Modellierung des Alkoholkonsums bei Nagetieren unter Verwendung von Zwei-Flaschen-Choice-Käfigtrinken zu Hause und Mikrostrukturanalyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein standardmäßiges Paradigma für das Trinken von Käfigen mit intermittierendem Zugang zu zwei Flaschen, um den Alkoholkonsum bei Ratten zu modellieren. Darüber hinaus bietet es eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um das Standardprotokoll um ein DIY-Leckerkennungssystem zu erweitern, das eine mikrostrukturelle Analyse des Trinkverhaltens ermöglicht.

Zusammenfassung

Das Trinken von Käfigen mit zwei Flaschen zu Hause ist eines der am weitesten verbreiteten Paradigmen, um den Ethanolverbrauch bei Nagetieren zu untersuchen. In der einfachsten Form erhalten die Tiere Zugang zu zwei Trinkflaschen, von denen eine normales Leitungswasser und die andere Ethanol enthält, wobei die tägliche Aufnahme anhand der Veränderung des Flaschengewichts über einen Zeitraum von 24 Stunden gemessen wird. Folglich ist für diesen Ansatz keine spezielle Laborausrüstung erforderlich. Während eine solche einfache Implementierung wahrscheinlich den größten Beitrag zu seiner weit verbreiteten Akzeptanz durch präklinische Alkoholforscher leistet, ist die Auflösung der mit diesem Ansatz gewonnenen Trinkdaten durch die Anzahl der Messungen des Flaschengewichts durch den Forscher (z. B. einmal täglich) begrenzt. Der Wunsch, das Trinkverhalten im Kontext der Gesamtaufnahme, pharmakologischer Interventionen und neuronaler Manipulationen zu untersuchen, hat jedoch zur Entwicklung von Systemen zur Erkennung von Käfiglecken zu Hause geführt, die Daten auf der Ebene einzelner Lecks erfassen können. Obwohl eine Reihe dieser Systeme erst kürzlich entwickelt wurden, hat das Open-Source-System LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Benutzerfreundlichkeit in der Praxis große Aufmerksamkeit erregt. Obwohl dieses System spannend ist, wurde es für den Einsatz bei Mäusen entwickelt. Hier überprüfen wir geeignete Verfahren für das Trinken von Standard- und mit Leckometern ausgestatteten Zwei-Flaschen-Auswahlkäfigen für zu Hause. Wir stellen auch Methoden zur Anpassung des LIQ HD-Systems an Ratten vor, einschließlich Hardware-Modifikationen für größere Käfiggrößen und einen neu gestalteten 3D-gedruckten Flaschenhalter, der mit handelsüblichen Trinkflaschen kompatibel ist. Mit diesem Ansatz können die Forscher das tägliche Trinkverhalten zusätzlich zu den Aufnahmemengen bei vielen Ratten parallel untersuchen und so die Auflösung der gewonnenen Daten mit minimalem Aufwand an zusätzlichen Ressourcen erhöhen. Diese Methoden geben den Forschern die Flexibilität, entweder Standardflaschen oder ein mit einem Lickometer ausgestattetes Gerät zu verwenden, um die neurobiologischen Mechanismen zu untersuchen, die dem Alkoholkonsum zugrunde liegen, je nach ihren genauen experimentellen Bedürfnissen.

Einleitung

Obwohl mäßiger Alkoholkonsum in der Vergangenheit mit mäßigen gesundheitlichen Vorteilen in Verbindung gebracht wurde, haben neuere groß angelegte umfassende Studien gezeigt, dass keine Menge Alkoholkonsum sicher ist^1,2. Tatsächlich ist Alkoholkonsum weltweit der siebthäufigste Risikofaktor für Tod und Behinderung¹, wobei Personen, die auch nur kleine Mengen Alkohol trinken, ein erhöhtes Risiko für Krebs, Infektionskrankheiten und Verletzungen haben^1,3. In den Vereinigten Staaten sind die Todesfälle durch Alkoholkonsum zwischen 2016 und 2021 um fast 30 % gestiegen⁴. Wichtig ist, dass das Risiko von Tod und Invalidität mit zunehmendem Verbrauch monoton zunimmt¹.

Obwohl Studien am Menschen wertvolle Einblicke in die Neurobiologie von Alkoholkonsum und -missbrauch geliefert haben, ist die experimentelle Kontrolle durch Tiermodelle entscheidend für ein tiefgreifendes Verständnis der Mechanismen, die dem Trinkverhalten und dem Risiko für starken Alkoholkonsum zugrunde liegen. Diese Modelle sind auch wertvolle Instrumente für die Entwicklung von Behandlungen, die darauf abzielen, den unkontrollierten Konsum zu reduzieren. Das Trinken von Zwei-Flaschen-Käfigen zu Hause ist eines der am weitesten verbreiteten präklinischen Paradigmen zur Untersuchung des Alkoholkonsums bei Nagetieren. Dies ist zum großen Teil auf die einfache Implementierung zurückzuführen, da es die Messung des gesamten freiwilligen Alkoholkonsums und der Präferenz ermöglicht, ohne dass spezielle Forschungsgeräte oder komplexe Analysen erforderlich sind. Mit diesem Ansatz können Forscher Messungen in den gewünschten Intervallen (z. B. Stunden, Tage, Wochen) durchführen, indem sie die Veränderung des Flaschengewichts vom Anfang bis zum Ende einer Trinksitzung berechnen. Variationen dieser grundlegenden Methode wurden von vielen in der Branche verwendet, um einen niedrigen bis mäßigen bis übermäßigen Alkoholkonsum sowohl über kurze als auch über lange Zeiträume zu erleichtern. Zum Beispiel wurden kontinuierliche und intermittierende Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren verwendet, um sowohl bei mäusen^{5 als auch bei rats<}sup class="xref">6^{,7,8 einen niedrigen bzw. moderaten Alkoholkonsum zu ermöglichen}. Die gleichen Paradigmen können einen hohen Konsum bei alkoholbevorzugten Stämmen fördern^7,9. Alternativ hat sich gezeigt, dass eine Anpassung dieser Methode, die den Zugang zu Alkohol auf 2-4 Stunden täglich begrenzt, beginnend etwa 3 Stunden nach Beginn des Dunkelzyklus, bei Mäusen zu Rauschtrinken führt (d. h. Trinken im Dunkeln)^10,11. Zusätzliche Variationen dieser Methoden wurden in Verbindung mit Methoden verwendet, die die Alkoholabhängigkeit erleichtern (d. h. chronische intermittierende Exposition gegenüber Ethanoldampf), um die Eskalation des freiwilligen Alkoholkonsums während des Entzugs zu untersuchen^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Obwohl in der Praxis weit verbreitet, ist der Standardansatz zur Messung des Alkoholkonsums durch Änderung des Flaschengewichts in seiner Auflösung auf den Gesamtverbrauch pro Trinksitzung beschränkt. Folglich ist dieser Ansatz nicht in der Lage, Trinkmuster zu erfassen, von denen bekannt ist, dass sie sich sowohl auf das Risiko als auch auf den Schweregrad der Alkoholkonsumstörung (AUD) auswirken^20,21,22. In der Tat kann der durchschnittliche Konsum einer Person im Laufe der Zeit eine Folge mehrerer starker Trinkepisoden oder vieler Trinkepisoden sein, die jeweils mit einem relativ geringen Konsum verbunden sind, und diese Nuancen bleiben unentdeckt, wenn der Konsum als Gesamtaufnahme pro Trinksitzung gemessen wird. Wichtig ist, dass signifikant mehr Trinkepisoden im Zusammenhang mit großen Trinkattacken (d.h. Schlucken) bei Individuen mit AUD im Vergleich zu gesunden Kontrollen beobachtet werden²³ und Daten an nichtmenschlichen Primaten deuten darauf hin, dass Individuen, die früh in ihrer Trinkgeschichte ein Alkoholkonsummuster etablieren, das große Trinkanfälle beinhaltet, ein signifikantes Risiko für AUD²² haben. Darüber hinaus erhöhen Trinkepisoden, die große Konsumeinheiten beinhalten, das Risiko für Morbidität und Mortalität unabhängig von der AUD-Diagnose²¹. Insgesamt haben diese Daten zu einem erhöhten Interesse an der Untersuchung von Trinkmustern zusätzlich zu den Werten der Gesamtaufnahme in präklinischen Modellen geführt und die Entwicklung einer Reihe von Systemen unterschiedlicher Komplexität veranlasst, die in der Lage sind, Trinkdaten auf der Ebene einzelner Lecks zu erfassen.

Zu den ersten gehörte die Entwicklung eines Zwei-Flaschen-Systems mit Fotostrahl-Leckerkennung, das für den Einsatz bei Mäusen entwickelt wurde²⁴. Dieses System wurde anschließend von einer separaten Gruppe für die Verwendung in rats^{25 angepasst}. In den folgenden Jahren wurden Variationen dieses Themas verwendet, um ähnliche Systeme zu entwickeln, die in benutzerdefinierten Nagetierhaltungssystemen enthalten sind²⁶, die die Leckerkennung einzelner sozial untergebrachter Tiere ermöglichen^27,28, und die sowohl das Fress- als auch das Trinkverhalten erfassen²⁹. Unter diesen hat LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ große Aufmerksamkeit erregt, weil es ein System für den Einsatz in Mäusen anbietet, das der einfachen Implementierung und Erschwinglichkeit des von Godnyuck et al. entwickelten Systems entspricht²⁴. Dieses System verwendet kapazitive Sensorik, um den Kontakt zwischen der Zunge und der leitfähigen Metall-Sipper-Röhre direkt zu erkennen, im Gegensatz zu indirekten Messungen wie Sipper-Annäherung oder Interaktion, die mit dem Photobeam-Detection-System ermöglicht werden. Die Autoren liefern Daten, die zeigen, dass ihr kapazitives Sensorsystem eine deutlich höhere Präzision und Empfindlichkeit bei der Lecksteindetektion bietet und stärkere Korrelationen zwischen der Leckenzahl und der Änderung des Flaschengewichts als die Photostrahldetektion erzeugt. Die Autoren demonstrieren ferner die Fähigkeit, dieses System in Verbindung mit einem Paradigma für das Trinken von Heimkäfigen mit kontinuierlichem Zugang zu verwenden, um zusätzlich zu den Messungen der täglichen Gesamtaufnahme Messungen der Mikrostruktur des Alkoholkonsums zu erfassen³⁰.

Hier beschreiben wir Verfahren für den Alkoholkonsum in Zwei-Flaschen-Käfigen mit einem Standardansatz sowie Methoden, die eine Leckenerkennung ermöglichen (Abbildung 1). Wir stellen auch Methoden zum Erstellen und Implementieren von LIQ HDR vor - eine Anpassung von LIQ HD³⁰ für den Einsatz bei Ratten, die Hardware-Modifikationen für größere Käfiggrößen und einen neu gestalteten 3D-gedruckten Flaschenhalter umfasst, der mit Standardflaschen von der Stange kompatibel ist. Diese Methoden bieten den Forschern die Flexibilität, je nach ihren experimentellen Ressourcen und Datenerhebungsanforderungen entweder einen Standard- oder einen mit einem Lickometer ausgestatteten Ansatz zu verwenden.

Nachfolgend finden Sie eine Beschreibung der benötigten Materialien und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Erfassen des Käfigtrinkens zu Hause mit dem intermittierenden Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren, angepasst von Simms et al.⁷. Bei diesem Verfahren erhalten Ratten 24 h Zugang zu zwei Trinkflaschen an 7 Tagen in der Woche. Montags, mittwochs und freitags (MWF) erhalten Ratten eine Flasche mit Wasser (H₂O) und eine weitere Flasche mit Ethanol (EtOH). Diese Flaschen werden dienstags, donnerstags und samstags (TRS) entfernt und durch zwei Flaschen Wasser ersetzt. Ratten trinken samstags und sonntags aus den gleichen zwei Flaschen Wasser. Beachten Sie, dass diese Methoden bei Bedarf leicht für alternative Zeitpläne des Ethanolzugriffs (z. B. kontinuierlich, Binge, etc.) angepasst werden können. Für Standard- und mit Lickometern ausgestattete Ansätze werden separate Anweisungen bereitgestellt.

