Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Anwendung organotypischer Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro. Konkret verwendet das beschriebene Modellsystem ein mehrschichtiges orales Epithel, das Mikroorganismen ausgesetzt ist, die mit Biofilmen (Zahnbelag) im Zusammenhang mit Mundgesundheit versus -erkrankung assoziiert sind.

Zusammenfassung

Die Rekapitulation der Wirt-Erreger-Grenzfläche an der epithelialen oder mukosalen Barriere in vitro bleibt eine Herausforderung für Infektionsbiologen. Während selbst gezüchtete 2D-Epithel-Monoschichten die In-vivo-Situation nicht wahrheitsgetreu abbilden, werden kommerziell erhältliche Gewebemodelle aufgrund ihrer Kosten und Praktikabilität oft übersehen. Bei sorgfältiger Planung bieten solche Modelle jedoch reproduzierbare Plattformen für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen. In dieser Arbeit berichten wir über die Verwendung von Epithelmodellen, die für eine Vielzahl von experimentellen Zwecken verwendet werden können, um Wirt-Erreger-Interaktionen in verschiedenen ökologischen Nischen wie der Mundhöhle, der Haut und der Vaginalschleimhaut zu untersuchen. Von einfachen planktonischen Zellen bis hin zu komplexen Biofilm-Cokulturen werden Epithelmodelle verwendet, um die mikrobielle Adhärenz und Invasion zu bewerten und die Wirtsreaktion auf Transkriptions- und/oder Proteinebene zu bewerten, mit Spielraum für ein detaillierteres Profiling unter Verwendung verschiedener Omics-Ansätze. Darüber hinaus können diese biologischen Systeme als genauere Prüfstände für die Bewertung konventioneller und neuartiger antimikrobieller Aktivitäten in einer komplexen Wirt-Erreger-Mikroumgebung in vitro verwendet werden. Die hier beschriebenen Protokolle dokumentieren, wie Modelle bei der Ankunft gehandhabt und im Labor für die Co-Kulturstimulation mit Biofilmgemeinschaften vorbereitet werden. Die Methoden beschreiben, wie experimentelle Ergebnisse aus den Modellsystemen erzielt werden, einschließlich der Verarbeitung des Gewebes, des Co-Kultur-Aufbaus und der Datengenerierung. Diese Experimente umfassen die Expression von Wirtsgenen durch Einzel- und Multiplex-qPCR-Analysen und den Nachweis von Entzündungsproteinen mittels ELISAs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Epithelmodelle nützliche in vitro Systeme für präklinische Untersuchungen zu einfachen oder komplexen Wirt-Pathogen-Interaktionen bieten.

Einleitung

In-vitro-Modellsysteme bieten hervorragende Testumgebungen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Diese organotypischen Systeme zielen darauf ab, die Mikroumgebung verschiedener ökologischer Nischen zu rekapitulieren, die anfällig für mikrobielle Störungen sind. Es wurden eine Reihe von Forschungsartikeln veröffentlicht, in denen EpiSkin-Gewebemodelle (ehemals SkinEthic) verwendet wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen in der Mundhöhle 1,2,3,4,5, der Hautbarriere 6,7,8,9,10,11 und der Vaginalschleimhaut ^5,12,13 zu bewerten , u.a.^14,15. Im Gegensatz zu "zweidimensionalen" oder "2D"-Zellkulturen, die auf der Verwendung von Monoschichten von Epithelzelllinien beruhen, die Mikroorganismen ausgesetzt sind, bestehen diese kommerziell erhältlichen Modelle aus mehreren Schichten differenzierter Zellen, die an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche gezüchtet werden. Obwohl billiger und oft als reproduzierbarer angesehen, sind 2D-Kultursysteme anfällig für zelluläre Schäden, wenn sie mit Mikroorganismen kultiviert werden, was die Epithel- oder Schleimhautbarrieren in vivo nicht immer genau darstellt ^16,17.

Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass "dreidimensionale" oder "3D"-Kultivierungstechniken in verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen immer beliebter werden, darunter Krebswissenschaften, Stammzellforschung und Arzneimittelforschung ^16,18. Im Rahmen der Infektionsbiologie können 3D-Gewebemodelle für Untersuchungen von Wirt-Bakterien-, Pilz- oder Mischtier-Interaktionen an der epithelialen oder mukosalen Barriereschnittstelle innerhalb einer kontrollierten Mikroumgebung in vitro verwendet werden. Diese Modelle bieten viele Vorteile von 2D-Kultursystemen, da sie die Beurteilung der Gewebebesiedlung und/oder -invasion durch pathogene Organismen oder komplexe Biofilmgemeinschaften^{ermöglichen 17} und die Bewertung von Wirtsreaktionen auf Mehrkomponentenebene für verschiedene Biomarker ermöglichen, bei denen 2D-Modelle manchmal durch ihre Transkriptions- oder Proteomikprofile eingeschränkt sind 16,17,18. Letztendlich sind die präklinischen Anwendungen solcher 3D-Systeme umfangreich und liefern wichtige explorative Daten, die in In-vivo-Modelle oder klinische Studien einfließen können.

Im Zusammenhang mit der Mundgesundheit und -erkrankung ist es für Ärzte wichtig, die Entzündungswege an der Oberfläche der Mundschleimhaut zu verstehen, da dies die Behandlungsmodalitäten steuern kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass "gesundheitsassoziierte" Biofilme minimale Entzündungsreaktionen hervorrufen können 3,19,20,21. Dies kann auf eine geringere mikrobielle Keimbelastung zurückzuführen sein, die mit der Mundgesundheit einhergeht, oder auf die Zusammensetzung des Biofilms mit Streptococcus spp., die weithin als immunmodulatorisch angesehen wird^22,23. Auf der anderen Seite sind Biofilme, die aus krankheitsassoziierten Mikroorganismen wie Fusobacterium nucleatum und Porphyromonas gingivalis bestehen, von Natur aus entzündungsfördernd 3,20,24,25,26,27. Ein Review von Mountcastle et al. aus dem Jahr 2020 beschrieb alle relevanten Co-Kulturmodelle, die zu diesem Zeitpunkt für die orale Mikroumgebung existierten¹⁷. Obwohl solche organotypischen Modelle reichlich vorhanden sind, von denen mehrere seit^28,29 hergestellt wurden, gibt es nach wie vor eine Reihe von herausfordernden Hindernissen, die mit der Erstellung solcher 3D-Modelle verbunden sind. Um nur einige zu nennen, müssen diese Modelle erheblich optimiert werden und sind sehr arbeits- und ressourcenintensiv in der Herstellung. Auch die Reproduzierbarkeit kann sehr variabel sein, wenn sie nicht sorgfältig kontrolliert wird^16,17. Kommerziell erhältliche Modelle umgehen solche Probleme und bieten Plattformen für die Untersuchung von Wirt-Krankheitserreger-Interaktionen in der Mundhöhle und in anderen ökologischen Nischen des menschlichen Körpers.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Protokoll darauf abzielt, die Anwendung organotypischer Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen in vitro im Kontext der Mundgesundheit und -erkrankung zu skizzieren. Konkret verwendet das beschriebene Modellsystem ein mehrschichtiges, kommerziell erhältliches orales Epithel, das einer definierten Biofilmgemeinschaft ausgesetzt ist, die für die orale Entzündungserkrankung Gingivitis repräsentativ ist.

Protokoll

Das folgende Protokoll beinhaltet die Herstellung eines für Gingivitis repräsentativen Biofilms mit mehreren Spezies, der insgesamt 7 Spezies (spp.)^7,30 enthält. Drei Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) und Streptococcus oralis (NTCC 11427), sind enthalten, um die Mundgesundheit nachzuahmen und als erste Kolonisatoren des Speichelpellikels zu fungieren. Als nächstes kommen vier anaerobe Mikroorganismen hinzu, die mit dem Übergang von der Mundgesundheit zur Krankheit in Verbindung gebracht werden: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) und zwei Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) und Fusobacterium nucleatum Unterarten (subspp.) vincentii (DSM 19507). Alle Schritte werden aseptisch entweder an der Flamme oder in einer Sicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt. Alle Medien und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die für mikrobiologische Präparate verwendet werden, werden vor der Verwendung autoklaviert, und die Sterilität wird während des Protokolls in regelmäßigen Abständen bewertet. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der mikrobiellen Gemeinschaften für die Co-Kultur

HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt die Bildung eines Biofilms mit mehreren Spezies, der für Konsortien repräsentativ ist, die mit einer Entzündung des Zahnfleischgewebes, auch bekannt als Gingivitis, verbunden sind. Ein solches Modell wurde zur Bewertung der Wirtsreaktion bei Mundgesundheit und -erkrankung verwendet, wie zuvor beschrieben³.

