (Abbildung 3E-3). Schmieren Sie den Kleber so, dass er sowohl das Kupferband als auch alle angrenzenden freiliegenden Teile des 3D-Drucks bedeckt (Abbildung 3E-4).
8. Führen Sie das Kabel durch den internen Durchgang der Kabelbrücke (Abbildung 3F). Stellen Sie sicher, dass Sie für jedes Lickometer die geeignete Kabelbrücke (links- oder rechtsgerichtet) auswählen, um die vorgeschlagene Vivarium-Konfiguration zu verwenden (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6)."HINWEIS: Die Lickometer 5-6, 11-12 und 17-18, die in der aktuellen Konfiguration in blauen oder violetten Kabeln dargestellt sind, benötigen eine nach links gerichtete Kabelbrücke (Abbildung 4D-1), während alle anderen Lickometer einen nach rechts gerichteten Kabelschutz benötigen (Abbildung 4D-2).
9. Um die Kabelklammer zu installieren, stecken Sie zuerst einen Draht in die Nut einer Hälfte der Kabelklammer (Abbildung 3G-1), dann die andere Hälfte über den zweiten Draht und schließen Sie dann beide Hälften fest mit der Mutter (Abbildung 3G-2).
10. Beschriften Sie den Stecker mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer (Abbildung 3H). Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle 18 Lickometer gebaut sind.
Installieren von LIQ HDR lickometers
HINWEIS: LIQ HDR ist für die Installation an einem Standard-Schuhkarton-Rattenkäfig mit einer Metalldrahtplatte (Abbildung 4A-1) ausgelegt.
1. Identifizieren Sie zwei Paar Stangen mit einem Achsabstand von ~75 mm auf der Oberseite des Drahtkäfigs, um den Flaschenhalter aufzunehmen. Öffne mit einer Zange die Metallstäbe um die Sipper-Öffnungen herum. Isolieren Sie diese Stäbe mit Isolierband, um einen Metall-auf-Metall-Kontakt zwischen den Saugern und der Käfigoberseite zu verhindern (Abbildung 4A-2).
  HINWEIS: Obwohl das Isolierband für Ratten nicht zugänglich und daher nicht anfällig für Kauen ist, empfehlen wir, es am Ende der Studie zu entsorgen und zwischen den Studien nicht wiederzuverwenden.
2. Montieren Sie das Lickometer und die 1/8 Zoll dicke Laser-Acrylplatte mit zwei Sätzen M5-Schrauben und Muttern (Abbildung 4B) an der Käfigoberseite. Stellen Sie sicher, dass die Öffnungen des Sippers am Lickometer und an der Acrylplatte ausgerichtet sind und dass die Sipper nicht mit einem Teil der Käfigoberseite in Berührung kommen.
3. Befestigen Sie die Kabelklemme an der äußersten Stange (~4 mm Durchmesser) der Oberseite des Drahtkäfigs (Abbildung 4C). Passen Sie die Kabelklammer bei Bedarf an, um sicherzustellen, dass die Käfigoberseite eng an der Käfigunterseite anliegt und dass das Kabel nicht unter zu starker Spannung gezogen oder gebogen wird. Stellen Sie sicher, dass für jedes Lickometer die richtige Kabelbrücke verwendet wird (Abbildung 4D und siehe Schritt 3.8.8).
4. Stellen Sie die Sipper-Röhren nach Bedarf so ein, dass nur ~2 cm des Sippers aus der Kappe herausragen (Abbildung 4E-1). Um Flaschen zu installieren, führen Sie das Sipper-Rohr bis zum Anschlag durch die Sipper-Halterung des Flaschenhalters (Abbildung 4E-2). Nur die äußerste Spitze der Sipper-Röhre sollte über die Acrylplatte hinausragen (Abbildung 4E-3). Es ist entscheidend, dass kein anderer Teil der Sipper-Tube freigelegt wird, um falsch positive Lecks durch nicht konsumierende Verhaltensweisen zu vermeiden, wie z. B. das Berühren oder Spielen der Sipper-Tube durch die Ratte. Ein Filterdeckel sollte in der Lage sein, eng über dem Drahtkäfig und dem Kabelclip zu liegen, ohne das Kabel selbst zu stören (Abbildung 4F).
  HINWEIS: Eine dickere Acrylplatte oder ein Stapel aus mehreren 1/8-Zoll-Paneelen kann verwendet werden, um Sipper-Röhren mit längerer Länge vollständig zu umschließen, für Experimente, bei denen Sipper-Röhren weiter in den Käfig hineinragen müssen, z. B. bei der Messung des Alkoholkonsums bei jungen Ratten, die möglicherweise Schwierigkeiten haben, einen kurzen Sipper zu erreichen.
Installation und Verwendung von sipper blockers
HINWEIS: Der Sipper-Blocker (Abbildung 5A) wurde entwickelt, um den Zugang der Ratte zum Sipper während des Flaschenwechsels zu beschränken und eine genaue Kalibrierung des Lickometers zu Beginn jeder Trinksitzung zu gewährleisten.
1. Sammeln Sie die 3D-gedruckten Teile und eine M5-Schraube, eine Mutter und eine Unterlegscheibe für einen Sipper-Blocker, wie in Abbildung 5B gezeigt.
2. Fügen Sie die SIPPER_Gear in die SIPPER_Base ein (Abbildung 5C-1). Stellen Sie sicher, dass das SIPPER_Gear genau so ausgerichtet ist, wie im 3D-Rendering-Einschub gezeigt. Führen Sie den SIPPER_Worm in die Öffnung oben am SIPPER_Base ein. Drehen Sie die Schnecke beim Einführen im Uhrzeigersinn, bis der Kopf bündig mit der Basis abschließt (Abbildung 5C-2).
3. Schrauben Sie den SIPPER_Nut von der Unterseite der Basis an das Ende der Schnecke (Abbildung 5C-3). Ziehen Sie die Mutter mit einer Pinzette fest, während Sie das Schneckenrad drehen. Setzen Sie die runden, schmalen Hälse des SIPPER_Blockers in die Schlitze des Zahnrads ein (Abbildung 5C-4).
4. Montieren Sie den montierten Sipper-Blocker mit dem M5-Schraubensatz (Abbildung 5D) auf der Käfigoberseite. Stellen Sie sicher, dass beide Sipper-Blocker mit den Sipper-Öffnungen ausgerichtet sind.
5. Um den Zugang zu den Sippern zu blockieren, drehen Sie den Wurmregler im Uhrzeigersinn, um die Blocker abzusenken, bis sie die Sipper-Öffnungen vollständig abdecken (Abbildung 5E).
6. Um Zugang zu den Sippern zu erhalten, drehen Sie den Drehregler gegen den Uhrzeigersinn, bis sich die Blocker in einer vertikalen Position senkrecht zur Käfigoberseite befinden (Abbildung 5F-1). Ziehen Sie jeden Blockerarm manuell nach oben, bis sich die Köpfe knapp unter der Oberseite des Drahtkäfigs befinden. Drehen Sie die Blocker um 90°, so dass die Köpfe parallel zu den Metallstäben an der Käfigoberseite sind und die Arme arretiert sind (Abbildung 5F-2). Drehen Sie den Drehknopf so lange gegen den Uhrzeigersinn, bis beide Blocker über die Käfigoberseite angehoben sind (Abbildung 5F-3) und die Sipper vollständig zugänglich sind (Abbildung 5F-4).
Verwendung des LIQ HDR-Systems im vivarium
HINWEIS: Das folgende Vivarium-Setup ist für die Erfassung von Trinkgetränken mit zwei Flaschen über eine einzige Mikrocontroller-Schnittstelle optimiert, die mit 18 Standard-Schuhkarton-Rattenkäfigen verbunden ist. Alle elektronischen Komponenten, einschließlich der Mikrocontroller-Schnittstelle, der Sensoreinheiten und verschiedener Kabel, sind an wandmontierten Metalldrahtregalen befestigt, in denen die Käfige gehalten werden (Abbildung 6A). Möglicherweise sind einige Änderungen erforderlich, um sich an die Tiereinrichtungen und die Bedürfnisse der Benutzer anzupassen.
1. Montieren Sie jede Sensoreinheit mit der kundenspezifischen 3D-gedruckten Befestigungsschraube (Abbildung 6B) an den Vivarium-Regalen. Achten Sie darauf, dass jede Sensoreinheit direkt unter dem Käfig mit dem gelben Lickometer montiert ist, um unnötige Kabelspannungen zu vermeiden (Abbildung 6A).
2. Ordnen Sie alle Buchsenkabel an und sichern Sie sie, dass sie sich nicht überlappen oder an den Lötenden übermäßig verbiegen, was zu einer schlechten Leckerkennung führen könnte (Abbildung 6B). Wenn Metallstangenregale verwendet werden, kann dies leicht erreicht werden, indem die Verbindungskabel wie abgebildet an separate Stangen auf dem Regal gebunden werden.
3. Montieren Sie die Mikrocontroller-Schnittstelle neben der Sensoreinheit A mit derselben 3D-gedruckten Befestigungsschraube und stecken Sie den 4-poligen Stecker in den 5-V-Eingang des 5V-zu-3V-Pegelwandlers, der mit der Sensoreinheit A verbunden ist (Abbildung 6C).
4. Verwenden Sie Isolierband, um das zusätzliche Erdungskabel an einer Erdungsquelle wie dem Metallregal zu befestigen (Abbildung 6D).
5. Ordnen Sie jeden Käfig basierend auf der Farbe und ID des installierten Lickometers gemäß Abbildung 6A an, um Kabelüberlappungen und -spannungen zu minimieren.
6. Verbinden Sie alle männlichen Lickometer-Anschlusskabel sicher mit den entsprechenden weiblichen Sensoranschlusskabeln (Abbildung 6E). Schließen Sie das Netzteil an, um die Mikrocontroller-Schnittstelle einzuschalten (Abbildung 6F).
7. Tippen Sie auf der Hauptseite der GUI (grafische Benutzeroberfläche) (Abbildung 6G) auf das Einstellungssymbol, um die Seite "Einstellungen" zu öffnen. Benutzer können die Ein- und Ausschaltzeit der Lichter basierend auf dem Vivarium-Zeitplan ändern, um sicherzustellen, dass die Anzeige der Benutzeroberfläche automatisch gedimmt wird, wenn der Dunkelzyklus beginnt (Abbildung 6H-1).
8. Tippen Sie auf Sensoreinstellungen bearbeiten (Abbildung 6H-1), um den Berührungsschwellenwert auf 8 und den Auslöseschwellenwert auf 2 einzustellen, was unserer Meinung nach die konsistenteste Leckenerkennung für Ratten mit dem aktuellen Setup ermöglicht (Abbildung 6H-2). Beachten Sie jedoch, dass Benutzer möglicherweise mit anderen Einstellungen experimentieren müssen, wenn Änderungen am aktuellen System vorgenommen werden.
9. Deaktivieren Sie die Option Automatische Kalibrierung, wenn Daten nur über einen Zeitraum von 24 Stunden oder weniger erfasst werden (Abbildung 6H-2).