Protokoll

Alle repräsentativen Daten wurden an einzeln gehaltenen erwachsenen Long-Evans-Ratten unter Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Illinois Chicago und gemäß den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Laboratoriumstieren erhoben. Die Einzelhaltung ist erforderlich, um den Flüssigkeitskonsum jedes einzelnen Tieres genau überwachen zu können. Erwachsene männliche (n = 38) und weibliche (n = 22) Long-Evans-Ratten befanden sich beim Eintreffen im Alter P50–80 und erhielten eine Woche lang Zeit, sich im Tierhaltungsraum einzuleben, bevor das Experiment begann. Die Ratten hatten ad libitum Zugang zu Standardfutter (Teklad 7912, Envigo) und Wasser, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung vor dem Experiment

1. Beschriften Sie Trinkflaschen als H₂O oder EtOH. Anschließend kennzeichnen Sie je eine H₂O- und eine EtOH-Flasche mit einer eindeutigen Identifikationsnummer pro Ratte für MWF sowie zwei H₂O-Flaschen für TRS.
   HINWEIS: Optional können verschiedene Farbbänder verwendet werden, um H₂O- und EtOH-Flaschen zu unterscheiden, um mögliche Fehler beim Flaschenwechsel zu vermeiden.
2. Füllen Sie die H₂O-Flaschen einen Tag vor Versuchsbeginn mit Trinkwasser. Bereiten Sie die EtOH-Lösung einen Tag vor Versuchsbeginn durch Mischen von 190 Proof EtOH mit Trinkwasser (20 % v/v) vor.
   ACHTUNG: Es ist entscheidend, dass nicht denaturierter EtOH verwendet wird, da denaturierter EtOH giftig ist.
3. Bereiten Sie einen leeren Käfig auf demselben Regal wie die an dem Versuch teilnehmenden Ratten vor. Dieser Käfig wird zur Berechnung von Verschüttungen verwendet.
4. Rüsten Sie die Käfige mit dem LIQ HDR-System aus, falls verwendet (siehe Schritt 3, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6 und ergänzende Abbildung 1).
5. Legen Sie vor Studienbeginn den genauen Tageszeitpunkt für den Flaschenwechsel fest. Die Flaschen sollten jeden Tag zur gleichen Zeit ausgetauscht werden, um eine genaue Messung der 24-Stunden-Aufnahme zu gewährleisten.
   HINWEIS: Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Nagetiere unmittelbar nach Beginn der Dunkelphase den höchsten Konsum zeigen^10,31. Um die Aufnahme während dieser besonders aktiven Phase zu erfassen (siehe Schritt 2.3.1 zur Erfassung von bingegleichen Trinkverhalten), wird empfohlen, den Flaschenwechsel 30–60 Minuten nach dem Ausschalten des Lichts durchzuführen. Verwenden Sie rote Lampen beim Flaschenwechsel, um eine Sichtbarmachung ohne Störung des Licht-Dunkel-Zyklus zu ermöglichen.

2. Tägliche Verfahren und Wartung

1. Am ersten Tag des Experiments folgende Schritte durchführen:
   1. Entfernen Sie die Standardwasserflaschen aus den Käfigen.
   2. Optional: Ratten stoßen oft gegen den Käfigdeckel, während sie nach Futter suchen, was zu Verschütten führen kann, das im leeren Verschüttungskäfig nicht korrigiert werden kann. Die Verwendung von Futterbechern im Käfig kann dieses Problem verringern. Falls verwendet, entfernen Sie das Futter vom Käfigdeckel, fügen Sie einen Futterbecher im Käfig hinzu und füllen Sie ihn mit Futter. Stellen Sie sicher, dass der verfügbare Bodenplatz für die Ratte weiterhin den institutionellen Richtlinien entspricht, basierend auf der Größe des Rattenkäfigs und der Größe des Futterbechers.
   3. Weisen Sie das Pflege- und Tierhaltungspersonal entsprechend darauf hin, dass das Forschungspersonal für die Dauer des Experiments Futter und Wasser bereitstellt.
   4. Käfigwechsel können die Datenerfassung stören. Führen Sie Käfigwechsel gleichzeitig mit der Bestimmung der Körpergewichtsmessungen durch. Forscher, die dies tun möchten, sollten ihr Pflege- und Tierhaltungspersonal entsprechend informieren.
2. An den folgenden Tagen die unten beschriebenen Verfahren befolgen.
   ANMERKUNG: Denken Sie daran, dass jede Bewegung von Käfigen und Flaschen zu Verschütten führen kann. Daher ist es wichtig, vorsichtig bei Bewegungen vorzugehen und dieselben Methoden zum Anbringen und Entfernen der Flaschen am Verschüttungskäfig anzuwenden wie bei den Rattenkäfigen.
   1. Betreten Sie den Raum vor dem Zeitpunkt des Flaschenwechsels, stellen Sie sicher, dass genügend Zeit zur Durchführung der unten aufgeführten Schritte zur Verfügung steht, und stellen Sie neue Flaschen zum entsprechenden Beginn der Sitzung auf die Käfige.
   2. Entfernen Sie die Filterdeckel von den Käfigen. Falls MWF, fahren Sie mit Schritt 2.2.3 fort. Falls TRS, fahren Sie mit Schritt 2.2.4 fort.
   3. Am Montag, Mittwoch und Freitag TRS-Flaschen von den Käfigdeckeln entfernen. MWF-Flaschen wiegen (eine EtOH- und eine H₂O-Flasche). Notieren Sie das Startgewicht der Flasche für die heutige Trinksitzung. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Futter auf den Käfigdeckel oder in die Futterbecher. Zum festgelegten Sitzungsbeginn Flaschen auf den Käfigdeckel jeder Ratte stellen, wobei das Klebeband nach oben zeigt, damit die Ratten das Flaschenetikett nicht anknabbern.
      ANMERKUNG: Normalerweise wird der Wasserkonsum bei TRS nicht erfasst oder berichtet, aber Forscher können diese Daten optional sammeln, indem sie die Gewichte beim Anbringen und Entfernen der Flaschen wie in Schritt 2.2.3 und Schritt 2.2.4 beschrieben ermitteln, falls gewünscht. Die Seite für die EtOH-Flasche sollte nach jeder Trinksitzung gewechselt werden, um die Entwicklung einer möglichen Seitenvorliebe zu vermeiden, die die Konsumdaten unbeabsichtigt verfälschen könnte.
      1. Optional: Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass viele Ratten zu Beginn der Trinksitzung ein binges-ähnliches Trinkverhalten zeigen^8,32,33. Die meisten Forscher, die das Binge-Trinken während dieser Zeit erfassen, berichten über die Aufnahme in den ersten 30–60 Minuten der Trinksitzung. Um Aufnahmedaten während dieses möglichen Binge-Ereignisses zu erhalten, folgen Sie den unten beschriebenen Schritten.
      2. Stellen Sie nach dem Anbringen der Flaschen am letzten Käfig einen Timer. Verlassen Sie den Raum während des Zeitraums ungestört.
      3. Betreten Sie den Raum erneut, wenn der Timer ertönt. Entfernen Sie die EtOH- und H₂O-Flaschen und notieren Sie deren Gewichte. Bringen Sie die EtOH- und H₂O-Flaschen wieder an den Käfigen an.
         ANMERKUNG: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, um Binge-Episoden zu erfassen, wenn ein System zur Erfassung von Leckbewegungen verwendet wird.
   4. Am Dienstag, Donnerstag und Samstag MWF-Flaschen zum festgelegten Sitzungsende, entsprechend 24 Stunden nach dem Start, von den Käfigen entfernen. Jede Flasche wiegen und das Endgewicht für die MWF-Trinksitzung notieren. Bestimmen und notieren Sie das Körpergewicht jeder Ratte. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Futter auf den Käfigdeckel oder in die Futterbecher. Stellen Sie TRS-H₂O-Flaschen auf den Käfigdeckel jeder Ratte, wobei das Klebeband nach oben zeigt, damit die Ratten das Flaschenetikett nicht anknabbern.
   5. Setzen Sie die Filterdeckel wieder auf die Käfige und verlassen Sie den Tierhaltungsraum.
      ANMERKUNG: Optional können die Säugel der EtOH-Flaschen abgedeckt werden, um Verdunstung zu verhindern. Falls Käfigwechsel durch das Forschungspersonal durchgeführt werden, legen Sie einen Tag pro Woche während der TRS-Aufgaben fest, um diese Aufgabe durchzuführen. Setzen Sie jede Ratte nach der Bestimmung des Körpergewichts in einen sauberen Käfig.
3. Reinigen Sie die Flaschen und erneuern Sie die Flüssigkeiten regelmäßig wöchentlich oder zweiwöchentlich gemäß den Richtlinien der Institution für Tierpflege und -haltung. Achten Sie darauf, diese Aufgaben so durchzuführen, dass die Trinksitzungen nicht unterbrochen werden. Beispielsweise können TRS-H₂O-Flaschen nach dem Entfernen an MWF-Tagen gereinigt und neu befüllt werden. Ebenso können MWF-H₂O- und EtOH-Flaschen nach dem Entfernen an TRS-Tagen gereinigt und neu befüllt werden.