1. Alle drei Streptokokken-Spezies werden auf Blut-Agar-Platten (Columbia Blood Agar Base mit 5 % sterilem defibriertem Pferdeblut) aus gefrorenen Beständen poröser Kügelchen (kommerziell gewonnen), die die Mikroorganismen enthalten, die bei -80 ^°C gelagert werden, wiederbelebt.Dies wird durch die Verwendung einer Impfschlaufe und der Streak-Plate-Technik erreicht.
   1. 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren, dann 3-4 Kolonien für die Vermehrung in 10 ml Trypton-Soja-Bouillon-Medium isolieren. Brühen 16-18 h bei 37 °C und 5 % CO₂ anschwitzen.
2. Bei den intermediären Erregern sind V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum und F. nucleatum subspp. wiederzubeleben. vincentii anaerob auf anspruchsvoller anaerober Agar-Basis mit 5 % sterilem defibriertem Pferdeblut für 48 h bei 37 °C, bevor er weitere 24-48 h unter den gleichen Bedingungen in Schaedler-Bouillon kultiviert wird.
3. Nach dem Wachstum werden die Pelletzellensuspensionen durch Zentrifugation für 5 min, 20 °C bei 3000 x g und dann in 10 mL sterilem PBS (pH 7,2-7,6) gewaschen. Pelletzellensuspensionen erneut durch Zentrifugation für 5 min, 20 °C bei 3000 x g, dann die Waschschritte ein zweites Mal wiederholen. Resuspendieren Sie gewaschene Zellen in 10 mL sterilem PBS zur Standardisierung.
4. Standardisieren Sie alle drei Streptococcus spp. einzeln mit einem Spektralphotometer bei 550 nm. Absorptionswerte von 0,50 (Bereich von 0,45 bis 0,55 akzeptabel) weisen auf eine Zellzahl von ~1 x 10⁸ Zellen/ml hin, wie zuvor mit der Miles- und Misra-Zellzähltechnik^{bestimmt 31}. Um diesen Absorptionswert zu erreichen, verdünnen Sie weitere 10 ml gewaschene Zellsuspensionen in sterilem PBS.
5. Nach der Standardisierung verdünnen Sie alle Streptococcus spp. 1:10 auf 1 x 10⁷ Zellen/ml in einer 1:1-Mischung aus Todd Hewitt Broth (THB) und Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium. Geben Sie 500 μl Zellsuspensionen durch Pipettieren auf eine 24-Well-Mikrotiter-Gewebekulturplatte, die eine Hydroxylapatit-Scheibe mit einem Durchmesser von 13 mm enthält. Lassen Sie die Biofilme 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂ reifen.
   HINWEIS: Multispezies-Biofilme können auf verschiedenen oral relevanten Substraten wie Schmelz, Dentin³² und Poly(methylmethacrylat)-Prothesenoberflächen ^33,34 gezüchtet werden. Für diese Modelle können auch alternative Medien wie künstlicher oder synthetischer Speichel verwendet werden, obwohl je nach den verwendeten Konsortien von Mikroorganismen eine sorgfältige Abwägung angestellt werden sollte: Studien haben gezeigt, dass die Auswahl des Wachstumsmediums wichtige Auswirkungen auf das Wachstum von Biofilmen in gemischten Gemeinschaften hat^35,36.
6. Am nächsten Tag standardisieren Sie die vier anaeroben Mikroorganismen auf ähnliche Weise wie oben beschrieben (Schritte 1.2-1.4). Pelletzellensuspensionen, zweimal waschen, dann V . dispar auf 0,50 Extinktion (Bereich von 0,45-0,55) und die drei restlichen Mikroorganismen auf 0,20 Extinktion (Bereich von 0,18-0,22) standardisieren. Nach der Standardisierung verdünnen Sie alle Suspensionen weiter 1:10 auf 1 x 10⁷ Zellen/ml in einer 1:1-Mischung aus THB und RPMI.
7. Entfernen Sie vorsichtig nicht anhaftende Zellen und verbrauchte Medien und entsorgen Sie sie durch Pipettieren von den Streptokokken-Biofilmen . Ersetzen Sie die Mikrotiterplatten-Wells durch 500 μl standardisierte 1 x 10⁷ Zellen/ml-Suspensionen der vier Anaerobier. Biofilme für 24 h unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C kultivieren.
8. Entfernen Sie nach 24 Stunden nicht anhaftende Zellen und verbrauchte Medien aus den 7-Spezies-Biofilmen und ersetzen Sie sie durch 500 μl sterile 1:1-Mischung aus THB:RPMI-Medien. Biofilme werden 4 Tage lang anaerob bei 37 °C reifen gelassen, wobei die Medien täglich entfernt und aufgefüllt werden (insgesamt vier Medienwechsel).
9. An Tag 7 ist der Multispezies-Biofilm voll ausgereift und bereit für nachgelagerte Experimente. Waschen Sie Biofilme zweimal mit 500 μl sterilem PBS für die Verwendung in Co-Kulturen.
   HINWEIS: Biofilme können mit einer Reihe biologischer Methoden profiliert werden, wie z. B. qPCR (zur Bewertung der Zusammensetzung) und mikroskopisches Profiling mit konfokaler oder Elektronenmikroskopie, wie zuvor beschrieben³.