4. Tägliche Verfahren für das Trinken von Zwei-Flaschen-Käfigen zu Hause mit Hilfe der Leckenerkennung

Befolgen Sie die in Schritt 2 beschriebenen Schritte für Standardverfahren zur Auswahl von zwei Flaschen mit den folgenden Änderungen.
Montags, mittwochs und freitags vor dem Aufsetzen der MWF-Flaschen die Sipper-Blocker verwenden, um die Sipper-Öffnungen an allen Käfigen abzudecken (siehe Schritt 3.5.5 und Abbildung 5E).
Wählen Sie vor der Aufnahme auf der Hauptseite der GUI die richtige experimentelle Seite aus, die die Seite der EtOH-Flasche für diesen Tag sein wird (Abbildung 6G).
Nachdem Sie alle MWF-Flaschen installiert haben, tippen Sie auf der Hauptseite auf START! (Abbildung 6G), um mit der Kalibrierung der Sensoren zu beginnen, wobei den Benutzern empfohlen wird, einen Schritt vom System weg zu gehen und sicherzustellen, dass Ratten die Sipper nicht lecken (Abbildung 6I-1). Die Kalibrierung dauert einige Sekunden, danach ruft das System die Hauptaufzeichnungsseite auf, auf der die kumulativen Lecknummern auf jeder Flasche für jedes Lickometer angezeigt werden (Abbildung 6I-2).
Heben Sie alle Sipper-Blocker über den Käfigdeckel an, um den Zugang zu den Sippern zu ermöglichen (siehe Schritt 3.5.6 und Abbildung 5F), und bringen Sie alle Filterdeckel vorsichtig wie beschrieben zurück (siehe Schritt 3.4.4 und Abbildung 4F).
Tippen Sie auf Refresh, um die Lick-Zahlen auf dem Bildschirm zu aktualisieren, die sich nicht in Echtzeit aktualisieren (Abbildung 6I-2).
Tippen Sie dienstags, donnerstags und samstags auf Speichern & Beenden, um die Aufnahme zu stoppen und zur Hauptseite zurückzukehren (Abbildung 6I-2), bevor Sie die MWF-Flaschen entfernen.
Um die SD-Karte für die Datenübertragung zu entfernen, tippen Sie auf SD auswerfen, bevor Sie die SD-Karte abziehen (Abbildung 6G). Legen Sie die SD-Karte in einen beliebigen Computer ein und kopieren Sie die nach dem Einschaltdatum der Flasche benannte .csv Datendatei auf diesen Computer (Abbildung 6K). Um die SD-Karte für die nächste Aufnahme wieder zu mounten, stecken Sie die Karte in die Benutzeroberfläche und tippen Sie auf Mount SD (Abbildung 6J).
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Datendateien täglich zu sichern.
Es ist ratsam, die Körpergewichtsmessungen auf einmal pro Woche zu beschränken, sofern dies mit dem Tiermodell und dem Tierverwendungsprotokoll vereinbar ist, und diese Aufgabe an dem für den Käfigwechsel vorgesehenen Tag durchzuführen, um unnötige Störungen der Leckometer und Sensoren zu minimieren. Trennen Sie alle männlichen Lickometerkabel von den passenden weiblichen Sensorkabeln, bevor Sie die Käfige bewegen. Nachdem Sie jede Ratte gewogen haben, setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig zurück. Setzen Sie das Lickometer auf einen neuen Käfigdeckel um und schließen Sie jedes Lickometer bei Bedarf wieder an den entsprechenden Sensor an.
Bei Experimenten, in denen die Wirkung einer Intervention (z. B. Drogeninjektion) auf die EtOH-Aufnahme und die Mikrostruktur des Trinkens getestet wird, sollten solche Interventionen nach Möglichkeit vor Beginn der Trinksitzung geplant werden. In Fällen, in denen dies nicht möglich ist, können Forscher die Leckenerkennung unterbrechen, indem sie auf Pause (Abbildung 6I-2) tippen und die Datenerfassung fortsetzen, indem sie auf Fortsetzen tippen, nachdem die Intervention abgeschlossen ist. Wir empfehlen, während jeder Pause des Trinkvorgangs Flaschengewichte zu sammeln, um Veränderungen in der EtOH-Aufnahme vor und nach dem Eingriff zu erfassen und um Verschüttungen zu berücksichtigen, die auftreten können, wenn der Käfigdeckel entfernt wird, um Zugang zum Tier zu erhalten.
Am Ende der Studie sollten alle Bestandteile im Käfig gründlich desinfiziert werden, bevor sie bei neuen Tieren verwendet werden, um die Übertragung von Schadstoffen zwischen Tieren zu begrenzen. Wir empfehlen, das Lickometer vorsichtig mit 70%iger EtOH-Lösung zu besprühen und abzuwischen, wobei darauf zu achten ist, dass die internen elektrischen Komponenten nicht beschädigt werden. Der Sipper-Blocker und die Acrylplatte können mit warmem Seifenwasser gewaschen werden.