3. Erkennung von Leckbewegungen während Zwei-Flaschen-Wahl-Experimente

HINWEIS: Forscher, die hochauflösende Trinkdaten erfassen möchten, können das oben beschriebene Verfahren erweitern, indem sie Leck-Detektionsfunktionen an den Flaschen hinzufügen. LIQ HD³⁰ ist ein kostengünstiges, selbst zusammenstellbares (DIY) System, das eine solche Datenerfassung bei Mäusen ermöglicht. Die unten beschriebenen Verfahren erläutern die erforderlichen Modifikationen, um LIQ HD für Ratten anzupassen (bezeichnet als LIQ HDR). Eine Liste aller kommerziell erhältlichen und individuell 3D-gedruckten Teile, die zum Aufbau eines Leck-Detektionssystems benötigt werden – das Daten aus einer Zwei-Flaschen-Wahl für bis zu 18 Ratten erfassen kann –, finden Sie in der Materialtabelle. Die 3D-Druckdateien im .stl-Format sowie die Anleitungen sind auf der Website des Autors verfügbar (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Einrichten kapazitiver Sensoreinheiten
   HINWEIS: Jedes LIQ HDR-System besteht aus drei kapazitiven Sensoreinheiten, die zusammen Lickdaten von 36 Flaschen parallel erfassen, was 18 einzeln gehaltenen Ratten entspricht. Jede Sensoreinheit besteht aus einem differentiellen I²C-Kommunikations-Breakout-Board und ein 12-Tasten-Kapazitivsensor-Board, das über sechs farbcodierte, je zweipolige Kabelpaare mit den Lickometern aus sechs separaten Käfigen verbunden wird (Abbildung 2A).
   1. Sammeln Sie die Materialien, die zum Bau aller drei kapazitiven Sensoreinheiten benötigt werden, wie in Abbildung 2Bsowie die erforderlichen Lötwerkzeuge.
   2. Um mit dem Aufbau der Sensoreinheit A zu beginnen, überziehen Sie ein 2-poliges weibliches Steckverbinderkabel mit einem 18 cm langen, roten Schrumpfschlauch, und führen die rote und schwarze Drahtenden in Pin #0 bzw. #1 auf der Sensorplatine einAbbildung 2C-1) und an der Stelle verlöten (Abbildung 2C-2). Achten Sie darauf, dass sich das Kabel vorne an der Sensorplatine befindet, wie gezeigt, um die Käfige im Vivarium von links nach rechts in numerischer Reihenfolge anordnen zu können, ohne dass sich die Kabel überlappen und die Aufzeichnung möglicherweise gestört wird (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6).
   3. Decken Sie fünf weitere Kabel mit farblich unterschiedlichem Schrumpfschlauch ab und löten Sie sie an die Pins #2–11 an, wie gezeigt (Abbildung 2C-3). Stellen Sie sicher, dass alle roten Drähte mit den geraden Pins verlötet sind, die mit allen Flaschen auf der linken Seite verbunden werden, und alle schwarzen Drähte mit den ungeraden Pins verlötet sind, die mit allen Flaschen auf der rechten Seite verbunden werden.
   4. Decken Sie die Lötstellen auf allen Seiten zum Schutz mit Heißkleber ab (Abbildung 2C-4). Beschriften Sie die Anschlüsse in numerischer Reihenfolge und weisen Sie jedem Lickometer eine eindeutige Kennnummer zu (Abbildung 2C-4).
   5. Um die Sensoreinheit A zusammenzubauen, verbinden Sie die Sensorplatine A mit einem Kommunikations-Breakout-EndPoint über ein 50 mm langes 4-poliges Kabel und anschließend den EndPoint mit dem 3,3-V-Ausgang des 5-V-auf-3-V-Spannungslevelshifter über ein 100 mm langes 4-poliges Kabel (Abbildung 2D-1). Obwohl sowohl die Sensorplatine als auch die Kommunikations-Interface-Platine jeweils über zwei identische 4-polige Anschlüsse verfügen, ist es dennoch wichtig sicherzustellen, dass die Verkabelung genau wie dargestellt erfolgt (Abbildung 2D-1 und Abbildung 2F) um die 3D-gedruckten Sensorgehäuse und den vorgeschlagenen Vivarienaufbau verwenden zu können (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6). Hauptsensor-Einheit A in der 3D-gedruckten Gehäuseabdeckung (Abbildung 2D-2). Schließen Sie die Abdeckung vorsichtig, und achten Sie darauf, das Kabel des Pegelwandlers nicht zu beschädigen (Abbildung 2D-3).
   6. Modifizieren Sie das I²C-Adressen der Sensorplatinen B und C, indem ein Jumperdraht gemäß Angabe vom ADDR-Pin zum 3Vo- oder SDA-Pin gelötet wird, wie angegeben (Abbildung 2E).
   7. Löten Sie sechs farbkodierte Buchsenkabel an die Sensorplatinen B und C in der gleichen Reihenfolge wie bei Platine A. Beschriften Sie jeden Anschluss mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer. Verbinden Sie Platine B mit dem Kommunikations-Breakout-MidPoint und C mit einem EndPoint mithilfe von 50 mm langen 4-poligen Kabeln (Abbildung 2F).
   8. Bringen Sie die Hauseinheitssensoren B und C in ihren jeweiligen 3D-gedruckten Gehäusen unter. Verbinden Sie alle drei Sensoreinheiten sternförmig über Ethernet-Kabel, um den Sensoraufbau abzuschließen (Abbildung 2G).
2. Einrichten der Mikrocontroller-Schnittstelle
   HINWEIS: Die LIQ HDR-Mikrocontroller-Schnittstelle (Zusatzabbildung 1A) ist identisch mit der für LIQ HD beschriebenen³⁰ mit sehr geringfügigen Modifikationen. Die nachstehend beschriebenen Verfahren liefern einen allgemeinen Überblick über die erforderlichen Schritte zur Einrichtung der Schnittstelle, wobei die in den Schritten 3.2.6 und 3.2.8 beschriebenen Modifikationen berücksichtigt werden. Detailliertere, Schritt-für-Schritt-Anleitungen finden Forschende im Originalprotokoll und im Video-Tutorial auf der GitHub-Seite des Autors.³⁰.
   1. Sammeln Sie die Materialien und Lötwerkzeuge, die zum Aufbau der Mikrocontroller-Schnittstelle benötigt werden (Zusatzabbildung 1B). Auf der Rückseite des Touch-Schilds (Zusatzabbildung 1C-1), erstellen Sie eine Lötbrücke über die Lötflächen auf der Rückseite der Leuchtplatte (Zusatzabbildung 1C-2).
   2. Auf der Rückseite des Data-Logging-Shields durchtrennen Sie die Jumper-Pad-Leiterbahn des CS-Pins (Zusatzabbildung 1D-1). Auf der Vorderseite des Datenloggers eine kurze Jumperbrücke von der CS-Buchse mit Pin #7 verlöten (Zusatzabbildung 1D-2).
   3. Zur Montage der Shield-Stacking-Header stapeln Sie diese zunächst auf die Rückseite des Touchscreen-ShieldsZusatzabbildung 1E-1). Stapeln Sie den Datenlogger auf dem Touchscreen, befestigen Sie ihn mit Klebeband und verlöten Sie alle Stiftleisten mit dem Datenlogger (Zusatzabbildung 1E-2). Anschließend das Touchscreen-Display entfernen.
   4. Den verbleibenden 2 x 3-Header zum Mikrocontroller hinzufügenZusatzabbildung 1F-1), dann das Datenlogger-Modul auf den Mikrocontroller stecken, bevor die Stiftleisten an Ort und Stelle gelötet werden (Zusatzabbildung 1F-2).
   5. Setzen Sie die Knopfbatterie in das Datenlogger-Gerät ein (Zusatzabbildung 1G-1). Platziere das Touchscreen-Gerät auf den Datenlogger (Zusatzabbildung 1G-1). Stecken Sie die microSD-Karte zusammen mit ihrem Adapter in das Datenloggergerät ein (Zusatzabbildung 1G-2).
   6. Um den zusätzlichen Erdungsstrang herzustellen, schneiden Sie einen männlichen Stecker von einem Jumper-Kabel ab und entfernen Sie die Isolierung am Ende auf etwa 1/4 Zoll (Zusatzabbildung 1H-1). Löten Sie einen Strang abisolierten Starrdraht an den Brücken draht und überziehen Sie die Lötstelle mit Schrumpfschlauch (Zusatzabbildung 1H-2).
   7. Stecken Sie die 4-poligen Jumperkabel und den zusätzlichen Erdungsdraht in den Mikrocontroller (Schwarz – GND, Rot – 5 V, Gelb – Pin #21, Blau – Pin #20, Zusatzabbildung 1I-1). Sichern Sie die Verbindungen mit Heißkleber (Zusatzabbildung 1I-2). Optional: Umhüllen Sie die Jumperkabel mit Schrumpfschlauch (Zusatzabbildung 1I-2).
   8. Bringen Sie die vollständig montierte Mikrocontroller-Schnittstelle in dem 3D-gedruckten Gehäuse unter, wobei die 4-poligen Jumper-Kabel und der Erdungsdraht durch die Öffnung an der Oberseite geführt werden (Zusatzabbildung 1J).
   9. Befolgen Sie das ursprüngliche Protokoll zur Installation der Mikrocontroller-Schnittstellensoftware³⁰.
3. LIQ-HDR-Lickometer bauen
   HINWEIS: Der individuell angefertigte 3D-Druck, der die Flaschen hält, ist für den Einsatz mit einer standardmäßigen Trinkflasche für Nagetiere mit einem Saugröhrchendurchmesser von 8 mm konzipiert (siehe Materialienübersicht Abbildung 3A). Diese Flaschenhalterung kann problemlos für den Einsatz mit ähnlichen Flaschen und Saugtrinkern mit geringen oder ohne Modifikationen angepasst werden.
   1. Sammeln Sie die Materialien, 3D-Drucke und Lötwerkzeuge, die zum Bau eines Lickometers benötigt werden, wie in Abbildung 3BBeachten Sie, dass jedes LIQ HDR-System maximal 18 Lickometer für 36 Flaschen aufnehmen kann.
   2. Um das Kabel des männlichen Steckverbinders zu verlängern, beide Enden des Kabels sowie die schwarzen und roten Adern des Verlängerungskabels auf einer Länge von etwa 1/4 Zoll abisolieren,Abbildung 3C-1).
   3. Löten Sie die Verlängerungskabel an das Anschlusskabel an (Abbildung 3C-2) und die Lötstellen mit Schrumpfschlauch abdecken (Abbildung 3C-3). Überziehen Sie das männliche Verbindungskabel mit Schrumpfschlauch, der farblich auf das entsprechende weibliche Verbindungskabel an der Sensoreinheit abgestimmt ist (Abbildung 3C-4).
   4. Um konsistent mit der Verkabelung der Sensorplatine zu sein (Abbildung 2), führen Sie den roten und schwarzen Draht jeweils durch die linke und rechte innere Kabeldurchführung des Flaschenhalters (Abbildung 3D-1).
   5. Löten Sie jeden Draht an das äußerste Ende des 1 ¾ Zoll breites leitfähiges Kupferband (Abbildung 3D-2) und falten Sie die Kupferbänder zur HälfteAbbildung 3D-3).
   6. Entfernen Sie die Schutzfolie vom Kupferband und führen Sie es mit einer Pinzette vorsichtig in die Saugvorrichtung ein (Abbildung 3E-1), bevor es fest an den Innenwänden der Trinkschlauchhalterung befestigt wird (Abbildung 3E-2). Achten Sie darauf, dass die Lötseite des Kupferbands an der Wand näher zur Mittellinie des Flaschenhalters haftet, wie angegeben (Abbildung 3E-2). Führen Sie ein Trinkröhrchen durch die Halterung, um das Band fest gegen die Wand zu drücken und die Halterung zu befüllen.
   7. Um die Lötseite des Kupferbandes zu verstärken, die weniger klebfähig ist und dazu neigt, sich abzulösen, einen Klecks Heißkleber auf die Lötstelle auftragenAbbildung 3E-3). Die Klebstoffmasse so verteilen, dass sowohl das Kupferband als auch alle angrenzenden freiliegenden Bereiche des 3D-Drucks bedeckt sind (Abbildung 3E-4).
   8. Führen Sie das Kabel durch den internen Kanal des KabelschutzesAbbildung 3F). Achten Sie darauf, für jeden Lickometer den geeigneten Kabelschutz (für links- oder rechtsseitige Ausrichtung) auszuwählen, um die vorgeschlagene Vivarienanordnung zu verwenden (siehe Schritt 3.6 und Abbildung 6)."HINWEIS: Lickometer 5–6, 11–12 und 17–18, die in der aktuellen Aufbaukonfiguration durch blau- oder lilafarbene Kabel dargestellt sind, benötigen eine nach links gerichtete KabelschutzabdeckungAbbildung 4D-1), während alle anderen Lickometer einen nach rechts zeigenden Kabelschutz benötigen (Abbildung 4D-2).
   9. Um die Kabelhalterung zu montieren, bringen Sie zunächst einen Draht in die Nut einer Hälfte der Kabelhalterung ein (Abbildung 3G-1), dann die andere Hälfte über den zweiten Draht schieben und beide Hälften anschließend mit der Mutter fest verschließen (Abbildung 3G-2).
   10. Beschriften Sie den männlichen Stecker mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer (Abbildung 3H). Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle 18 Lickometer gebaut sind.
4. Installation von LIQ HDR-Lickometern
   HINWEIS: LIQ HDR ist für die Montage auf einem standardmäßigen Schuhkarton-Rattenkäfig mit Metallgitterdeckel konzipiert (Abbildung 4A-1).
   1. Identifizieren Sie zwei Paare von Stäben mit einem Mittelpunkt-zu-Mittelpunkt-Abstand von etwa 75 mm an der oberen Seite des Drahtkäfigs, um den Flaschenhalter aufzunehmen. Verwenden Sie eine Zange, um die Metallstäbe um die Saugröhrchen-Öffnungen leicht zu weiten. Isolieren Sie diese Stäbe mit Isolierband, um einen metallischen Kontakt zwischen den Saugröhrchen und der Käfigoberseite zu verhindern.Abbildung 4A-2).
      HINWEIS: Obwohl das Isolierband für Ratten nicht zugänglich und daher nicht anfällig für Anknabbern ist, empfehlen wir, es am Ende der Studie zu entsorgen und zwischen Studien nicht wiederverwenden.
   2. Befestigen Sie das Lickometer und die 3,2 mm dicke Laser-Acrylplatte mit zwei Sätzen M5-Schrauben und -muttern an der Käfigabdeckung (Abbildung 4B). Stellen Sie sicher, dass die Saugöffnungen am Lickometer und an der Acrylplatte ausgerichtet sind und dass die Saugröhrchen keinen Kontakt mit irgendwelchen Teilen des Käfigdeckels haben.
   3. Befestigen Sie die Kabelhalterung an der äußersten Stange (~4 mm Durchmesser) der Drahtkäfigabdeckung (Abbildung 4C). Stellen Sie den Kabelclip gegebenenfalls so ein, dass der Käfigdeckel fest auf dem Käfigboden aufliegt und das Kabel nicht unter zu großer Zug- oder Biegebelastung steht. Achten Sie darauf, dass für jedes Lickometer der richtige Kabelschutz verwendet wird.Abbildung 4D und siehe Schritt 3.8.8).
   4. Stellen Sie die Saugröhrchen gegebenenfalls so ein, dass etwa 2 cm des Saugröhrchens aus der Kappe herausragen (Abbildung 4E-1). Zum Anbringen der Flaschen wird der Saugtrinkrohr durch die Saughalterung des Flaschenhalters geschoben, bis er anhält (Abbildung 4E-2). Nur die äußerste Spitze des Saugrohrs sollte über die Acrylplatte hinausragen (Abbildung 4E-3). Es ist entscheidend, dass kein anderer Teil des Saugrohrs freiliegt, um falsch positive Ableckungen durch nicht-konsumatorisches Verhalten, wie das Berühren oder Spielen der Ratte mit dem Saugrohr, zu vermeiden. Ein Filtersieb sollte fest über dem Gitterdeckel des Käfigs und der Kabelhalterung sitzen, ohne das Kabel selbst zu beeinträchtigen (Abbildung 4F).
      HINWEIS: Eine dickere Acrylplatte oder ein Stapel mehrerer 3,2 mm dicker Platten kann verwendet werden, um Saugröhrchen längerer Ausführung vollständig einzuschließen, falls in Experimenten die Saugröhrchen weiter in den Käfig hineinragen müssen, beispielsweise bei der Messung des Trinkverhaltens junger Ratten, die möglicherweise Schwierigkeiten haben, ein kurzes Saugröhrchen zu erreichen.
5. Installation und Verwendung von Sipperblockern
   ​HINWEIS: Der Sipper-Blocker (Abbildung 5Asoll den Zugang der Ratte zum Saugtrinknapf während des Flaschenwechsels beschränken und eine genaue Kalibrierung des Lickmeters zu Beginn jeder Trinkphase sicherstellen.
   1. Sammeln Sie die 3D-gedruckten Teile sowie eine M5-Schraube, eine Mutter und eine Unterlegscheibe für einen Sipper-Blocker, wie gezeigt Abbildung 5B.
   2. Setzen Sie das SIPPER_Gear in die SIPPER_Base ein (Abbildung 5C-1). Stellen Sie sicher, dass das SIPPER_Gear genau wie in der 3D-Darstellung gezeigt ausgerichtet ist. Setzen Sie den SIPPER_Worm in die Öffnung an der Oberseite des SIPPER_Base ein. Drehen Sie den Worm während des Einsetzens im Uhrzeigersinn, bis der Kopf bündig mit der Basis abschließt (Abbildung 5C-2).
   3. Schrauben Sie die SIPPER_Mutter von der Unterseite der Basis her auf das Ende der SchneckeAbbildung 5C-3). Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mutter festzuziehen, während Sie das Rändelrad drehen. Stecken Sie die runden, schmalen Hälse der SIPPER_Blocker in die Nuten des Zahnrads.Abbildung 5C-4).
   4. Bringen Sie den montierten Sipper-Blocker mit dem M5-Schraubensatz am Käfigdeckel an.Abbildung 5D). Stellen Sie sicher, dass beide Sipper-Blocker mit den Sipper-Öffnungen ausgerichtet sind.
   5. Um den Zugang zu den Saugern zu blockieren, drehen Sie die Schneckenfeder im Uhrzeigersinn, um die Blockierungen so weit abzusenken, dass sie die Saugöffnungen vollständig abdecken (Abbildung 5E).
   6. Um Zugang zu den Trinkschläuchen zu ermöglichen, drehen Sie den Drehknopf gegen den Uhrzeigersinn, bis die Blockierungen senkrecht zur Käfigabdeckung in vertikaler Position stehen (Abbildung 5F-1). Ziehen Sie jeden Blockierarm manuell nach oben, bis sich die Köpfe gerade unterhalb der oberen Drahtkäfigkante befinden. Drehen Sie die Blockierer 90° sodass die Köpfe parallel zu den Metallstäben an der Käfigoberseite ausgerichtet sind und die Arme fixiert sind (Abbildung 5F-2). Drehen Sie den Regler weiter gegen den Uhrzeigersinn, bis beide Blockierungen über die Käfigoberseite angehoben sind (Abbildung 5F-3) und die Trinkschläuche sind voll zugänglich (Abbildung 5F-4).
6. Verwendung des LIQ HDR-Systems im Vivarium
   HINWEIS: Die folgende Vivarieneinrichtung ist darauf optimiert, die Trinkwahl aus zwei Flaschen mithilfe einer einzigen Mikrocontroller-Schnittstelle zu erfassen, die mit 18 standardmäßigen Schuhkarton-Rattenkäfigen verbunden ist. Alle elektronischen Komponenten, einschließlich der Mikrocontroller-Schnittstelle, der Sensoreinheiten und verschiedener Kabel, sind an wandmontierten Metallgitterböden befestigt, die die Käfige tragen.Abbildung 6A). Möglicherweise sind einige Anpassungen erforderlich, um den Gegebenheiten der Tierhaltungseinrichtungen und den Bedürfnissen der Anwender Rechnung zu tragen.
   1. Montieren Sie jede Sensoreinheit mit der benutzerdefinierten, 3D-gedruckten Halteschraube an den Gestellen des Vivariums (Abbildung 6B). Stellen Sie sicher, dass jede Sensoreinheit direkt unter dem Käfig mit dem gelben Lickometer montiert ist, um unnötige Kabelspannung zu vermeiden (Abbildung 6A).
   2. Ordnen und befestigen Sie jeden weiblichen Steckverbinderkabel so an, dass sie sich nicht überlappen oder an ihren Lötenden übermäßig verbiegen, was zu einer schlechten Erkennung von Leckbewegungen führen könnte.Abbildung 6B). Wenn Regale aus Metallstangen verwendet werden, kann dies leicht erreicht werden, indem die Verbindungskabel wie dargestellt mit Kabelbindern an separaten Stangen des Regals befestigt werden.
   3. Montieren Sie die Mikrocontroller-Schnittstelle neben Sensoreinheit A unter Verwendung der gleichen 3D-gedruckten Befestigungsschraube und stecken Sie den 4-poligen Stecker in den 5-V-Eingangsanschluss des 5-V-auf-3-V-Levelschiebers, der mit Sensoreinheit A verbunden ist (Abbildung 6C).
   4. Verwenden Sie Isolierband, um den zusätzlichen Erdungsdraht an einer Erdungsquelle wie dem Metallregal zu befestigen.Abbildung 6D).
   5. Ordnen Sie jeden Käfig entsprechend der Farbe und der ID des installierten Lickometers an, wie vorgegeben Abbildung 6A Darstellung, um Kabelüberlappungen und -spannungen zu minimieren.
   6. Verbinden Sie alle männlichen Kabel der Lickometer-Stecker sicher mit den entsprechenden weiblichen Kabeln der Sensor-Stecker (Abbildung 6E). Stecken Sie das Netzteil ein, um die Mikrocontroller-Schnittstelle einzuschalten (Abbildung 6F).
   7. Auf der Haupt-GUI-Seite (grafische Benutzeroberfläche) (Abbildung 6G), tippen Sie auf die Symbol festlegen um die Einstellungsseite zu öffnen. Die Benutzer können die Einschalt- und Ausschaltzeiten für das Licht gemäß dem Zeitplan des Vivariums anpassen, um sicherzustellen, dass die Bildschirmanzeige automatisch gedimmt wird, wenn der Dunkelzyklus beginnt (Abbildung 6H-1).
   8. Antippen Sensoreinstellungen bearbeiten (Abbildung 6H-1) um die Berührungsschwelle auf 8 und die Freigabeschwelle auf 2 einzustellen, wodurch nach unseren Erfahrungen die zuverlässigste Erkennung von Leckbewegungen bei Ratten mit der aktuellen Versuchsanordnung ermöglicht wird (Abbildung 6H-2. Beachten Sie jedoch, dass Benutzer möglicherweise verschiedene Einstellungen ausprobieren müssen, falls Änderungen am derzeitigen System vorgenommen werden.
   9. Deaktivieren Automatische Kalibrierung wenn Daten nur über einen Zeitraum von 24 Stunden oder weniger erhoben werden (Abbildung 6H-2).