2. Organotypisches Gewebehandling und Versuchsaufbau

HINWEIS: Der unten beschriebene Versuchsaufbau umfasst humanes orales Epithel (HOE)-Gewebe, das aus TR146-Zellen besteht, die auf einem inerten Polycarbonat-Membranfilter kultiviert werden. Es gibt weitere Modelle, darunter Epidermismodelle, Blasen-, Speiseröhren-, Hornhaut-, Gingival- und Vaginalepithele. Alle Modelle werden in einer ähnlichen Weise wie die unten beschriebene gehandhabt und vorbereitet, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

1. Packen Sie bei der Ankunft HOE-Gewebe und -Medien aus und übergeben Sie sie in einen Sicherheitsschrank der Klasse II. Geben Sie insgesamt 1 ml des mit dem Gewebe gelieferten Erhaltungsmediums auf 12-Well-Platten.
2. Entfernen Sie Polycarbonat-Einsätze, die die HOE enthalten, mit einer sterilen Pinzette von den 24-Well-Platten und dem Nähragar, die für den Versand verwendet werden, und übertragen Sie sie auf die 12-Well-Platten mit dem Medium, wobei Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen unter dem Gewebe verbleiben. Stellen Sie sicher, dass überschüssiger Agar, der an den Seiten oder an der Unterseite der Einsätze haftet, vorsichtig mit einer zusätzlichen Pinzette oder Seidenpapier entfernt wird.
3. Inkubieren Sie Gewebemodelle vor dem Versuchsaufbau 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ , um sich nach dem Versand an die Laborbedingungen zu gewöhnen. Bemerkenswert ist, dass zusätzliche Erhaltungsmedien oder Wachstumsmedien für eine längere Erhaltung oder weitere Reifung der Gewebemodelle zur Verfügung stehen.
4. Nun können Co-Kultur-Experimente durchgeführt werden. Für das hier gegebene Beispiel entfernen Sie die 7-Spezies-Biofilme, die wie oben (Schritte 1.1-1.9) erstellt wurden, durch Beschallung von ihren Substraten. Um dies zu erreichen, entfernen Sie HA-Discs, die Biofilme enthalten, mit einer 19-G-Nadel und einer Pinzette vom Boden der 24-Well-Platten und übertragen Sie dann ein Bijoux mit 1 ml sterilem Dulbecco's PBS. Beschallung bei 35 kHz für 10 min in einem Beschallungswasserbad.
5. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette die Einsätze mit den Gewebemodellen aus der nächtlichen Akklimatisation und geben Sie 100 μl Biofilm-Sonicat-Suspension durch Pipettieren direkt in das Gewebe. Verwenden Sie nicht stimuliertes Kontrollgewebe zu Vergleichszwecken. Für diese Kontrollgewebeeinlagen werden 100 μl steriles Dulbecco's PBS ohne Biofilmsuspension zugegeben.
   HINWEIS: Planktonzellen, verbrauchte Biofilmüberstände, die dispergierte Zellen enthalten, oder ganze Biofilme können anstelle von Biofilm-Sonicat für das Co-Kultur-Modell verwendet werden. Verschiedene Anwendungen für diese Wirt-Pathogen-Modelle mit unterschiedlichen mikrobiellen Stimulanzien sind in Abbildung 1 schematisiert, wie an anderer Stelle^dokumentiert 3,5,6,8,13,37,38.
6. Übertragen Sie die Einsätze nach der Zugabe auf eine weitere 12-Well-Platte mit 1 ml frischem Pflegemedium, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter den Einsätzen vorhanden sind. Inkubieren Sie Platten mit Gewebemodellen für 24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ vor der Gewebeverarbeitung für nachgelagerte Anwendungen.
   HINWEIS: Gewebelieferanten können zusätzliche Medien zur Verfügung stellen, um die kontinuierliche Kultivierung des Gewebes nach der Exposition gegenüber beschallten Aggregaten oder Biofilmen zu unterstützen. Zu diesem Zweck wurden mehrere frühere Modelle veröffentlicht, die eine verlängerte Gewebe-Biofilm-Inokulation untersuchten 21,28,39. Um ähnliche Ergebnisse mit dem aktuellen organotypischen Modell zu erzielen, beschallen Sie das Gewebe (wie oben, Schritt 2.6) und lassen Sie die Mikroorganismen 24 Stunden lang anhaften. Verwerfen Sie die verbleibende mikrobielle Suspension und setzen Sie die Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für den erforderlichen Versuchszeitraum fort.