5. Datenanalyse

Korrigieren Sie vor der Bewertung abhängiger Maßnahmen die Aufnahmedaten auf Verschüttungen, die unweigerlich durch den täglichen Flaschenwechsel entstehen. Zu diesem Zweck wird die Veränderung des Flaschengewichts für EtOH- und_H2O-Flaschen auf dem Verschüttungskäfig über den gesamten Untersuchungszeitraum gemittelt.
Alle Werte, die größer als zwei Standardabweichungen vom Mittelwert für jede Flasche sind, sind auszuschließen. Nach Ausschluss dieser Ausreißer werden die berechneten Mittelwerte von den Änderungen des EtOH- und_{H2O-Flaschengewichts}abgezogen, die aus Flaschen in Käfigen mit Tieren erhalten wurden. Durch Abzug dieser Menge können die Forscher sicher sein, dass der durchschnittliche Verlust, der sich aus dem Verschütten einer bestimmten Lösung ergibt, bei der Messung des Verbrauchs nicht berücksichtigt wird. Die Subtraktion von der durchschnittlichen verschütteten Menge kann bei einigen Tieren in einigen Fällen zu einem negativen Wert führen. Wandeln Sie diese in Null um und interpretieren Sie sie als Abwesenheit jeglicher Aufnahme für diese Lösung.
Die primären abhängigen Maße für Experimente mit zwei Flaschen sind die EtOH-Aufnahme (g/kg) und die Präferenz (%). Berechnen Sie die Aufnahme aus der Änderung des EtOH-Flaschengewichts (g) und normalisieren Sie sie mit den folgenden Schritten auf das Körpergewicht (kg).
1. Rechnen Sie die Änderung des Flaschengewichts (g) in die Volumenänderung (ml) um, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
  
  Die Dichte von reinem Ethanol beträgt 0,789 g/ml. Daher beträgt die beitragende Dichte von 20 % EtOH 0,1578 g/ml. H₂O wiegt 1 g/ml. Daher ist die beitragende Dichte von 80 % H₂O = 0,80 g/ml. Folglich besteht jeder ml einer 20%igen EtOH-Lösung (v/v) aus 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/ml. Daher lautet die endgültige Gleichung bei Verwendung einer EtOH-Konzentration von 20 % (v/v):
2. Berechnen Sie die Dosis des verbrauchten Ethanols anhand der folgenden Gleichung. Verwenden Sie das Körpergewicht, das in der gleichen Woche wie die Aufnahmedaten ermittelt wurde, um das verbrauchte Ethanol in Bezug auf das Körpergewicht der Tiere zu berechnen.
3. Berechnen Sie die Präferenz mit der folgenden Gleichung:
Wie sein Gegenstück ³⁰ erfasst LIQ HDR eine Vielzahl von Variablen der Mikrostruktur des Trinkens, darunter die Leckdauer, die Anzahl der Schüsse, die Dauer des Lecks, die Anzahl der Lecks und die Dauer des Lecks (Abbildung 6K). Ein Trinkgelage ist definiert als eine Reihe von Lecken, die mit mindestens 3 Lecks in weniger als 1 Sekunde beginnt und nach 3 Sekunden ohne weitere Lecks endet. Diese Messungen können dann verwendet werden, um die durchschnittliche individuelle Lick-Dauer, die durchschnittliche individuelle Kampfdauer, die durchschnittliche Anzahl der Licks pro Kampf, die durchschnittliche Lechhäufigkeit, das geschätzte Inter-Lick-Intervall und das geschätzte Inter-Comout-Intervall zu berechnen.
HINWEIS: Die Mikrocontroller-Schnittstelle stellt diese Mikrostrukturdaten mit einer Auflösung von 1 Minute in einer .csv Datei zur Verfügung (Abbildung 6K). Forscher können die Analyse-App, die mit dem ursprünglichen LIQ HD-Protokoll bereitgestellt wird, ³⁰ oder ihre bevorzugte Nachbearbeitungsplattform verwenden, um Daten entsprechend den Forschungsanforderungen zusammenzustellen und zusammenzufassen. Mikrostrukturdaten werden in der Regel über den gesamten Zeitraum von 24 Stunden summiert, um die gemittelten Unterschiede auf Makroebene zu vergleichen, oder in einem Zeitraum von 30 Minuten bis 1 Stunde, um Variationen des Trinkmusters über einen Hell-Dunkel-Zyklus zu untersuchen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardmäßiger intermittierender Zwei-Flaschen-Käfig nach Wahl für zu Hause, EtOH-Trinkdaten
Mit dem Standardverfahren (Abbildung 7A) können Forscher sowohl eine 24-stündige Aufnahme (Abbildungen 7B-D) als auch exzessives Trinken erfassen, wenn das Flaschengewicht kurz nach Beginn der Trinksitzung gesammelt wird (Abbildungen 7E-F). Durch die Berechnung der Ethanolaufnahme im Verhältnis zur Wasseraufnahme können die Forscher auch Präferenzdaten zu allen gemessenen Zeitpunkten erhalten (Abbildungen 7D,F). Wie in Abbildung 7C gezeigt, zeigen Ratten häufig eine Periode der Eskalation in der Ethanolaufnahme im Laufe der ersten Tage des Zugangs zu zwei Flaschen. Daran schließt sich ein Plateau an, bei dem die Aufnahme relativ stabil bleibt. Obwohl es konsistent bei männlichen Ratten beobachtet wird⁷^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶, wird dieses Muster bei Weibchen nicht immer beobachtet. Stattdessen berichten einige Studien über stabile Ethanolaufnahmen während des gesamten Studienzeitraums bei weiblichen Ratten³⁷^,³⁸. Darüber hinaus deuten einige Studien darauf hin, dass der Ethanolkonsum bei längerer Zugriffszeit weiter eskalieren kann³⁶^,³⁹. Die tägliche Aufnahme kann von Person zu Person erheblich variieren. Die durchschnittliche tägliche Aufnahme wurde jedoch für die in der Alkoholforschung am häufigsten verwendeten Stämme gut charakterisiert und kann als Erfolgsmaßstab verwendet werden, wenn man sich gruppierte Daten ansieht⁷^,⁸^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁹.

Wie in Abbildung 7E gezeigt, konsumieren viele Ratten einen erheblichen Teil ihrer täglichen Ethanolaufnahme kurz nach Beginn der Trinksitzung⁸^,³³. Dieses binge-like Muster der Ethanolaufnahme ist oft mit einer signifikanten Bevorzugung von Ethanol gegenüber Wasser verbunden (Abbildung 7F). Forscher sollten jedoch nicht überrascht sein, wenn die 24-Stunden-Präferenz 50 % nicht überschreitet. Dies gilt insbesondere für gezüchtete oder alkoholfreie Nagetierstämme und Studien, die auf relativ kurze Zeiträume des Zugangs zu zwei Flaschen beschränkt sind⁷^,³²^,³³^,³⁵^,³⁷.

Validierung von LIQ HDR für die Mikrostrukturanalyse von Trinkflaschen mit zwei Flaschen
Die Hinzufügung des LIQ HDR-Systems zum Standard-Paradigma der Zwei-Flaschen-Wahl von Ratten ermöglicht es den Forschern, den Konsum anhand der erfassten Trinkdaten genau und präzise vorherzusagen. Dies wird durch das Vorhandensein einer starken und signifikanten Korrelation zwischen der kumulativen Anzahl der detektierten Lecksteine und der Änderung des Flaschengewichts sowohl für die EtOH (R² = 0,7789, F_(1,113) = 398,1, p < 0,0001) als auch für die H₂O-Flasche (R² = 0,7910, F_(1.117) = 442,9, p < 0,0001) über einen Zeitraum von 24 Stunden (Abbildung 8A) bestätigt. Dies gilt auch für Tage, an denen Ratten zwei Flaschen mit H₂O (R² = 0,8875, F_(1,188) = 1484, p < 0,0001; Abbildung 8B).