4. Tägliche Verfahren für die Heimkäfig-Trinkversuche mit zwei-Flaschen-Wahl und Ableckdetektion

1. Befolgen Sie die in Schritt 2 beschriebenen Schritte für standardmäßige Zweiflaschenwahlverfahren mit den folgenden Modifikationen.
2. Am Montag, Mittwoch und Freitag, bevor Sie die MWF-Flaschen anbringen, verwenden Sie die Saugverschlüsse, um die Saugöffnungen an allen Käfigen abzudecken (siehe Schritt 3.5.5 und Abbildung 5E).
3. Wählen Sie vor der Aufzeichnung die korrekte Experimentalseite auf der Haupt-GUI-Seite aus, die der Seite der EtOH-Flasche an diesem Tag entspricht (Abbildung 6G).
4. Nachdem alle MWF-Flaschen installiert wurden, tippen Sie auf START! auf der Hauptseite (Abbildung 6G), um die Kalibrierung der Sensoren zu beginnen. Währenddessen wird empfohlen, einen Schritt vom System wegzutreten und sicherzustellen, dass die Ratten nicht an den Saugröhrchen lecken (Abbildung 6I-1). Die Kalibrierung dauert einige Sekunden; danach wechselt das System zur Hauptaufzeichnungsseite, die die kumulative Anzahl der Leckbewegungen an jeder Flasche für jedes Lickometer anzeigt (Abbildung 6I-2).
5. Heben Sie alle Saugverschlüsse über die Käfigoberseite an, um Zugang zu den Saugröhrchen zu ermöglichen (siehe Schritt 3.5.6 und Abbildung 5F), und setzen Sie alle Filterdeckel vorsichtig wie beschrieben wieder ein (siehe Schritt 3.4.4 und Abbildung 4F).
6. Tippen Sie auf Aktualisieren, um die Anzeige der Leckzahlen auf dem Bildschirm zu aktualisieren, da diese nicht automatisch in Echtzeit aktualisiert wird (Abbildung 6I-2).
7. Am Dienstag, Donnerstag und Samstag tippen Sie auf Speichern & Beenden, um die Aufzeichnung zu stoppen und zur Hauptseite zurückzukehren (Abbildung 6I-2), bevor Sie die MWF-Flaschen entfernen.
8. Um die SD-Karte zum Datentransfer zu entfernen, tippen Sie vor dem Ausstecken der SD-Karte auf SD auswerfen (Abbildung 6G). Stecken Sie die SD-Karte in einen beliebigen Computer ein und kopieren Sie die nach dem Einschalt-Datum der Flasche benannte .csv-Datendatei auf diesen Computer (Abbildung 6K). Um die SD-Karte für die nächste Aufzeichnung wieder einzubinden, stecken Sie die Karte in das Interface und tippen Sie auf SD einbinden (Abbildung 6J).
   ANMERKUNG: Wir empfehlen, die Datendateien täglich zu sichern.
9. Es empfiehlt sich, die Körpergewichtsmessungen auf einmal pro Woche zu beschränken, sofern dies mit dem Tiermodell und der Tierversuchsgenehmigung vereinbar ist, und diese Aufgabe am Tag durchzuführen, der für den Käfigwechsel vorgesehen ist, um unnötige Störungen der Lickometer und Sensoren zu minimieren. Trennen Sie vor dem Bewegen der Käfige alle männlichen Lickometerkabel von den entsprechenden weiblichen Sensorkabeln. Nachdem jeder Ratte gewogen wurde, kehren Sie die Ratte in einen sauberen Käfig zurück. Übertragen Sie das Lickometer bei Bedarf auf einen neuen Käfigdeckel und verbinden Sie jedes Lickometer erneut mit dem entsprechenden Sensor.
10. Für Experimente, die den Effekt einer Intervention (z. B. Medikamenteninjektion) auf die EtOH-Aufnahme und die Trinkmikrostruktur untersuchen, sollten solche Interventionen nach Möglichkeit vor Beginn der Trinkphase geplant werden. Falls dies nicht möglich ist, können Forschende die Lickerfassung unterbrechen, indem sie auf Pausieren tippen (Abbildung 6I-2), und die Datenaufzeichnung nach Abschluss der Intervention durch Antippen von Fortsetzen wieder aufnehmen. Wir empfehlen, während jeder Pause in der Trinkphase die Flaschengewichte zu erfassen, um Änderungen der EtOH-Aufnahme vor und nach der Intervention zu dokumentieren sowie Verschütten zu berücksichtigen, das beim Entfernen des Käfigdeckels zum Zugriff auf das Tier auftreten kann.
11. Am Ende der Studie sollten alle im Käfig befindlichen Komponenten gründlich desinfiziert werden, bevor sie bei neuen Tieren verwendet werden, um die Übertragung von Kontaminationen zwischen Tieren zu begrenzen. Wir empfehlen, das Lickometer vorsichtig mit einer 70 %igen EtOH-Lösung zu besprühen und abzuwischen, wobei darauf geachtet werden muss, die internen elektrischen Komponenten nicht zu beschädigen. Der Saugverschluss und die Acrylplatte können mit warmem Seifenwasser gewaschen werden.