3. Gewebeaufbereitung für experimentelle Ergebnisse

HINWEIS: Nach der Co-Kultur werden Gewebemodelle für experimentelle Ergebnisse verarbeitet. Die folgenden Schritte dokumentieren, wie RNA aus dem Gewebe für die transkriptionelle Profilerstellung extrahiert wird und wie verbrauchte Gewebemedien für den Proteinnachweis verwendet werden. Das Gewebe kann auch in Formalin, Paraformaldehyd oder einem ähnlichen Fixiermittel für die histologische Beurteilung fixiert werden, wie zuvor beschrieben ^3,6.

1. Bereiten Sie zunächst 350 μl RLT-Lysepuffer in 2,0-ml-O-Ring-Röhrchen mit Schraubverschluss vor, die 1 % β-Mercaptoethanol und ~100 μl Äquivalent von 0,5 mm säuregewaschenen Glaskügelchen enthalten.
2. Entfernen Sie die Einsätze, die das Gewebe enthalten, mit einer Pinzette vom Medium und entsorgen Sie alle verbleibenden mikrobiellen Suspensionen aus dem Einsatz. Halten Sie es dann umgekehrt auf Augenhöhe, um es einfacher zu machen. Schneiden Sie mit einer 19-G-Nadel das Gewebe und die Membran vorsichtig von der Unterseite des Einsatzes ab und geben Sie es in den RLT-Puffer.
   1. Homogenisieren Sie das Gewebe bei 30 s mit einem Tisch-Bead-Beater-Homogenisator und extrahieren Sie dann RNA aus dem Lysat gemäß den Anweisungen des Herstellers im RNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Extrahierte RNA wird für die cDNA-Synthese verwendet, um die Expression von Zytokin- und Chemokin-Genen als Entzündungsmarker mittels quantitativer PCR (qPCR) oder RNA-Sequenzierung zu profilieren. Die qPCR wird unter Verwendung von Multiplex-Arrays wie dem RT₂ PCR-Profiler-Array mit Wells mit vorgefertigten Primern für bestimmte Gene oder SYBR-Green-basierten Reagenzien mit intern entwickelten Primersequenzen und nukleasefreiem ddH₂O³ erreicht.
3. Sammeln Sie die verbleibenden verbrauchten Gewebemedien (~850-900 μl) für Proteomanalysen mit Nieder- und Hochdurchsatzmethoden wie ELISAs, Multiplex-Immunoassays oder Multiplex-Protein-Biomarker-Analysen⁷.
4. Beurteilen Sie unter Verwendung der verbrauchten Gewebemedien eine Reihe von Markern, die mit Entzündungen auf Proteinebene assoziiert sind. Verbrauchte Medien können direkt für die oben genannten Methoden (Schritt 3.3) verwendet oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen des Mediums für solche Analysen.
   HINWEIS: Das Medium muss je nach Gewebestimulans möglicherweise 1:10 verdünnt werden, um ein genaues proteomisches Profiling mit ELISAs zu ermöglichen.