LIQ HDR ermöglicht auch eine präzise Analyse von Trinkmustern bei einer hohen zeitlichen Auflösung, die durch das Standard-Zwei-Flaschen-Choice-Paradigma nicht ermöglicht wird. Mit diesem Ansatz haben Forscher die Möglichkeit, Unterschiede im Trinkverhalten zwischen verschiedenen Lösungen, über den Lichtzyklus, zwischen Geschlechtern, Medikamentengruppen und mehr zu untersuchen. Zur Veranschaulichung: Das Binning der durchschnittlichen Leckvorgänge in 30-Minuten-Intervalle ermöglicht eine einfache Analyse des durchschnittlichen Trinkverhaltens von 24 Stunden. Erwartungsgemäß zeigt diese Analyse eine signifikant höhere Aufnahme von EtOH und H₂O während des Dunkelzyklus, wenn Ratten wach sind, als im Lichtzyklus, wenn Ratten typischerweise schlafen (Abbildung 8C). Mit einem ähnlichen Ansatz können Forscher Gruppenunterschiede im Trinkverhalten untersuchen. Zum Beispiel kann die Mikrostruktur des Trinkens zwischen männlichen und weiblichen Ratten verglichen werden, indem die durchschnittliche Anzahl der Lecksteine auf EtOH (Abbildung 8D) oder Wasser (Abbildung 8E) über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht wird. Um Frontloading und/oder Rauschtrinken zu untersuchen, können Forscher die Auflösung ihrer Analyse erhöhen, um sich auf das Trinken zu konzentrieren, das kurz nach Beginn der Sitzung auftritt, indem sie ein kleineres Binned-Fenster verwenden, um die Daten zusammenzufassen. Auf diese Weise können Forscher Perioden von Rauschtrinken untersuchen, ohne dass innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden mehrere Flaschengewichte gesammelt werden müssen. Wie in Abbildung 8C (Einschub) gezeigt, zeigt diese Analyse, dass der größte Teil des Alkoholkonsums, der durch ein Flaschengewicht erfasst wird, das 30 Minuten nach Beginn der Sitzung erhalten wird, in den ersten 5 Minuten und nicht während des gesamten 30-Minuten-Zeitraums auftritt. Daten wie diese können dabei helfen, optimale Zeitpunkte für die Entnahme von Blutproben zur Messung der Ethanolkonzentration (BEC) im Blut zu identifizieren. In der Tat wurde ein ähnliches Muster des Frontloadings an einem separaten Trinktag beobachtet, an dem hochauflösende Trinkmuster in einem Zeitraum von nur 15 Minuten erfasst wurden (Abbildung 8F). Durchschnittliche Lecks, die während dieser Sitzung aufgezeichnet wurden, sagten zuverlässig die Veränderung des Flaschengewichts voraus (EtOH: R² = 0,6316, F_(1,10) = 17,15, p = 0,0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Abbildung 8G). Darüber hinaus korrelierten BECs, die aus Blutproben entnommen wurden, die 15 Minuten nach Beginn der Sitzung entnommen wurden, gut mit der Anzahl der nachgewiesenen Lecks (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; Abbildung 8H) auch bei relativ geringer EtOH-Aufnahme.

LIQ HDR erfasst verschiedene Messungen der Mikrostruktur des Trinkens, die während des Trinkens in Echtzeit erkannt und berechnet und in 1-Minuten-Bins gespeichert werden, ähnlich wie bei der Leckenerkennung (Abbildung 6K). Diese Kennzahlen werden in Schritt 5.4 kurz skizziert und zuvor definiert³⁰. Die Forscher können die Veränderungen der individuellen Mikrostruktur des Trinkens detailliert analysieren und untersuchen, wie und in welchem Ausmaß das Trinkverhalten zu den Unterschieden im Gesamtkonsum beiträgt. Zur Veranschaulichung fanden wir heraus, dass, obwohl männliche und weibliche Ratten beim Trinken von Wasser eine ähnliche Anzahl von Lecken, Trinkanfällen und Kampflängen (Abbildung 9A-C) aufwiesen, dies bei Weibchen mit einer höheren Gesamtaufnahme (g/kg) als bei Männchen verbunden war (t-Test; t=2,882, df=10, p=0,0163; Abbildung 9D). Dies ist angesichts des Geschlechtsdimorphismus im Körpergewicht zu erwarten, der bei einer entsprechenden Anzahl von Lecks eine höhere Aufnahme nach Körpergewicht bei Weibchen als bei Männchen ermöglicht. Auffallend ist, dass dies im Gegensatz zum Vergleich der Geschlechtsunterschiede in den Mikrostrukturmustern für EtOH steht, der eine ähnliche Mikrostruktur des Trinkens in Verbindung mit ähnlichen Mengen an EtOH-Aufnahme ergab (Abbildungen 9E-H). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Leckenvolumen für Wasser zwischen den Geschlechtern zwar ähnlich ist, weibliche Ratten jedoch im Vergleich zu männlichen Ratten ein geringeres Leckenvolumen für EtOH aufweisen. Zusammengenommen unterstützen diese mikrostrukturellen Daten die Idee, dass sich männliche und weibliche Ratten wahrscheinlich in ihren freiwilligen Trinkstrategien unterscheiden, basierend auf der Art der Flüssigkeit, die im häuslichen Käfig konsumiert wird. Frühere Arbeiten haben auch über geschlechtsspezifische Unterschiede in Trinkstrategien berichtet, die vom Flüssigkeitstyp abhängen⁴⁰^,⁴¹, obwohl die in diesen Studien beobachteten Unterschiede nicht nur auf den Wasserverbrauch beschränkt waren. Die Länge der Trinkanamnese könnte eine Rolle bei den Unterschieden spielen, die zwischen den Studien beobachtet wurden, da das Trinken mit zwei Flaschen im aktuellen Datensatz auf 5 Wochen begrenzt war, während es in früheren Arbeiten über 12 Wochen lag⁴⁰^,⁴¹.