5. Datenauswertung

1. Korrigieren Sie die Aufnahmedaten vor der Auswertung der abhängigen Maße für Verschüttungen, die unvermeidlich beim täglichen Wechseln der Flaschen auftreten. Dazu mitteln Sie die Gewichtsänderung der EtOH- und H₂O-Flaschen im Verschüttungskäfig über den gesamten Studienzeitraum.
2. Schließen Sie alle Werte aus, die mehr als zwei Standardabweichungen vom Mittelwert für jede Flasche entfernt liegen. Nach Ausschluss dieser Ausreißer subtrahieren Sie die berechneten Mittelwerte von den Gewichtsänderungen der EtOH- und H₂O-Flaschen, die aus Käfigen mit Tieren stammen. Durch diese Subtraktion können Forscher sicher sein, dass der durchschnittliche Verlust aufgrund von Verschütten einer bestimmten Lösung nicht in die Maße der Konsumtion einfließt. Die Subtraktion des durchschnittlichen Verschüttungsbetrags kann bei einigen Tieren zu gegebener Zeit zu negativen Werten führen. Wandeln Sie diese in Null um und interpretieren Sie sie als Fehlen jeglicher Aufnahme dieser Lösung.
3. Die primären abhängigen Maße für Zwei-Flaschen-Präferenzversuche sind die EtOH-Aufnahme (g/kg) und die Präferenz (%). Berechnen Sie die Aufnahme aus der Gewichtsänderung der EtOH-Flasche (g) und normieren Sie sie auf das Körpergewicht (kg) mithilfe der folgenden Schritte.
   1. Wandeln Sie die Gewichtsänderung der Flasche (g) in eine Volumenänderung (mL) um, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
      
      Die Dichte von reinem Ethanol beträgt 0,789 g/mL. Daher beträgt die beitragende Dichte von 20 % EtOH 0,1578 g/mL. H₂O wiegt 1 g/mL. Folglich beträgt die beitragende Dichte von 80 % H₂O = 0,80 g/mL. Somit setzt sich jedes mL einer 20 %igen EtOH-Lösung (v/v) aus 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL zusammen. Die endgültige Gleichung bei Verwendung einer 20 %igen (v/v) EtOH-Konzentration lautet daher:
      
   2. Berechnen Sie die konsumierte Ethanolmenge mithilfe der folgenden Gleichung. Verwenden Sie Körpergewichte, die in derselben Woche wie die Aufnahmedaten erhoben wurden, um den konsumierten Ethanolbetrag bezogen auf das Körpergewicht des Tieres zu berechnen.
      
   3. Berechnen Sie die Präferenz mithilfe der folgenden Gleichung:
      
4. Wie sein Maus-Pendant³⁰ erfasst LIQ HDR eine Vielzahl von Mikrostrukturvariablen der Trinkaktivität, einschließlich Lick-Dauer, Anzahl der Trinkphasen, Dauer der Trinkphasen, Anzahl der Licks pro Trinkphase und Lick-Dauer pro Trinkphase (Abbildung 6K). Eine Trinkphase ist definiert als eine Serie von Licks, die mit mindestens 3 Licks beginnt, die innerhalb von weniger als 1 Sekunde ausgeführt werden, und endet, nachdem 3 Sekunden ohne weitere Licks verstrichen sind. Diese Maße können anschließend verwendet werden, um die durchschnittliche individuelle Lick-Dauer, die durchschnittliche individuelle Trinkphasendauer, die durchschnittliche Anzahl der Licks pro Trinkphase, die durchschnittliche Lick-Frequenz, das geschätzte inter-Lick-Intervall und das geschätzte inter-Phasen-Intervall zu berechnen.
   HINWEIS: Die Mikrocontroller-Schnittstelle liefert diese Mikrostrukturdaten mit einer Auflösung von 1 Minute in einer .csv-Datei (Abbildung 6K). Forscher können die mit dem ursprünglichen LIQ-HD-Protokoll bereitgestellte Analyse-App³⁰ oder ihre bevorzugte Plattform zur Nachbearbeitung nutzen, um die Daten entsprechend den Forschungsanforderungen zusammenzustellen und zusammenzufassen. Mikrostrukturdaten werden typischerweise über den gesamten 24-Stunden-Zeitraum summiert, um durchschnittliche Unterschiede auf makroskopischer Ebene zu vergleichen, oder in 30-Minuten- bis 1-Stunden-Intervallen, um variationsreiche Trinkmuster über einen Hell-Dunkel-Zyklus hinweg zu untersuchen.

Ergebnisse

Standardisierte Daten zum intermittierenden Alkoholkonsum mit zwei-Flaschen-Choice im Heimkäfig
Mithilfe des Standardverfahrens (Abbildung 7A) können Forschende den 24-Stunden-Konsum (Abbildungen 7B–D) sowie alkoholähnliches Binge-Trinkverhalten erfassen, sofern die Flaschengewichte kurz nach Beginn der Trinkphase erhoben werden (Abbildungen 7E–F). Durch die Berechnung der Ethanolzufuhr im Verhältnis zur Wasseraufnahme können Forschende zudem Präferenzdaten zu allen gemessenen Zeitpunkten erhalten (Abbildungen 7D, F). Wie in Abbildung 7C dargestellt, zeigen Ratten häufig eine Phase der Steigerung der Ethanolzufuhr während der ersten Tage des Zugangs mit zwei-Flaschen-Choice. Dieser folgt eine Plateauphase, in der die Zufuhr relativ stabil bleibt. Obwohl dieses Muster bei männlichen Ratten regelmäßig beobachtet wird^{7,32,33,34,35,36}, tritt es bei weiblichen Tieren nicht immer auf. Stattdessen berichten einige Studien von stabilen Ethanolzufuhrmengen über den gesamten Untersuchungszeitraum hinweg bei weiblichen Ratten^37,38. Darüber hinaus legen einige Untersuchungen nahe, dass die Ethanolzufuhr bei längerer Zugangsdauer weiter ansteigen kann^36,39. Die tägliche Zufuhr kann zwischen Individuen stark variieren. Der durchschnittliche Tageskonsum ist jedoch für die in der Alkoholforschung am häufigsten verwendeten Stämme gut charakterisiert und kann als Referenzwert für den Erfolg dienen, wenn gruppierte Daten betrachtet werden^{7,8,33,34,35,39}.

Wie in Abbildung 7E gezeigt, nehmen viele Ratten kurz nach Beginn der Trinkphase einen erheblichen Teil ihres täglichen Ethanolkonsums auf^8,33. Dieses bingehafte Muster der Ethanolzufuhr ist häufig mit einer signifikanten Präferenz für Ethanol gegenüber Wasser verbunden (Abbildung 7F). Forscher sollten jedoch nicht überrascht sein, wenn die 24-h-Präferenz 50 % nicht überschreitet. Dies gilt insbesondere für nicht-inzüchtete oder alkoholunpräferierende Nagetierstämme sowie für Studien, die auf relativ kurze Phasen des Zweiflaschenwahlzugangs beschränkt sind^{7,32,33,35,37}.

Validierung des LIQ HDR für die Mikrostrukturanalyse des Trinkverhaltens im Zwei-Flaschen-Test
Die Ergänzung des standardmäßigen Zwei-Flaschen-Paradigmas bei Ratten durch das LIQ HDR-System ermöglicht es Forschenden, die Aufnahme anhand der erfassten Trinkdaten genau und präzise vorherzusagen. Dies wird durch die starke und signifikante Korrelation zwischen der kumulativen Anzahl erfasster Leckbewegungen und der Gewichtsänderung der Flaschen sowohl für die EtOH-Flasche (R² = 0.7789, F_(1,113) = 398.1, p < 0.0001) als auch für die H₂O-Flasche (R² = 0.7910, F_(1,117) = 442.9, p < 0.0001) über einen Zeitraum von 24 Stunden bestätigt (Abbildung 8A). Dies gilt ebenfalls für Tage, an denen die Ratten zwei Flaschen mit H₂O erhielten (R² = 0.8875, F_(1,188) = 1484, p < 0.0001; Abbildung 8B).

LIQ HDR ermöglicht auch eine präzise Analyse von Trinkmustern mit einer hohen zeitlichen Auflösung, die mit dem herkömmlichen Zwei-Flaschen-Paradigma nicht erreichbar ist. Mit diesem Ansatz haben Forschende die Möglichkeit, Unterschiede in Trinkmustern zwischen verschiedenen Lösungen, über den Lichtzyklus hinweg, zwischen den Geschlechtern, Drogen-Gruppen und weiteren Faktoren zu untersuchen. Beispielsweise ermöglicht die Einteilung durchschnittlicher Leckbewegungen in 30-Minuten-Intervalle eine einfache Analyse der durchschnittlichen 24-h-Trinkmuster. Wie erwartet zeigt diese Analyse signifikant höhere Aufnahmemengen sowohl für EtOH als auch für H₂O während des Dunkelzyklus, wenn die Ratten wach sind, im Vergleich zum Lichtzyklus, in dem Ratten typischerweise schlafen (Abbildung 8C). Mit einem ähnlichen Ansatz können Forschende Gruppenunterschiede in Trinkmustern untersuchen. So lässt sich die Trinkmikrostruktur zwischen männlichen und weiblichen Ratten vergleichen, indem die durchschnittliche Anzahl an Leckbewegungen für EtOH (Abbildung 8D) oder Wasser (Abbildung 8E) über einen Zeitraum von 24 h analysiert wird. Um Front-Loading und/oder bingehaftes Trinkverhalten zu untersuchen, können Forschende die Auflösung ihrer Analyse erhöhen, indem sie sich auf das Trinkverhalten kurz nach Beginn der Sitzung konzentrieren und dabei kleinere Zeitfenster zur Datenzusammenfassung verwenden. Dadurch können Forschende Phasen bingehaften Trinkverhaltens untersuchen, ohne dass mehrere Flaschengewichte innerhalb von 24 h erhoben werden müssen. Wie in Abbildung 8C (Einschub) gezeigt, ergibt diese Analyse, dass der Großteil des Trinkverhaltens, der durch ein 30 Minuten nach Sitzungsbeginn ermitteltes Flaschengewicht erfasst wird, innerhalb der ersten 5 Minuten stattfindet, anstatt sich über den gesamten 30-minütigen Zeitraum zu verteilen. Solche Daten können dabei helfen, optimale Zeitpunkte für die Entnahme von Blutproben zur Bestimmung der Blutethanol-Konzentration (BEC) zu identifizieren. Tatsächlich wurde an einem separaten Trinktag ein ähnliches Muster des Front-Loadings beobachtet, bei dem Trinkmuster mit hoher Auflösung in einem Zeitraum von nur 15 Minuten erfasst wurden (Abbildung 8F). Die während dieser Sitzung aufgezeichnete durchschnittliche Anzahl an Leckbewegungen sagte zuverlässig die Änderung des Flaschengewichts voraus (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0.8601, F_(1,10) = 61.47, p < 0.0001; Abbildung 8G). Zudem korrelierten die 15 Minuten nach Sitzungsbeginn aus entnommenen Blutproben ermittelten BECs gut mit der detektierten Anzahl an Leckbewegungen (R² = 0.4327, F_(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Abbildung 8H), selbst bei relativ geringen EtOH-Aufnahmemengen.