Ergebnisse

In diesem Experiment wurde die HOE einem 7-Spezies-Biofilm-Ultraschallat ausgesetzt, das Organismen enthielt, die für die Verschiebung von der Mundgesundheit zur Entzündung des Zahnfleisches (bekannt als Gingivitis) repräsentativ sind. Diese Krankheit entsteht durch eine Entzündung des Zahnfleisch- oder Mundepithelgewebes aufgrund mikrobieller Störungen durch Zahnbelagbildung auf der Zahnoberfläche. Nach der Stimulation werden Gewebe und verbrauchte Medien für transkriptionelle und proteomische Analysen verwendet, wie oben diskutiert. Für dieses Experiment wurde die Genexpression einer Reihe von Entzündungsbiomarkern im Gewebe nach der Stimulation mit Biofilm-Sonicat nachgewiesen (Abbildung 2). Dies wurde durch die Verwendung eines speziell angefertigten RT₂ PCR-Profiler-Arrays mit 16 verschiedenen Genen erreicht, und die Genexpression wurde als Faltenänderung im Vergleich zu unstimuliertem Gewebe nach Normalisierung auf das Housekeeping-Gen GAPDH gezeigt. Die mikrobielle Stimulation erhöhte die Expression aller Gene mit Ausnahme von CXCL5, wobei statistische Unterschiede für NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B und TLR4 zu beobachten waren (Abbildung 2A). Die größte Faltungsänderung wurde für CCL2, CXCL1 und CSF3 mit einem Anstieg von 16,9, 10,3 bzw. 15,1 beobachtet (Abbildung 2B).

Verbrauchte HOE-Medien wurden für proteomische Analysen verwendet, um Proteine zu erkennen, die vom Gewebe nach der Stimulation produziert und freigesetzt werden. Dies ist nützlich, um festzustellen, ob die Genexpression mit der Proteinproduktion korreliert. Zu diesem Zweck wurden die IL8-Genexpression und die IL-8-Proteinfreisetzung in Kontrollgewebe und Biofilm-sonicat-stimuliertem Gewebe untersucht (Abbildung 3). Die Genexpression wurde mittels SYBR-green-basierter qPCR mit Primern für IL8 und GAPDH wie zuvor beschrieben bestimmt³. Die IL8-mRNA-Expression in HOE war nach Stimulation mit Biofilm-Sonicat um das 8,67-fache erhöht (Abbildung 3A). Auf Proteinebene wurden die IL-8-Spiegel mit einem IL-8-ELISA-Kit quantifiziert. Die Konzentration von IL-8 in verbrauchten Medien wurde von ~1,005 ng/ml im Kontrollgewebe auf ~4,245 ng/ml in Biofilm-sonicat-stimuliertem Gewebe erhöht (Abbildung 3B).

Abbildung 1: Unterschiedliche Anwendungen für organotypische Gewebe-Co-Kulturmodelle. Standardisierte Suspensionen von Mikroorganismen werden direkt auf das Gewebe aufgebracht, um Spezies-Wirt-Interaktionen zu untersuchen (A). Diese werden häufig zur Beurteilung der mikrobiellen Besiedlung über einen kurzen Zeitraum (z. B. <24 h) verwendet. Komplexe Biofilme werden beschallt, um die Auswirkungen von dispergierten Zellen oder Biofilmaggregaten auf das Gewebe zu untersuchen (B). Dies ist wichtig, da bereits gezeigt wurde, dass solche Zellen im Vergleich zu Plankton- oder Biofilm-Gegenstücken einzigartige Phänotypen aufweisen. Zu diesem Zweck können intakte Biofilme mit zusätzlichen kleineren Inserts direkt in das Gewebe eingebracht werden, um eine benachbarte Exposition mit dem Wirt (C) zu erzeugen. Schließlich werden planktonische Zellen in geeigneten Nährmedien in das Gewebe gegeben, um die mikrobielle Besiedlung, die Biofilmbildung und die Wachstumsdynamik auf dem Gewebe zu beurteilen (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Genexpression von HOE-Gewebe nach Stimulation mit 7-Spezies-Biofilm-Sonicat. mRNA-Expressionsfaltenänderung von insgesamt 15 Entzündungsgenen, die auf das Housekeeping-Gen, GAPDH , normalisiert wurden, in kontrollierten, nicht stimulierten Proben und solchen, die 100 μL 7-Spezies-Biofilm-Sonicat (A) ausgesetzt waren. Die drei Gene (CCL2, CXCL1, CSF3) mit den höchsten Veränderungen in der mRNA-Expression sind in (B) dargestellt. Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung eines parametrischen ungepaarten T-Tests durchgeführt, wobei signifikante Änderungen als *p < 0,05, **p < 0,01 bzw. ***p < 0,001 dargestellt wurden. Die Daten wurden mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware grafisch dargestellt und analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: IL8-Genexpression und IL-8-Proteinspiegel, die vom HOE-Gewebe produziert werden. mRNA-Expressionsfaltenänderung: Veränderung von IL8 in HOE-Gewebe, bestimmt durch SYBR-grün-basierte qPCR (A) und IL-8-Proteinspiegel, quantifiziert aus verbrauchten Gewebemedien unter Verwendung der ELISA-Methodik (B). Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung eines parametrischen ungepaarten T-Tests durchgeführt, wobei signifikante Änderungen als *p < 0,05 bzw. ****p < 0,0001 dargestellt wurden. Die Daten wurden mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware grafisch dargestellt und analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Hier werden Methoden beschrieben, um ein komplexes Multispezies-Biofilmmodell zu erstellen, das für die Gingivitis repräsentativ ist, für die Co-Kultivierung mit HOE-Gewebe, um die Wirtsreaktion nach mikrobieller Stimulation zu bewerten. Dieses Protokoll kann für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zwischen Planktonzellen, Einzel-, Doppel- oder Mischtier-Biofilmen oder Biofilm-dispergierten Zellen mit Epithelgewebe aus verschiedenen ökologischen Nischen im menschlichen Körper angepasst werden. Die Verwendung von Gewebemodellen zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen stellt einen wichtigen Fortschritt gegenüber früheren Co-Kultursystemen dar, die auf 2D-Monoschichten beschränkt sind, die die in vivo-Situation nicht immer wirklich rekapitulieren, wobei Epithelgewebe mehrere Zellschichten enthält 16,17,18. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Herausforderungen, die mit dem In-vitro-Wachstum von mehrschichtigen Gewebemodellen verbunden sind, da mehrere Zelllinien verwendet werden und/oder Zellschichten an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wachsen, die anfällig für Kontaminationen ist. Die kommerziell erhältlichen Gewebe bieten eine reproduzierbare Plattform mit gleichbleibend hochwertigen Modellen, die zwischen Replikaten und Chargen vergleichbar sind, wie in früheren Publikationen^{gezeigt wurde 3,7}.