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Abbildung 1: Trinken in einem Käfig mit zwei Flaschen. (A) Forscher können die freiwillige Ethanolaufnahme und -präferenz (im Verhältnis zu Wasser) zu Hause messen, indem sie einen Standardansatz verwenden, der die Aufnahme auf der Grundlage der Änderung des Flaschengewichts berechnet. (B) Durch die Verwendung von LIQ HDR, einem kostengünstigen DIY-System zur Erkennung von Käfiglecken für zu Hause, können Forscher die gleichen Messungen wie beim Standardverfahren zur Auswahl von zwei Flaschen erfassen und gleichzeitig die hochauflösende Mikrostruktur des Trinkens während des gesamten Aufzeichnungszeitraums erfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Konstruktion kapazitiver Sensoreinheiten. (A) Elektronische Teile und Schaltplan. (B) Materialien für den Bau von drei kapazitiven Sensoreinheiten, die für den Aufbau eines LIQ HDR-Systems erforderlich sind. (C) Löten Sie 2-polige weibliche Verbindungskabel für die Käfige #1-6 an die Platine A Pin #0-11 und befestigen Sie die Lötstellen mit Heißkleber. Kennzeichnen Sie Kabel mit farbigen Schrumpfschläuchen farblich und beschriften Sie jedes mit einer eindeutigen Lickometer-ID-Nummer. (D) Verbinden Sie Platine A und den 5-V-zu-3-V-Pegelwandler mit einem differentiellen I²C-Kommunikationsausbruch EndPoint mit 4-poligen Kabeln (1) und Hausplatine A und den Kommunikationsausbruch im 3D-gedruckten Gehäuse (2-3). (E) Ändern Sie die I²C-Adressen der Platinen B und C, indem Sie einen Überbrückungsdraht vom ADDR-Pin an die 3Vo- bzw. SDA-Pins löten. (F) Löten Sie 2-polige Buchsensteckerkabel an die Sensorplatinen B und C, beschriften Sie sie mit den entsprechenden Lickometer-IDs und verbinden Sie Platine B mit einem Kommunikationsbreakout MidPoint und Platine C mit einem EndPoint mit 4-poligen Kabeln. (G) Platzieren Sie die Sensoreinheiten B und C in ihren jeweiligen 3D-gedruckten Gehäusen und schalten Sie alle drei Einheiten mit Ethernet-Kabeln in Reihe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Erstellen Sie das LIQ HDR Lickometer. (A) 3D-Rendering der Komponenten im Käfig. (B) Materialien zum Aufstellen eines Zwei-Flaschen-Lickometers. Beachten Sie, dass ein LIQ HDR-System 18 Zwei-Flaschen-Lickometer aufnehmen kann. (C) Verlängern Sie die Länge des 2-poligen Steckerkabels mit einem Paar schwarzer und roter Drähte und einem Farbcode mit einem Schrumpfschlauch. (D) Fädeln Sie die schwarzen und roten Drähte durch die linke (L) und rechte (R) Öffnung am Flaschenhalter (1) und löten Sie die Enden an die Kupferbänder (2-3). (E) Kleben Sie die Kupferbänder an die Innenwände der Sipper-Halterungen (1-2) und verstärken Sie diese mit Heißkleber (3-4). (F) Fädeln Sie das Kabel durch die Kabelbrücke. (G) Bringen Sie die Kabelklemme an. (H) Beschriften Sie den Stecker mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Installation des Lickometers. (A) Verwenden Sie Isolierband, um die Metallstangen um die Sipper-Öffnungen an der Oberseite des Metallkäfigs zu isolieren. (B) Montieren Sie das Lickometer und die Acrylplatte mit zwei Sätzen M5-Schrauben und Muttern an der Käfigoberseite. (C) Befestigen Sie die Kabelklemme an der äußersten Stange der Oberseite des Drahtkäfigs. (D) Stellen Sie sicher, dass Sie für jeden Käfig die geeignete Kabelbrücke (linkes L oder rechtes R) verwenden. (E) Stellen Sie sicher, dass nur ~2 cm des Flaschen-Sippers freigelegt sind (1), so dass, wenn die Flaschen auf den Käfig (2) gestellt werden, nur die äußersten Spitzen der Sipper über die Acrylplatte hinausragen und für Ratten zugänglich sind. (F) Die Filteroberseite sollte über die Kabelklemme passen, ohne das Kabel selbst zu beschädigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Installation und Verwendung des Sipper-Blockers. (A) 3D-Rendering des Sipper-Blockers. (B) Kundenspezifische 3D-gedruckte Teile für einen Sipper-Blocker. (C) Montieren Sie die 3D-gedruckten Teile. (D) Montieren Sie den montierten Sipper-Blocker mit einer M5-Schraube + Mutter + Unterlegscheibe auf der Käfigoberseite. (E) Drehen Sie den Drehregler im Uhrzeigersinn, um den Zugang zu den Sippern zu blockieren. (F) Drehen Sie den Drehknopf gegen den Uhrzeigersinn, um die Blocker von den Sippern (1) zu entfernen, heben Sie die Blocker an und drehen Sie sie um 90° (2) und drehen Sie den Drehknopf weiter gegen den Uhrzeigersinn, bis sich die Blocker über der Käfigoberseite (3-4) befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Vivarium-Einrichtung und GUI-Betrieb. (A) Empfohlener Vivarium-Aufbau und Schaltplan. (B) Montieren Sie jede Sensoreinheit am Regal und ordnen Sie die Sensorkabel am Regal an und stabilisieren Sie sie. (C) Montieren Sie die Mikrocontroller-Schnittstelle am Regal und verbinden Sie den 4-poligen Jumper mit dem 5-V-zu-3-V-Pegelwandler, der mit der Sensoreinheit A verbunden ist. (D) Sichern Sie das zusätzliche Erdungskabel mit Isolierband. (E) Verbinden Sie die Sensorkabel mit den entsprechenden Lickometerkabeln. (F) Schließen Sie das Netzteil an, um die Mikrocontroller-Schnittstelle einzuschalten. (G) Hauptseite der GUI-Schnittstelle. (H) Tippen Sie auf Einstellungen, um die Ein-/Ausschaltzeit der Beleuchtung an den Vivarium-Lichtplan anzupassen (1), und tippen Sie auf Sensoreinstellungen, um die Berührungs- und Freigabeschwellen für Ratten anzupassen (2). (I) Um Daten aufzuzeichnen, wählen Sie auf der Hauptseite die EtOH-Flaschenseite aus und tippen Sie auf START! , um die Sensoren zu kalibrieren (1) und die Aufzeichnung zu starten (2). Tippen Sie auf Aktualisieren, um die auf dem Bildschirm angezeigte Lick-Nummer zu aktualisieren, und tippen Sie auf Speichern & Beenden, um die Aufnahme zu stoppen. (J) Tippen Sie auf der Hauptseite auf SD auswerfen, um die SD-Karte zu entfernen und Daten zu übertragen. Tippen Sie nach dem Einlegen der SD-Karte auf SD mounten. (K) Screenshot einer repräsentativen Rohdatendatei, die zeigt, wie Mikrostrukturdaten von der Mikrocontroller-Schnittstelle in 1 min bin gespeichert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Repräsentative Trinkdaten mit zwei Flaschen, die mit dem Standardverfahren erfasst wurden. Im intermittierenden EtOH-Trinkparadigma mit zwei Flaschen zur Wahl des Heimkäfigs erhalten (A) Ratten montags, mittwochs und freitags 20 % (v/v) EtOH-Lösung (orange) und H₂O (blau) (MWF) und dienstags, donnerstags und am Wochenende zwei Flaschen mit H₂O. (B) Messungen der täglichen Flüssigkeitsaufnahme zeigen, dass Ratten während des gesamten Studienzeitraums ein relativ konstantes Niveau der Gesamtflüssigkeitsaufnahme (ml) aufrechterhalten, während (C) Ratten im Verlauf der ersten Trinksitzungen häufig eine Eskalation der EtOH-Aufnahme aufweisen, wonach die Aufnahmemengen ein Plateau aufweisen. (D) Dieses Muster der Eskalation und Wartung spiegelt sich in ähnlicher Weise in der Präferenz für EtOH wider. Forscher können auch die Binge-like EtOH-Aufnahme (E) erfassen, wenn das Flaschengewicht nach den ersten 30-60 Minuten des Beginns der Sitzung gesammelt wird. (F) Dies ist oft mit einer hohen Präferenz für EtOH gegenüber H₂O verbunden. Schattierte Fehlerbalken repräsentieren ± SEM (n = 32 für Männer und n = 16 für Frauen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: LIQ HDR erfasst den Verbrauch bei hoher zeitlicher Auflösung genau. Die Präzision und Genauigkeit des LIQ HDR-Systems wird zum Teil durch das Vorhandensein einer signifikanten positiven Korrelation zwischen der Anzahl der Lecken und der Veränderung des Flaschengewichts an Tagen, an denen Ratten (A) H₂O und EtOH erhalten, sowie an (B) Tagen, an denen beide Flaschen H₂O enthalten, bestätigt. (C) Unterschiede im Trinkverhalten zwischen H₂O (blau) und EtOH (orange) über die 24-stündige Trinkperiode können leicht beurteilt werden, indem die durchschnittlichen Leckvorgänge in 30-Minuten-Intervalle eingeteilt werden. Der Einschub entspricht dem durchschnittlichen Lecken in 5-Minuten-Behältern während der ersten 30 Minuten des Flaschenzugriffs (grau markiert), während dieser Zeit zeigen Ratten oft ein signifikantes Frontladerverhalten. Unterschiede zwischen den Gruppen im Trinkverhalten können auch mit einem ähnlichen Ansatz untersucht werden, wie z. B. die Leckmikrostruktur für (D) EtOH und (E) H₂O, die für männliche und weibliche Ratten über einen Zeitraum von 24 Stunden dargestellt wird. (F) Trinkmuster können auch in hoher zeitlicher Auflösung über einen kürzeren Testzeitraum beurteilt werden, (G) während der LIQ HDR die Aufnahme weiterhin genau verfolgt und (H) die Ethanolkonzentration (BEC) im Blut auch bei relativ geringen EtOH-Aufnahmen vorhersagen. Schattierte Fehlerbalken stellen ± SEM dar (n = 6 für jedes Geschlecht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Repräsentative Daten zur Mikrostruktur des Trinkens. LIQ HDR ermöglicht die Erfassung von Messungen der Mikrostruktur des Trinkens, einschließlich (A) der Anzahl der Lecken, (B) der Anzahl der Trinkstöße und (C) der Länge des Trinkvorgangs, zusätzlich zu (D) der Messung der Gesamtwasseraufnahme durch eine Änderung des Flaschengewichts. (E-H) Ähnliche Maßnahmen können für Ethanol ergriffen werden. Vergleiche zwischen den Gruppen dieser Messungen können unterschiedliche Trinkmuster identifizieren, wie es im aktuellen Beispiel der Fall ist, das geschlechtsspezifische Unterschiede in den Trinkstrategien basierend auf der konsumierten Lösung aufzeigt. Die durchgezogene Linie zeigt den Median an, und die gestrichelten Linien zeigen die Quartile an (n = 6 für jedes Geschlecht); ungepaarter t-Test; *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzend Abbildung 1: Aufbau der Mikrocontroller-Schnittstelle. (A) Elektronische Teile und Schaltplan. (B) Materialien für den Aufbau der Mikrocontroller-Schnittstelle, die für ein LIQ HDR-System erforderlich ist. (C) Fügen Sie auf der Rückseite des kapazitiven Berührungsschutzes einen Lötjumper über die hinteren Lite-Lötpads hinzu. (D) Trennen Sie auf der Rückseite des Datenlogger-Shields die Jumper-Pad-Leiterbahn des CS-Pins (1). Löten Sie einen Überbrückungsdraht vom CS-Pin an Pin #7 (2). (E) Löten Sie die Stiftleisten mit dem Berührungsschutz als Basis an den Datenlogger. (F) Stapeln Sie den verbleibenden 2x4-Header auf den Mikrocontroller (1), stapeln Sie den Datenlogger auf dem Mikrocontroller und löten Sie den Header fest (2). (G) Legen Sie die Knopfbatterie in den Datenlogger (1) ein, stapeln Sie den Touchscreen auf den Datenlogger und setzen Sie die SD-Karte in den Datenlogger (2) ein. (H) Um das zusätzliche Erdungskabel herzustellen, schneiden Sie einen männlichen Stecker vom Überbrückungskabel ab und löten Sie das Ende an einen abisolierten Massivkerndraht. (I) Verbinden Sie die 4-poligen Überbrückungskabel und das zusätzliche Erdungskabel mit dem Mikrocontroller (1) und befestigen Sie sie mit Heißkleber (2). (J) Die Mikrocontroller-Schnittstelle befindet sich in einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Gehäuse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Das aktuelle Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erfassung von Ethanoltrinkdaten unter Verwendung eines Verfahrens mit intermittierendem Zugriff auf zwei Flaschen nach Wahl für zu Hause. Diese Methode kann relativ einfach und mit geringen bis gar keinen Kosten oder dem Bedarf an speziellen Forschungsgeräten implementiert werden. Mit den hier bereitgestellten Verfahren zur Konstruktion und Implementierung von LIQ HDR - einem Leckerkennungssystem für den Einsatz bei Ratten - können Forscher zusätzlich zu den Standardmaßen der Aufnahme und Präferenz hochauflösende Daten zur Mikrostruktur von Trinken erfassen.