LIQ HDR erfasst verschiedene Maße der Trinkmikrostruktur, die während der Trinkphasen in Echtzeit erkannt und berechnet sowie in 1-Minuten-Intervallen gespeichert werden, analog zur Erkennung von Schluckbewegungen (Abbildung 6K). Diese Maße werden kurz in Schritt 5.4 beschrieben und waren bereits früher definiert³⁰. Forschende können detaillierte Analysen von Veränderungen in der individuellen Trinkmikrostruktur durchführen und untersuchen, inwieweit Trinkmuster zu Unterschieden in der Gesamtaufnahme beitragen. Beispielsweise stellten wir fest, dass männliche und weibliche Ratten bei der Wasseraufnahme eine ähnliche Anzahl von Schluckbewegungen, Trinkepisoden und Episodenlänge aufwiesen (Abbildung 9A-C), dies jedoch mit einer höheren Gesamtaufnahme (g/kg) bei weiblichen im Vergleich zu männlichen Tieren verbunden war (t-Test; t=2.882, df=10, p=0.0163; Abbildung 9D). Dies entspricht den geschlechtsspezifischen Unterschieden im Körpergewicht, die es weiblichen Tieren ermöglichen, bei gleicher Anzahl von Schlucken ein höheres Aufnahmeniveau bezogen auf das Körpergewicht zu erreichen als männliche Tiere. Auffällig ist, dass dies im Gegensatz zur geschlechtsspezifischen Analyse der Mikrostruktur bei EtOH steht, bei der eine ähnliche Trinkmikrostruktur mit ähnlichen EtOH-Aufnahmemengen einherging (Abbildungen 9E-H). Diese Daten legen nahe, dass das Schluckvolumen für Wasser zwischen den Geschlechtern ähnlich ist, weibliche Ratten jedoch im Vergleich zu männlichen ein geringeres Schluckvolumen für EtOH aufweisen. Insgesamt stützen diese mikrostrukturellen Daten die Annahme, dass männliche und weibliche Ratten im Heimkäfig je nach Art der konsumierten Flüssigkeit wahrscheinlich unterschiedliche Strategien beim freiwilligen Trinkverhalten verfolgen. Frühere Arbeiten berichteten ebenfalls über geschlechtsspezifische Unterschiede in den Trinkstrategien, die von der Art der Flüssigkeit abhängen^40,41, wobei die in diesen Studien beobachteten Unterschiede nicht nur auf die Wasseraufnahme beschränkt waren. Die Dauer der Trinkgeschichte könnte eine Rolle bei den zwischen den Studien beobachteten Unterschieden spielen, da die Zweiflaschenwahl in dem vorliegenden Datensatz auf 5 Wochen begrenzt war, während sie in früheren Arbeiten über 12 Wochen hinausging^40,41.

Abbildung 1: Trinkverhalten im Heimkäfig mit zwei-Flaschen-Paradigma. (A) Forscher können die freiwillige Aufnahme von Ethanol im Heimkäfig sowie die Präferenz gegenüber Wasser mithilfe eines Standardverfahrens messen, das die Aufnahme anhand der Gewichtsänderung der Flaschen berechnet. (B) Durch die Verwendung von LIQ HDR, einem kostengünstigen, selbstgebauten System zur Erfassung von Lecks im Heimkäfig, das für Ratten konzipiert ist, können Forscher dieselben Messgrößen wie beim standardmäßigen Zwei-Flaschen-Paradigma erheben und gleichzeitig die hochauflösende Mikrostruktur des Trinkverhaltens während des gesamten Aufzeichnungszeitraums erfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Aufbau kapazitiver Sensoreinheiten. (A) Elektronische Bauteile und Schaltplan. (B) Materialien zum Aufbau von drei kapazitiven Sensoreinheiten, die zur Konstruktion eines LIQ HDR-Systems benötigt werden. (C) Löten Sie 2-polige Buchsenkabel für Käfige #1–6 an die Pins #0–11 der Platine A und sichern Sie die Lötstellen mit Heißkleber. Kennzeichnen Sie die Kabel farblich mithilfe von farbigen Schrumpfschläuchen und beschriften Sie jedes Kabel mit einer eindeutigen Lickometer-ID-Nummer. (D) Verbinden Sie Platine A und den 5-V- auf 3-V-Level-Shifter über 4-polige Kabel (1) mit einem differentiellen I²C-Kommunikations-Breakout-EndPoint, und bringen Sie Platine A sowie das Kommunikations-Breakout in der 3D-gedruckten Gehäuseeinheit unter (2–3). (E) Ändern Sie die I²C-Adressen der Platinen B und C, indem Sie jeweils einen Jumper-Draht von dem ADDR-Pin zu den Pins 3Vo bzw. SDA löten. (F) Löten Sie 2-polige Buchsenkabel an die Sensorplatinen B und C, beschriften Sie diese mit den entsprechenden Lickometer-IDs und verbinden Sie Platine B mit einem Kommunikations-Breakout-MidPoint sowie Platine C mit einem EndPoint über 4-polige Kabel. (G) Bringen Sie die Sensoreinheiten B und C in ihren jeweiligen 3D-gedruckten Gehäusen unter und verketten Sie alle drei Einheiten mithilfe von Ethernet-Kabeln. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Aufbau des LIQ HDR-Lickometers. (A) 3D-Darstellung der im Käfig befindlichen Komponenten. (B) Materialien zum Aufbau eines Zwei-Flaschen-Lickometers. Beachten Sie, dass ein LIQ HDR-System Platz für 18 Zwei-Flaschen-Lickometer bietet. (C) Verlängern Sie die Länge des 2-poligen männlichen Kabelsteckers mit einem Paar schwarzer und roter Drähte und codieren Sie diese farblich mithilfe von Schrumpfschläuchen. (D) Fädeln Sie die schwarzen und roten Drähte durch die linken (L) und rechten (R) Öffnungen am Flaschenhalter (1) und verlöten Sie die Enden mit den Kupferbahnen (2–3). (E) Befestigen Sie die Kupferbahnen an den Innenwänden der Saugröhrchenhalterungen (1–2) und verstärken Sie sie mit Heißkleber (3–4). (F) Fädeln Sie das Kabel durch den Kabelschutz. (G) Bringen Sie die Kabelklemme an. (H) Kennzeichnen Sie den Stecker mit der entsprechenden Lickometer-ID-Nummer. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Installation des Lickometers. (A) Die Metallstäbe um die Saugöffnungen am Metallgitterdeckel mit Isolierband abdecken. (B) Das Lickometer und die Acrylplatte mit zwei Sätzen M5-Schrauben und -muttern am Käfigdeckel befestigen. (C) Die Kabelhalterung am äußersten Stab des Drahtgitterdeckels befestigen. (D) Sicherstellen, dass für jeden Käfig der entsprechende Kabelschutz (links L oder rechts R) verwendet wird. (E) Nur etwa 2 cm der Flaschensauger freilassen (1), sodass beim Aufsetzen der Flaschen auf den Käfig (2) lediglich die äußersten Spitzen der Sauger über die Acrylplatte hinausragen und für die Ratten erreichbar sind. (F) Der Filtersitz sollte über die Kabelhalterung passen, ohne das Kabel selbst zu beeinträchtigen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Installation und Verwendung des Sipper-Blockers. (A) 3D-Darstellung des Sipper-Blockers. (B) Angefertigte 3D-gedruckte Teile für einen Sipper-Blocker. (C) Montieren Sie die 3D-gedruckten Teile. (D) Installieren Sie den montierten Sipper-Blocker mit einer M5-Schraube + Mutter + Unterlegscheibe auf dem Käfigdeckel. (E) Drehen Sie den Drehknopf im Uhrzeigersinn, um den Zugang zu den Sippern zu blockieren. (F) Drehen Sie den Drehknopf gegen den Uhrzeigersinn, um die Blocker von den Sippern zu entfernen (1), heben Sie die Blocker an und drehen Sie sie um 90° (2), und drehen Sie weiter gegen den Uhrzeigersinn, bis sich die Blocker über dem Käfigdeckel befinden (3–4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Einrichtung des Vivariums und Bedienung der grafischen Benutzeroberfläche. (A) Empfohlene Vivarieneinrichtung und Schaltplan (B) Befestigen Sie jede Sensoreinheit an den Regalen und ordnen und stabilisieren Sie die Sensorleitungen an den Regalen. (C) Montieren Sie die Mikrocontroller-Schnittstelle an den Gestellen und verbinden Sie deren 4-poligen Jumper mit dem 5-V- auf 3-V-Levelschieber, der mit der Sensoreinheit A verbunden ist. (D) Befestigen Sie den zusätzlichen Erdungsdraht mit Isolierband. (E) Schließen Sie die Sensorkabel an die entsprechenden Lickometerkabel an. (F) Schließen Sie das Netzteil an, um die Mikrocontroller-Schnittstelle einzuschalten. (G) Hauptseite der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) (H) Antippen Einstellungen um die Ein-/Aus-Schaltzeit der Beleuchtung an den Lichtplan des Vivariums anzupassen (1) und tippen Sie auf Sensoreinstellungen um die Berührungs- und Freigabeschwellen für Ratten anzupassen (2). (I) Um Daten aufzuzeichnen, wählen Sie die Seite der EtOH-Flasche auf der Hauptseite, antippen LOS! zur Kalibrierung der Sensoren (1) und zum Starten der Aufzeichnung (2). Tippen Sie Aktualisieren um die auf dem Bildschirm angezeigte Anzahl der Leckbewegungen zu aktualisieren, und tippen Sie Speichern & Beenden um die Aufnahme zu beenden. (J) Antippen SD auswerfen auf der Hauptseite, um die SD-Karte zu entnehmen und Daten zu übertragen. Tippen Sie SD montieren nach dem Einlegen der SD-Karte (K) Bildschirmfoto einer repräsentative Rohdatendatei, die zeigt, wie Mikrostrukturdaten im Mikrocontroller-Interface in 1-Minuten-Intervallen gespeichert werden Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Repräsentative Trinkdaten aus dem Zwei-Flaschen-Test, aufgezeichnet mit dem Standardverfahren. Im intermittierenden Zwei-Flaschen-Test mit freiem Zugang zum Käfig trinken die Ratten (A) an Montagen, Mittwochen und Freitagen (Mo, Mi, Fr) eine 20%ige (v/v) EtOH-Lösung (orange) und H₂O (blau), während dienstags, donnerstags und an den Wochenenden beide Flaschen H₂O enthalten. (B) Die tägliche Aufnahme von Flüssigkeit zeigt, dass die Ratten über den gesamten Untersuchungszeitraum hinweg ein relativ konstantes Niveau der Gesamtflüssigkeitsaufnahme (mL) beibehalten. (C) Die EtOH-Aufnahme steigt jedoch häufig in den ersten Trinksitzungen an und erreicht danach ein Plateau. (D) Dieses Muster der Steigerung und Aufrechterhaltung spiegelt sich ebenso in der Präferenz für EtOH wider. Forscher können auch bingehaftes Trinkverhalten (E) erfassen, wenn die Flaschengewichte innerhalb der ersten 30–60 Minuten nach Sitzungsbeginn erfasst werden. (F) Dies ist oft mit einer hohen Präferenz für EtOH gegenüber H₂O verbunden. Die schattierten Fehlerbalken zeigen ± SEM (n = 32 für Männchen und n = 16 für Weibchen). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8LIQ HDR erfasst den Verbrauch mit hoher zeitlicher Auflösung genau. Die Präzision und Genauigkeit des LIQ HDR-Systems wird unter anderem durch das Vorhandensein von eine signifikante positive Korrelation zwischen der Anzahl der Leckbewegungen und der Gewichtsänderung der Flasche an Tagen, an denen Ratten erhalten (A) H₂O und EtOH sowie (B) Tagen, an denen beide Flaschen H enthalten₂O. (C) Unterschiede in den Trinkmustern zwischen H₂O (blau) und EtOH (orange) über den 24-Stunden-Trinkzeitraum hinweg können leicht erfasst werden, indem durchschnittliche Leckbewegungen in 30-Minuten-Intervalle eingeteilt werden. Die Einlage zeigt die durchschnittlichen Leckbewegungen in 5-Minuten-Intervallen während der ersten 30 Minuten Zugang zu den Flaschen (grau hervorgehoben), in denen Ratten häufig ein signifikantes Front-Loading-Verhalten zeigen. Zwischengruppenunterschiede in den Trinkmustern können ebenfalls mit einem ähnlichen Ansatz untersucht werden, wie beispielhaft an der Leck-Mikrostruktur für (D) EtOH und (E) H₂O dargestellt für männliche und weibliche Ratten über einen 24-Stunden-Zeitraum. (FTrinkverhalten kann ebenfalls mit hoher zeitlicher Auflösung über einen kürzeren Testzeitraum hinweg untersucht werden, (G) währenddessen LIQ HDR die Aufnahme weiterhin genau verfolgt und (H) den vorhergesagten Blutethanolspiegel (BEC) auch bei relativ geringer EtOH-Aufnahme. Die schattierten Fehlerbalken stellen dar ± SEM (n = 6 für jedes Geschlecht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Repräsentative Daten zur Trinkmikrostruktur. LIQ HDR ermöglicht die Erfassung von Parametern der Trinkmikrostruktur, einschließlich (A) der Anzahl der Leckbewegungen, (B) der Anzahl der Trinkphasen und (C) der Dauer einer Trinkphase, zusätzlich zu (D) der Messung der gesamten Wasseraufnahme über die Gewichtsänderung der Flasche. (E–H) Ähnliche Parameter können für Ethanol erhoben werden. Gruppenvergleiche dieser Messgrößen können unterschiedliche Trinkmuster aufzeigen, wie im vorliegenden Beispiel, das geschlechtsspezifische Unterschiede in den Trinkstrategien je nach verabreichter Lösung offenbart. Die durchgezogene Linie kennzeichnet den Median, gestrichelte Linien die Quartile (n = 6 pro Geschlecht); ungepaarter t-Test; *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Erweiterte Abbildung 1: Aufbau der Mikrocontroller-Schnittstelle. (A) Elektronische Bauteile und Verdrahtungsschema. (B) Materialien zum Bau der Mikrocontroller-Schnittstelle, die für ein LIQ HDR-System erforderlich sind. (C) Auf der Rückseite des kapazitiven Touch-Shields einen Lötbrücken-Jumper über die Lötflächen für die Hintergrundbeleuchtung anbringen. (D) Auf der Rückseite des Data-Logging-Shields die Leiterbahn der Jumper-Fläche des CS-Pins (1) unterbrechen. Einen Jumper-Draht vom CS-Pin zum Pin #7 (2) verlöten. (E) Stiftleisten an den Datenlogger unter Verwendung des Touch-Shields als Basis anlöten. (F) Die verbleibende 2x4-Stiftleiste auf den Mikrocontroller stecken (1), den Datenlogger auf den Mikrocontroller setzen und die Stiftleiste an Ort und Stelle verlöten (2). (G) Die Knopfbatterie in den Datenlogger einsetzen (1), den Touchscreen auf den Datenlogger aufstecken und die SD-Karte in den Datenlogger einlegen (2). (H) Um den zusätzlichen Masse-Draht herzustellen, einen männlichen Verbinder vom Jumper-Draht abschneiden und das Ende mit einem abisolierten massiven Draht verlöten. (I) Die 4-poligen Jumper-Drähte und den zusätzlichen Masse-Draht an den Mikrocontroller anschließen (1) und mit Heißkleber fixieren (2). (J) Die Mikrocontroller-Schnittstelle in dem maßgeschneiderten, 3D-gedruckten Gehäuse unterbringen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das aktuelle Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erfassung von Ethanoltrinkdaten unter Verwendung eines Verfahrens mit intermittierendem Zugriff auf zwei Flaschen nach Wahl für zu Hause. Diese Methode kann relativ einfach und mit geringen bis gar keinen Kosten oder dem Bedarf an speziellen Forschungsgeräten implementiert werden. Mit den hier bereitgestellten Verfahren zur Konstruktion und Implementierung von LIQ HDR - einem Leckerkennungssystem für den Einsatz bei Ratten - können Forscher zusätzlich zu den Standardmaßen der Aufnahme und Präferenz hochauflösende Daten zur Mikrostruktur von Trinken erfassen.