Für den Abschnitt "Vorbereitung mikrobieller Gemeinschaften für die Co-Kultur" wurde die Einbeziehung dieser Mikroorganismen für das 7-Spezies-Gingivitis-Modell auf der Grundlage gemeinsam identifizierter Kommensalen und Krankheitserreger ausgewählt, die mit dem Übergang von der Mundgesundheit zur Krankheit verbunden sind. Wie bei allen komplexen Biofilm-Modellsystemen in vitro wird die Einbeziehung von Mikroorganismen durch Mikrobiomstudien gesteuert, die sich auf die jeweilige gesunde oder kranke ökologische Nische beziehen. Zu diesem Zweck haben wir und andere über die Verwendung eines Mundgesundheits-assoziierten Biofilmmodells berichtet, das kommensale Mikroorganismen (z. B. Streptococcus und Rothia spp.) enthält.^3,40,41. Darüber hinaus können diese Modelle um weitere Krankheitserreger ergänzt werden, um Biofilme zu erzeugen, die mit anderen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Zum Beispiel können drei Mikroorganismen zu den hier beschriebenen 7 Spezies hinzugefügt werden, um ein Krankheitsmodell zu erstellen, das mit Parodontitis assoziiert ist³, während der Pilzerreger Candida albicans hinzugefügt werden kann, um die Polymikrobialität zu erhöhen und eine Schicht der Komplexität zwischen den Reichen^{hinzuzufügen 33}. In der Tat kann die Förderung von Pilz-Bakterien-Interaktionen enorme Auswirkungen auf verschiedene experimentelle Ergebnisse haben, die mit solchen Biofilmmodellen in vitro im Vergleich zu rein bakteriellen Biofilmen durchgeführt werden⁴². Letztendlich wird dringend empfohlen, bei der Erstellung eines neuen Multispezies-Biofilmmodells für solche Studien sorgfältig zu überlegen. Während die eingeschlossenen Mikroorganismen durch umfangreiche Literaturrecherchen leicht identifizierbar sein sollten, lassen sie sich für die meisten Nischen und/oder Krankheiten aus verschiedenen Gründen möglicherweise nicht gut in ein komplexes In-vitro-Modell integrieren. Im Folgenden werden einige weitere mögliche Überlegungen dargestellt, die angestellt werden sollten:

Dynamik der Biofilmbildung
Die Biofilmbildung in vivo beinhaltet oft eine frühe, mittlere und späte Besiedlung durch bestimmte Mikroorganismen. Die supra- und subgingivale Zahnbelagbildung ist stark gekennzeichnet durch die anfängliche Anheftung des Speichelpellikels, die von Pionierspezies (z. B. Streptokokken-Spezies ) auf dem Zahnschmelz gefunden wird, wobei intermediäre und spätere Krankheitserreger diese als Gerüst für die Besiedlung benötigen⁴³. Ein ähnliches Phänomen wurde in der vaginalen Umgebung während der bakteriellen Vaginose vorgeschlagen, wobei man annimmt, dass Gardnerella vaginalis der erste Kolonisator ist, gefolgt von nachfolgenden Anaerobiern⁴⁴. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dies bei anderen Krankheiten in anderen ökologischen Nischen möglicherweise nicht der Fall ist.