Der im aktuellen Protokoll beschriebene intermittierende Zugangsplan ist ein weit verbreitetes Verfahren, das zum großen Teil deshalb verwendet wird, weil es bekanntermaßen eine höhere Ethanolaufnahme hervorruft als viele alternative Zeitpläne für den Ethanolzugang. In der Tat haben frühere Untersuchungen gezeigt, dass Ratten mit intermittierendem Zugang eine höhere durchschnittliche tägliche Ethanolaufnahme haben als Ratten mit kontinuierlichem 24-Stunden-Zugang ^6,7. Nichtsdestotrotz können je nach Forschungsfrage oder anderen experimentellen Designparametern unterschiedliche Zeitpläne für den Zugang zu Ethanol wünschenswert sein. Forscher können das aktuelle Protokoll sehr einfach an unterschiedliche Zeitpläne anpassen (z. B. kontinuierlicher Zugang, Trinken im Dunkeln usw.), indem sie einfach die Zeit und die Tage des Ein- und Ausschaltens der Flasche ändern.

Obwohl das Trinken mit zwei Flaschen ein relativ einfach zu implementierendes Paradigma ist, können Probleme auftreten, die die Datenerfassung beeinträchtigen können. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Experimentatoren die Daten täglich überprüfen, um potenzielle Probleme schnell zu erkennen. Insbesondere sollten Forscher genau auf sehr große oder sehr kleine Veränderungen des Flaschengewichts achten, die auf einen undichten bzw. verstopften Schluck hinweisen können. Das frühzeitige Erkennen von Anzeichen dieser Probleme kann verhindern, dass alle Daten eines bestimmten Probanden von der Analyse ausgeschlossen werden. Wenn Forscher über einen Zeitraum von 24 Stunden drastische Veränderungen (oder das Fehlen einer Veränderung) des Flaschengewichts feststellen, kann ein einfacher Wechsel zu einer neuen Flasche helfen, zu bestätigen, ob eine bestimmte Flasche aus dem Verkehr gezogen werden sollte. Aus diesen Gründen ist es ratsam, zusätzliche Flaschen und Trinkflaschen zur Hand zu haben. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige Ratten von Natur aus einen sehr geringen Ethanolkonsum aufweisen, z. B. ³⁵. Dies gilt insbesondere für Ratten bestimmter Stämme, siehe⁸ für eine Übersicht. Daher sollten Forscher nicht beunruhigt sein, wenn eine kleine Population von Tieren in einem bestimmten Versuch einen geringen oder keinen Ethanolverbrauch aufweist. Ebenso neigen einige Tiere dazu, mit dem Schlucker/der Flasche auf eine Weise zu spielen, die das Verschütten fördern kann. Obwohl selten, können wiederholte Fälle von starken Veränderungen des Flaschengewichts, die nicht mit dem Verzehr in Verbindung stehen, dazu führen, dass ein bestimmtes Tier aus dem Versuch entfernt wird.