Der im aktuellen Protokoll beschriebene intermittierende Zugangsplan ist ein weit verbreitetes Verfahren, das zum großen Teil deshalb verwendet wird, weil es bekanntermaßen eine höhere Ethanolaufnahme hervorruft als viele alternative Zeitpläne für den Ethanolzugang. In der Tat haben frühere Untersuchungen gezeigt, dass Ratten mit intermittierendem Zugang eine höhere durchschnittliche tägliche Ethanolaufnahme haben als Ratten mit kontinuierlichem 24-Stunden-Zugang ^6,7. Nichtsdestotrotz können je nach Forschungsfrage oder anderen experimentellen Designparametern unterschiedliche Zeitpläne für den Zugang zu Ethanol wünschenswert sein. Forscher können das aktuelle Protokoll sehr einfach an unterschiedliche Zeitpläne anpassen (z. B. kontinuierlicher Zugang, Trinken im Dunkeln usw.), indem sie einfach die Zeit und die Tage des Ein- und Ausschaltens der Flasche ändern.

Obwohl das Trinken mit zwei Flaschen ein relativ einfach zu implementierendes Paradigma ist, können Probleme auftreten, die die Datenerfassung beeinträchtigen können. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Experimentatoren die Daten täglich überprüfen, um potenzielle Probleme schnell zu erkennen. Insbesondere sollten Forscher genau auf sehr große oder sehr kleine Veränderungen des Flaschengewichts achten, die auf einen undichten bzw. verstopften Schluck hinweisen können. Das frühzeitige Erkennen von Anzeichen dieser Probleme kann verhindern, dass alle Daten eines bestimmten Probanden von der Analyse ausgeschlossen werden. Wenn Forscher über einen Zeitraum von 24 Stunden drastische Veränderungen (oder das Fehlen einer Veränderung) des Flaschengewichts feststellen, kann ein einfacher Wechsel zu einer neuen Flasche helfen, zu bestätigen, ob eine bestimmte Flasche aus dem Verkehr gezogen werden sollte. Aus diesen Gründen ist es ratsam, zusätzliche Flaschen und Trinkflaschen zur Hand zu haben. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige Ratten von Natur aus einen sehr geringen Ethanolkonsum aufweisen, z. B. ³⁵. Dies gilt insbesondere für Ratten bestimmter Stämme, siehe⁸ für eine Übersicht. Daher sollten Forscher nicht beunruhigt sein, wenn eine kleine Population von Tieren in einem bestimmten Versuch einen geringen oder keinen Ethanolverbrauch aufweist. Ebenso neigen einige Tiere dazu, mit dem Schlucker/der Flasche auf eine Weise zu spielen, die das Verschütten fördern kann. Obwohl selten, können wiederholte Fälle von starken Veränderungen des Flaschengewichts, die nicht mit dem Verzehr in Verbindung stehen, dazu führen, dass ein bestimmtes Tier aus dem Versuch entfernt wird.

Unser detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zeigt die einfache Implementierung und Anwendung des LIQ HDR-Systems für Ratten. Forscher ohne Vorkenntnisse oder Fähigkeiten in der Elektronik und Programmierung von Mikrocontrollern können dieses System ohne weiteres und mit geringen oder gar keinen Modifikationen an ihre experimentellen Anforderungen anpassen. Unsere repräsentativen Daten zeigen die erfolgreiche Anwendung für Studien zum Trinken von Ratten in Heimkäfigen und ihre leistungsstarke Fähigkeit, zahlreiche Messungen der Mikrostruktur des Trinkens mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen. LIQ HDR enthält mehrere Designänderungen im Vergleich zu seinem Vorgänger³⁰. Dies geschah nicht nur als Notwendigkeit für eine erfolgreiche Anpassung an den Einsatz bei Ratten, sondern auch zur Verbesserung der Funktionalität und der Benutzererfahrung. Komponenten im Käfig, einschließlich des 3D-gedruckten Flaschenhalters, des Sipperblockers und der elektronischen Komponenten, wurden zum Schutz vor Kauen an die Käfigoberseite verlegt, was zu häufigen und erheblichen Datenverlusten und Hardware-Umschlag führen kann. Das Hinzufügen einer lasergeschnittenen Acrylplatte trägt zusätzlich dazu bei, die Zerstörung dieser empfindlichen Komponenten zu verhindern. Abgesehen von der Acrylplatte, die aus dem gleichen Material wie ein Standard-Schuhkarton-Rattenkäfig besteht, sind alle anderen LIQ HDR-Komponenten für das Tier aus dem Inneren des Käfigs nicht oder nur für einen kurzen Moment während des Flaschenwechsels zugänglich. Diese Konstruktion begrenzt das Potenzial für die Zerstörung von Gerätekomponenten und das Risiko für das Tier durch Verschlucken von Non-Food-Artikeln. Im Gegensatz zu den relativ arbeitsintensiven Sonderanfertigungen, die im LIQ HD-Design verwendet werden, ist der 3D-gedruckte Flaschenhalter von LIQ HDR so konzipiert, dass er mit handelsüblichen Nagetier-Trinkflaschen kompatibel ist. Die Flaschen werden auf dem Käfigdeckel installiert und sind für Ratten auf die gleiche Weise zugänglich, wie Trinkflaschen bei der Standardpflege und -haltung verwendet werden. Das Hinzufügen von Sipper-Blockern ist eine einfache, aber effektive Lösung, die die Systemzuverlässigkeit verbessert und wertvolle Datenverluste verhindert, die ohne den Blocker durch Trinken entstehen können, das vor dem Start der Datenerfassung auf der Arduino-Schnittstelle auftritt, oder durch fehlerhafte Leckmessungen, die auftreten, wenn Ratten während der täglichen Kalibrierung mit den Sippern interagieren. Während die wesentlich größeren Rattenkäfige eine Vergrößerung des ursprünglichen Hardware-Designs erfordern, kann sich die Verwendung deutlich längerer Kabel aufgrund von Interferenzen negativ auf die Empfindlichkeit und Genauigkeit der kapazitiven Sensorik sowie auf die Integrität der^{I2C-Kommunikation}zwischen den Daisy-Chain-Sensorplatinen und der Arduino-Schnittstelle auswirken. Wir umgehen dieses Problem mit der Einführung des differentiellen^{I2C-Kommunikationssystems}, um eine nahezu verlustfreie Signalübertragung über Ethernet-Kabel mit extrem großer Reichweite zu erreichen. Die für die Käfigkomponenten verwendeten Materialien ermöglichen eine einfache Reinigung und Desinfektion zwischen den Einsätzen. Das Lickometer kann mit 70%iger EtOH-Lösung kastriert und abgewischt werden, wobei darauf geachtet werden muss, dass die elektrischen Komponenten, wie z. B. das leitende Kupferband, intakt bleiben. Nicht-elektrische Geräte, die in direktem Kontakt mit dem Tier stehen, wie z. B. der Sipper-Blocker und die Acrylplatte, können gründlich mit warmem Seifenwasser gewaschen werden.