Unser detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zeigt die einfache Implementierung und Anwendung des LIQ HDR-Systems für Ratten. Forscher ohne Vorkenntnisse oder Fähigkeiten in der Elektronik und Programmierung von Mikrocontrollern können dieses System ohne weiteres und mit geringen oder gar keinen Modifikationen an ihre experimentellen Anforderungen anpassen. Unsere repräsentativen Daten zeigen die erfolgreiche Anwendung für Studien zum Trinken von Ratten in Heimkäfigen und ihre leistungsstarke Fähigkeit, zahlreiche Messungen der Mikrostruktur des Trinkens mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen. LIQ HDR enthält mehrere Designänderungen im Vergleich zu seinem Vorgänger³⁰. Dies geschah nicht nur als Notwendigkeit für eine erfolgreiche Anpassung an den Einsatz bei Ratten, sondern auch zur Verbesserung der Funktionalität und der Benutzererfahrung. Komponenten im Käfig, einschließlich des 3D-gedruckten Flaschenhalters, des Sipperblockers und der elektronischen Komponenten, wurden zum Schutz vor Kauen an die Käfigoberseite verlegt, was zu häufigen und erheblichen Datenverlusten und Hardware-Umschlag führen kann. Das Hinzufügen einer lasergeschnittenen Acrylplatte trägt zusätzlich dazu bei, die Zerstörung dieser empfindlichen Komponenten zu verhindern. Abgesehen von der Acrylplatte, die aus dem gleichen Material wie ein Standard-Schuhkarton-Rattenkäfig besteht, sind alle anderen LIQ HDR-Komponenten für das Tier aus dem Inneren des Käfigs nicht oder nur für einen kurzen Moment während des Flaschenwechsels zugänglich. Diese Konstruktion begrenzt das Potenzial für die Zerstörung von Gerätekomponenten und das Risiko für das Tier durch Verschlucken von Non-Food-Artikeln. Im Gegensatz zu den relativ arbeitsintensiven Sonderanfertigungen, die im LIQ HD-Design verwendet werden, ist der 3D-gedruckte Flaschenhalter von LIQ HDR so konzipiert, dass er mit handelsüblichen Nagetier-Trinkflaschen kompatibel ist. Die Flaschen werden auf dem Käfigdeckel installiert und sind für Ratten auf die gleiche Weise zugänglich, wie Trinkflaschen bei der Standardpflege und -haltung verwendet werden. Das Hinzufügen von Sipper-Blockern ist eine einfache, aber effektive Lösung, die die Systemzuverlässigkeit verbessert und wertvolle Datenverluste verhindert, die ohne den Blocker durch Trinken entstehen können, das vor dem Start der Datenerfassung auf der Arduino-Schnittstelle auftritt, oder durch fehlerhafte Leckmessungen, die auftreten, wenn Ratten während der täglichen Kalibrierung mit den Sippern interagieren. Während die wesentlich größeren Rattenkäfige eine Vergrößerung des ursprünglichen Hardware-Designs erfordern, kann sich die Verwendung deutlich längerer Kabel aufgrund von Interferenzen negativ auf die Empfindlichkeit und Genauigkeit der kapazitiven Sensorik sowie auf die Integrität der^{I2C-Kommunikation}zwischen den Daisy-Chain-Sensorplatinen und der Arduino-Schnittstelle auswirken. Wir umgehen dieses Problem mit der Einführung des differentiellen^{I2C-Kommunikationssystems}, um eine nahezu verlustfreie Signalübertragung über Ethernet-Kabel mit extrem großer Reichweite zu erreichen. Die für die Käfigkomponenten verwendeten Materialien ermöglichen eine einfache Reinigung und Desinfektion zwischen den Einsätzen. Das Lickometer kann mit 70%iger EtOH-Lösung kastriert und abgewischt werden, wobei darauf geachtet werden muss, dass die elektrischen Komponenten, wie z. B. das leitende Kupferband, intakt bleiben. Nicht-elektrische Geräte, die in direktem Kontakt mit dem Tier stehen, wie z. B. der Sipper-Blocker und die Acrylplatte, können gründlich mit warmem Seifenwasser gewaschen werden.

Die Zuverlässigkeit und Effektivität eines jeden Lecksuchsystems erfordert eine ordnungsgemäße Konstruktion und Installation sowie umfangreiche Tests, eine sorgfältige Fehlerüberwachung und eine effektive Fehlerbehebung. Alle DIY-Komponenten müssen mit Geschick und Sorgfalt hergestellt und montiert werden. Dies ist besonders wichtig für Schritte mit Löten, die für Anfänger Übung erfordern können. Unabhängig davon ist eine umfangreiche Prüfung aller Lickometer erforderlich, bevor sie in tatsächlichen Versuchen eingesetzt werden können. Wenn das System modifiziert werden muss, um es an individuelle experimentelle Anforderungen anzupassen, müssen die Sensoreinstellungen (z. B. Berührungs- und Freigabeschwellen) möglicherweise weiter feinabgestimmt werden, um eine genaue Leckerkennung zu gewährleisten. Für Erstanwender empfehlen wir, das System in einer kurzen Pilotstudie mit einer sehr schmackhaften Lösung zu testen, die ein hohes Maß an Alkoholkonsum erzeugt. Die Leckerkennung kann in Echtzeit überprüft werden, indem die Sensorplatine visuell überprüft wird, da die LED blinkt, wenn ein Lecken registriert wird. Starke, signifikante und konsistente Korrelationen zwischen der Anzahl der Lecken und der Änderung des Flaschengewichts sollten als Maßstab für die richtige Einrichtung von Hardware und Software verwendet werden. Auch nachdem die Einrichtung abgeschlossen ist, empfehlen wir, die Aufzeichnung für ein bestimmtes Experiment an einem Tag zu starten, an dem Ratten zwei Flaschen mit Wasser erhalten, um Probleme mit der Ausrüstung zu beheben, die zu Beginn eines Experiments offensichtlich auftreten können. Es kann auch von Vorteil sein, die Funktion des Lickometers am Wassertag zu testen, der mit dem Käfigwechsel verbunden ist, da dies erfordert, dass die Lickometer abgeschaltet und wieder mit dem Sensor verbunden werden. Ein zufälliger Ausfall eines einzelnen Lickometers oder Sensors, der zu sehr offensichtlichen Ausreißerdaten führen würde (z. B. keine oder nur wenige Lecks werden trotz einer erheblichen Änderung des Flaschengewichts erkannt), ist ein Hinweis auf fehlerhafte Komponente(n). Wir empfehlen, für jedes Element des Lickometer-Systems im Voraus zusätzliche Komponenten vorzubereiten, um bei Bedarf einen einfachen Austausch zu ermöglichen. Schließlich kann nicht genug betont werden, wie wichtig es ist, sicherzustellen, dass sich Sensorkabel nicht überlappen oder übermäßig biegen. Dies kann zu zufälligen Fällen einer schlechten Lecherkennung führen, was sich in einer unangemessen niedrigen Lechzahl für eine bestimmte Änderung des Flaschengewichts oder extrem langen Lechdauern (fast 60.000 ms für einen 1-Minuten-Bin) von Minuten oder Stunden zeigt. Nichtsdestotrotz sind kleine Datenverluste in Studien unvermeidlich, die Daten für viele Tiere über 24 Stunden über viele Tage hinweg entweder mit dem Standard- oder dem mit Lickometern ausgestatteten Ansatz sammeln. Forscher können fehlerhafte Daten für die seltenen Trinksitzungen ausschließen, bei denen das Flaschengewicht und/oder die Lecksteine eindeutig nicht die Aufnahme widerspiegeln (z. B. Verstopfung des Schlucks, Kalibrierungsfehler usw.). In solchen Fällen kann der während der Datenanalyse fehlende Wert für ein bestimmtes Maß (z. B. Aufnahme (g/kg), Lecken usw.) über den Studienzeitraum für diesen bestimmten Probanden durch den fehlenden Wert ersetzt werden. ANOVA mit gemischten Effekten kann auch als Alternative verwendet werden, um fehlende Datenpunkte auszugleichen.

Einer der Vorteile des Paradigmas des Trinkens mit zwei Flaschen ist der freiwillige Aspekt der Ethanolaufnahme. Dies bietet eine ausgezeichnete Gesichtsvalidität, insbesondere im Lichte der Befunde, die zeigen, dass von Experimentatoren verabreichter Alkohol signifikant unterschiedliche Auswirkungen auf die Gehirnfunktion und das Verhalten haben kann als freiwillig selbst verabreichter Alkohol⁴². Darüber hinaus ermöglicht die Freiwilligkeit des Paradigmas den Forschern, individuelle Unterschiede in der Aufnahme zu erfassen, ähnlich wie die Variabilität der Alkoholpräferenz und der Trinkmuster, die beim Menschen beobachtet wird. Diese individuellen Unterschiede können den Forschern eine gute Gelegenheit bieten, den Konsum (Konsum und/oder Muster) mit dem Ausmaß der beobachteten pathologischen Effekte zu korrelieren.

Nichtsdestotrotz sollten einige Einschränkungen des Paradigmas des Trinkens von Zwei-Flaschen-Heimkäfigen berücksichtigt werden. Obwohl beispielsweise die individuelle Variabilität der Ethanolaufnahme für einige Versuche vorteilhaft sein kann, kann sie in anderen Experimenten, bei denen ein gleichbleibendes Maß an Intoxikation oder Ethanolexposition wünschenswert sein kann, ein Nachteil sein. Dies gilt insbesondere für Experimente, die die Folgen der Abhängigkeit und des Entzugs von chronischer Ethanolexposition untersuchen. Wichtig ist, dass das Trinken von zwei Flaschen nicht als Abhängigkeitsmodell charakterisiert wird - auch nicht bei Ratten, die über längere Zeiträume Zugang zu Ethanol haben. In Ermangelung von begleitenden Entzugssymptomen sollten Forscher daher vorsichtig sein, wenn sie die Folgen eines längeren Ethanolkonsums als Auswirkungen von Abhängigkeit und/oder Entzug interpretieren. In der Tat ist es möglich, wenn auch nicht plausibel, dass Ratten, die während des Zwei-Flaschen-Auswahlverfahrens relativ große Mengen Ethanol trinken, Entzugserscheinungen zeigen, dass Ratten, die in einem gegebenen Zeitraum von 24 Stunden geringere Gesamtmengen trinken, keine ähnlichen Anzeichen von Abhängigkeit zeigen. Auch das Trinkverhalten kann bei dieser Überlegung eine wichtige Rolle spielen, da zwei Tiere, die über einen Zeitraum von 24 Stunden die gleiche Menge trinken, je nach Muster ihrer Ethanolaufnahme sehr unterschiedliche Vergiftungsgrade (d. h. BEC) erfahren können²². Dies unterstreicht den Nutzen von LIQ HDR bei der Auswahl von zwei Flaschen, da es Ratten, die eine bestimmte Dosis Ethanol schnell konsumieren (d. h. Schlucken), im Vergleich zu solchen, die die gleiche Dosis viel langsamer konsumieren (d. h. Schluck), leicht identifizieren kann. Obwohl dies für Studien, die die Auswirkungen einer kontrollierten Dosis Ethanol untersuchen, möglicherweise unerwünscht ist, hat die Erkennung von Veränderungen des Trinkverhaltens (z. B. reduzierte Essattacken) nach einer bestimmten experimentellen Intervention angesichts des Ansatzes zur Schadensminimierung, der in der Klinik zunehmend verfolgt wird, einen signifikanten translationalen Wert. Schließlich ist kein Aufwand erforderlich, um für Tiere Zugang zu Ethanol in Käfighaltungsparadigmen zu erhalten, einschließlich des hier beschriebenen. Daher beschränkt sich der Nutzen dieses Paradigmas auf die alleinige Analyse des Alkoholkonsums, während operante Methoden in Fällen bevorzugt werden, in denen Forscher daran interessiert sind, die Alkoholsucht zu untersuchen - ein wichtiges Merkmal der AUD.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll den Forschern alle Informationen und Ressourcen zur Verfügung stellt, die zur Messung der Ethanolaufnahme bei Ratten in Heimkäfigen erforderlich sind. Wir stellen Optionen für relativ niedrig- und hochaufgelöste Ansätze vor, die den Forschern die Flexibilität geben, die Methode zu wählen, die für ihre Forschungsbedürfnisse am besten geeignet ist.

Offenlegungen

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Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Joseph Pitock und Katie Przybysz, PhD für die technische Unterstützung während der Entwicklung von LIQ HDR. Wir danken auch Nicholas Petersen und Marie Doyle, PhD für viele hilfreiche Gespräche während der Entwicklung von LIQ HDR. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism an den National Institutes of Health (P50 AA022538 und R01 AA029130 zur EJG).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kommerziell erhältliche Komponenten			Menge
12-Tasten kapazitiver Touch-Sensor-Breakout (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-polige Kabel passendes Paar (JST XH 2,5 mm Raster)	Adafruit	4872	18
4-polige Steckbrett-Jumper (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
4-poliges Kabel (100 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
4-poliges Kabel (50 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
5V-zu-3V Level-Shifter Breakout	Adafruit	5637	1
Kapazitives Touch-Shield (2,8 Zoll)	Adafruit	1947	1
Kupfer-Leitband (1/4 Zoll)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND
1 Daten Protokollierungsschild	Adafruit	1141	1
Differential I2C Kommunikation Breakout Kit (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Isolierband	DigiKey	3M156004-ND	1
Schrumpfschlauch (3/16Zoll verschiedene Farben)	Kabelbinder und mehr	HS357-S10	6
Schrumpfschlauch Kit (4Zoll schwarz)	Jameco	2095963	1
Lithium-Knopfbatterie (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
M5 Unterlegscheibe	Grainger	54FN66	1
M5 Sechskantmutter	Grainger	6CA72	1
M5 Maschinenschraube (12mm)	Grainger	6GU88	1
M5 Maschinenschraube (25mm)	Grainger	6GU91	2
Stecker/Stecker Überbrückungskabel	Adafruit	1957	1
Mikrocontroller Board (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
PETG Filament (2.85mm silber)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
PLA Filament (2.85mm schwarz)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
PLA Filament (2.85mm silber)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Netzteil (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
SD/microSD Speicherkarte (8GB)	Adafruit	1294	1
Shield Stacking	Header Adafruit	85	1
Solid-Core-Kabel (22AWG rot)	Adafruit	288	1
Litzenkabel (22AWG schwarz)	Adafruit	2976	1
Litzendraht (22AWG rot)	Adafruit	3068	1
Twist Cap Sipper-Röhre mit Kugel	Alternatives Design	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Wasserflasche (8oz)	Alternatives Design	WB8FS	38
Custom 3D-gedruckte Komponenten			Menge
3D-gedruckter Arduino-Gehäuseboden	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
3D-gedruckte Arduino-Gehäuseplatte	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
3D-gedruckter Kabelclip L	N/A	CLIP_L.stl	18
3D-gedruckte Kabelclip-Mutter	N/A	CLIP_Nut.stl	18
3D-gedruckter Kabelclip R	N/A	CLIP_R.stl	18
3D-gedruckter Lickometer-Flaschenhalter	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
3D-gedruckte Lickometer-Kabelbrücke L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
3D-gedruckte Lickometer-Kabelbrücke R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
3D-gedruckte Lickometer-Buchstaben	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
3D-gedruckte Befestigungsschraube	N/A	Befestigungsschraube.stl	4
3D-gedrucktes Sensorgehäuse A unten	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse A oben	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse B unten	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse B oben	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse C unten	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse Buchstaben	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
3D-gedruckter Sipper-Blocker	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
3D-gedruckter Sipper-Blocker-Sockel	N/A	SIPPER_Base.stl	18
3D-gedruckter Sipper-Blocker-Getriebe	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
3D-gedruckte Sipperblocker-Mutter	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
3D-gedruckte Sipperblocker-Schnecke	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Lasergeschnittene Lickometer-Acrylplatte	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

Referenzen

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Alkoholverbrauch bei Nagetieren Trinkmikrostruktur Lickometer System Ethanolaufnahme bei Ratten Trinkmuster Blutethanolkonzentration binge hnliches Trinken

Modellierung des Alkoholkonsums bei Nagetieren unter Verwendung von Zwei-Flaschen-Choice-Käfigtrinken zu Hause und Mikrostrukturanalyse

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