Die Zuverlässigkeit und Effektivität eines jeden Lecksuchsystems erfordert eine ordnungsgemäße Konstruktion und Installation sowie umfangreiche Tests, eine sorgfältige Fehlerüberwachung und eine effektive Fehlerbehebung. Alle DIY-Komponenten müssen mit Geschick und Sorgfalt hergestellt und montiert werden. Dies ist besonders wichtig für Schritte mit Löten, die für Anfänger Übung erfordern können. Unabhängig davon ist eine umfangreiche Prüfung aller Lickometer erforderlich, bevor sie in tatsächlichen Versuchen eingesetzt werden können. Wenn das System modifiziert werden muss, um es an individuelle experimentelle Anforderungen anzupassen, müssen die Sensoreinstellungen (z. B. Berührungs- und Freigabeschwellen) möglicherweise weiter feinabgestimmt werden, um eine genaue Leckerkennung zu gewährleisten. Für Erstanwender empfehlen wir, das System in einer kurzen Pilotstudie mit einer sehr schmackhaften Lösung zu testen, die ein hohes Maß an Alkoholkonsum erzeugt. Die Leckerkennung kann in Echtzeit überprüft werden, indem die Sensorplatine visuell überprüft wird, da die LED blinkt, wenn ein Lecken registriert wird. Starke, signifikante und konsistente Korrelationen zwischen der Anzahl der Lecken und der Änderung des Flaschengewichts sollten als Maßstab für die richtige Einrichtung von Hardware und Software verwendet werden. Auch nachdem die Einrichtung abgeschlossen ist, empfehlen wir, die Aufzeichnung für ein bestimmtes Experiment an einem Tag zu starten, an dem Ratten zwei Flaschen mit Wasser erhalten, um Probleme mit der Ausrüstung zu beheben, die zu Beginn eines Experiments offensichtlich auftreten können. Es kann auch von Vorteil sein, die Funktion des Lickometers am Wassertag zu testen, der mit dem Käfigwechsel verbunden ist, da dies erfordert, dass die Lickometer abgeschaltet und wieder mit dem Sensor verbunden werden. Ein zufälliger Ausfall eines einzelnen Lickometers oder Sensors, der zu sehr offensichtlichen Ausreißerdaten führen würde (z. B. keine oder nur wenige Lecks werden trotz einer erheblichen Änderung des Flaschengewichts erkannt), ist ein Hinweis auf fehlerhafte Komponente(n). Wir empfehlen, für jedes Element des Lickometer-Systems im Voraus zusätzliche Komponenten vorzubereiten, um bei Bedarf einen einfachen Austausch zu ermöglichen. Schließlich kann nicht genug betont werden, wie wichtig es ist, sicherzustellen, dass sich Sensorkabel nicht überlappen oder übermäßig biegen. Dies kann zu zufälligen Fällen einer schlechten Lecherkennung führen, was sich in einer unangemessen niedrigen Lechzahl für eine bestimmte Änderung des Flaschengewichts oder extrem langen Lechdauern (fast 60.000 ms für einen 1-Minuten-Bin) von Minuten oder Stunden zeigt. Nichtsdestotrotz sind kleine Datenverluste in Studien unvermeidlich, die Daten für viele Tiere über 24 Stunden über viele Tage hinweg entweder mit dem Standard- oder dem mit Lickometern ausgestatteten Ansatz sammeln. Forscher können fehlerhafte Daten für die seltenen Trinksitzungen ausschließen, bei denen das Flaschengewicht und/oder die Lecksteine eindeutig nicht die Aufnahme widerspiegeln (z. B. Verstopfung des Schlucks, Kalibrierungsfehler usw.). In solchen Fällen kann der während der Datenanalyse fehlende Wert für ein bestimmtes Maß (z. B. Aufnahme (g/kg), Lecken usw.) über den Studienzeitraum für diesen bestimmten Probanden durch den fehlenden Wert ersetzt werden. ANOVA mit gemischten Effekten kann auch als Alternative verwendet werden, um fehlende Datenpunkte auszugleichen.

Einer der Vorteile des Paradigmas des Trinkens mit zwei Flaschen ist der freiwillige Aspekt der Ethanolaufnahme. Dies bietet eine ausgezeichnete Gesichtsvalidität, insbesondere im Lichte der Befunde, die zeigen, dass von Experimentatoren verabreichter Alkohol signifikant unterschiedliche Auswirkungen auf die Gehirnfunktion und das Verhalten haben kann als freiwillig selbst verabreichter Alkohol⁴². Darüber hinaus ermöglicht die Freiwilligkeit des Paradigmas den Forschern, individuelle Unterschiede in der Aufnahme zu erfassen, ähnlich wie die Variabilität der Alkoholpräferenz und der Trinkmuster, die beim Menschen beobachtet wird. Diese individuellen Unterschiede können den Forschern eine gute Gelegenheit bieten, den Konsum (Konsum und/oder Muster) mit dem Ausmaß der beobachteten pathologischen Effekte zu korrelieren.

Nichtsdestotrotz sollten einige Einschränkungen des Paradigmas des Trinkens von Zwei-Flaschen-Heimkäfigen berücksichtigt werden. Obwohl beispielsweise die individuelle Variabilität der Ethanolaufnahme für einige Versuche vorteilhaft sein kann, kann sie in anderen Experimenten, bei denen ein gleichbleibendes Maß an Intoxikation oder Ethanolexposition wünschenswert sein kann, ein Nachteil sein. Dies gilt insbesondere für Experimente, die die Folgen der Abhängigkeit und des Entzugs von chronischer Ethanolexposition untersuchen. Wichtig ist, dass das Trinken von zwei Flaschen nicht als Abhängigkeitsmodell charakterisiert wird - auch nicht bei Ratten, die über längere Zeiträume Zugang zu Ethanol haben. In Ermangelung von begleitenden Entzugssymptomen sollten Forscher daher vorsichtig sein, wenn sie die Folgen eines längeren Ethanolkonsums als Auswirkungen von Abhängigkeit und/oder Entzug interpretieren. In der Tat ist es möglich, wenn auch nicht plausibel, dass Ratten, die während des Zwei-Flaschen-Auswahlverfahrens relativ große Mengen Ethanol trinken, Entzugserscheinungen zeigen, dass Ratten, die in einem gegebenen Zeitraum von 24 Stunden geringere Gesamtmengen trinken, keine ähnlichen Anzeichen von Abhängigkeit zeigen. Auch das Trinkverhalten kann bei dieser Überlegung eine wichtige Rolle spielen, da zwei Tiere, die über einen Zeitraum von 24 Stunden die gleiche Menge trinken, je nach Muster ihrer Ethanolaufnahme sehr unterschiedliche Vergiftungsgrade (d. h. BEC) erfahren können²². Dies unterstreicht den Nutzen von LIQ HDR bei der Auswahl von zwei Flaschen, da es Ratten, die eine bestimmte Dosis Ethanol schnell konsumieren (d. h. Schlucken), im Vergleich zu solchen, die die gleiche Dosis viel langsamer konsumieren (d. h. Schluck), leicht identifizieren kann. Obwohl dies für Studien, die die Auswirkungen einer kontrollierten Dosis Ethanol untersuchen, möglicherweise unerwünscht ist, hat die Erkennung von Veränderungen des Trinkverhaltens (z. B. reduzierte Essattacken) nach einer bestimmten experimentellen Intervention angesichts des Ansatzes zur Schadensminimierung, der in der Klinik zunehmend verfolgt wird, einen signifikanten translationalen Wert. Schließlich ist kein Aufwand erforderlich, um für Tiere Zugang zu Ethanol in Käfighaltungsparadigmen zu erhalten, einschließlich des hier beschriebenen. Daher beschränkt sich der Nutzen dieses Paradigmas auf die alleinige Analyse des Alkoholkonsums, während operante Methoden in Fällen bevorzugt werden, in denen Forscher daran interessiert sind, die Alkoholsucht zu untersuchen - ein wichtiges Merkmal der AUD.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll den Forschern alle Informationen und Ressourcen zur Verfügung stellt, die zur Messung der Ethanolaufnahme bei Ratten in Heimkäfigen erforderlich sind. Wir stellen Optionen für relativ niedrig- und hochaufgelöste Ansätze vor, die den Forschern die Flexibilität geben, die Methode zu wählen, die für ihre Forschungsbedürfnisse am besten geeignet ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kommerziell erhältliche Komponenten			Menge
12-Tasten kapazitiver Touch-Sensor-Breakout (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-polige Kabel passendes Paar (JST XH 2,5 mm Raster)	Adafruit	4872	18
4-polige Steckbrett-Jumper (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
4-poliges Kabel (100 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
4-poliges Kabel (50 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
5V-zu-3V Level-Shifter Breakout	Adafruit	5637	1
Kapazitives Touch-Shield (2,8 Zoll)	Adafruit	1947	1
Kupfer-Leitband (1/4 Zoll)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND
1 Daten Protokollierungsschild	Adafruit	1141	1
Differential I2C Kommunikation Breakout Kit (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Isolierband	DigiKey	3M156004-ND	1
Schrumpfschlauch (3/16Zoll verschiedene Farben)	Kabelbinder und mehr	HS357-S10	6
Schrumpfschlauch Kit (4Zoll schwarz)	Jameco	2095963	1
Lithium-Knopfbatterie (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
M5 Unterlegscheibe	Grainger	54FN66	1
M5 Sechskantmutter	Grainger	6CA72	1
M5 Maschinenschraube (12mm)	Grainger	6GU88	1
M5 Maschinenschraube (25mm)	Grainger	6GU91	2
Stecker/Stecker Überbrückungskabel	Adafruit	1957	1
Mikrocontroller Board (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
PETG Filament (2.85mm silber)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
PLA Filament (2.85mm schwarz)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
PLA Filament (2.85mm silber)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Netzteil (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
SD/microSD Speicherkarte (8GB)	Adafruit	1294	1
Shield Stacking	Header Adafruit	85	1
Solid-Core-Kabel (22AWG rot)	Adafruit	288	1
Litzenkabel (22AWG schwarz)	Adafruit	2976	1
Litzendraht (22AWG rot)	Adafruit	3068	1
Twist Cap Sipper-Röhre mit Kugel	Alternatives Design	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Wasserflasche (8oz)	Alternatives Design	WB8FS	38
Custom 3D-gedruckte Komponenten			Menge
3D-gedruckter Arduino-Gehäuseboden	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
3D-gedruckte Arduino-Gehäuseplatte	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
3D-gedruckter Kabelclip L	N/A	CLIP_L.stl	18
3D-gedruckte Kabelclip-Mutter	N/A	CLIP_Nut.stl	18
3D-gedruckter Kabelclip R	N/A	CLIP_R.stl	18
3D-gedruckter Lickometer-Flaschenhalter	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
3D-gedruckte Lickometer-Kabelbrücke L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
3D-gedruckte Lickometer-Kabelbrücke R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
3D-gedruckte Lickometer-Buchstaben	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
3D-gedruckte Befestigungsschraube	N/A	Befestigungsschraube.stl	4
3D-gedrucktes Sensorgehäuse A unten	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse A oben	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse B unten	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse B oben	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse C unten	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
3D-gedrucktes Sensorgehäuse Buchstaben	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
3D-gedruckter Sipper-Blocker	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
3D-gedruckter Sipper-Blocker-Sockel	N/A	SIPPER_Base.stl	18
3D-gedruckter Sipper-Blocker-Getriebe	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
3D-gedruckte Sipperblocker-Mutter	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
3D-gedruckte Sipperblocker-Schnecke	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Lasergeschnittene Lickometer-Acrylplatte	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19