Aussaatdichte für jeden Mikroorganismus
Mikroorganismen haben eine unterschiedliche Größe und/oder Wachstumsdynamik, wenn sie in vitro kultiviert werden; Daher ist es wichtig, dies während des Standardisierungsprozesses zu berücksichtigen. Zum Beispiel ist C. albicans 100-150 mal so groß wie Bakterienzellen^45,46, daher kann es eine Zugabe in einer niedrigeren Konzentration, z. B. 1 x 10⁶ Zellen/ml, zu solchen Biofilmmodellen rechtfertigen.

Antagonismus der Arten
Einige Mikroorganismen (einschließlich derselben Spezies, aber unterschiedlicher Isolate, Labor- und/oder klinischer Stämme), die für diese Modelle verwendet werden, können während der Biofilmbildung mit anderen konkurrieren, was zu einer Hemmung des Wachstums einiger mikrobieller Spezies führt⁴⁷. Eine Studie von Sadiq et al. hob hervor, wie verschiedene Kombinationen von Mikroorganismen die Biofilmbiomasse beeinflussen können, die sich aus mikrobieller Synergie (oder Antagonismus) ^ergibt48. Obwohl die Untersuchung solcher Wechselwirkungen innerhalb eines Biofilmmodells für Forschungsgruppen von Interesse sein kann (z. B. bei der Erprobung einer prä- oder probiotischen Behandlung), berücksichtigen andere möglicherweise keinen solchen Antagonismus, was sich bei der Erstellung des Modells auf die Komplexität mehrerer Spezies auswirken könnte.

Dauer der Biofilmreifung
Es ist von entscheidender Bedeutung, die Zeitrahmen für die Biofilmreifung zu optimieren, da dies von der Wachstumsdynamik der eingeschlossenen Mikroorganismen und dem für die Kultur verwendeten Modellsystem (einschließlich Substraten) abhängen kann. Längere Reifezeiten könnten zu einer besseren Besiedlung für spätere Erreger, aber zu mehr Zelltod innerhalb der Modelle, insbesondere der früheren Kolonisatoren, führen. Umgekehrt könnten kürzere Inkubationszeiten wichtig sein, wenn man die Auswirkungen unreifer Biofilmmodelle auf den Wirt untersuchen möchte. Eine Studie von Brown et al. beschrieb, dass das gleiche 10-Spezies-Wundbiofilmmodell in menschlichen THP-1-Zellen unterschiedliche Entzündungsprofile aufwies, wenn es 24 h, 48 h und 72 h reifte, was darauf hindeutet, dass je weniger reif der Biofilm ist, desto entzündungsfördernder ist^{er 7}. Ähnliche Ergebnisse konnten in mehrschichtigen Gewebemodellen beobachtet werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass regelmäßige tägliche Medienwechsel eine Notwendigkeit sind, um den Zelltod im Biofilm zu minimieren, obwohl dies je nach laufenden Behandlungsschemata geändert werden kann, z. B. bei der Beurteilung der Auswirkungen längerer antimikrobieller Interventionen.

Für den Bereich "Organotypisches Gewebehandling, Versuchsaufbau und Gewebeverarbeitung" können die Inkubationszeiträume entsprechend den Bedürfnissen des Forschers angepasst werden. Wirt-Erreger-Interaktionen können je nach Fragestellung zu früheren Zeitpunkten, z.B. 1-12 h, bis zu späteren Zeitpunkten von 48 h und 72 h untersucht werden. Zweitens werden alle Wartungsmedien, die Antibiotika enthalten, mitgeliefert; Daher müssen bei der Bestellung Anfragen an das Unternehmen gestellt werden, um diese je nach Versuchsdesign zu entfernen. Obwohl das Medium unter dem Einsatz nicht in direkten Kontakt mit der oberen Peripherie des Gewebes kommt, kann die Entfernung von Antibiotika bei der Untersuchung der mikrobiellen Invasion in das Gewebe in Betracht gezogen werden, es sei denn, es wird eine Wunde im Modell ^6,8 zugefügt.

Das mikrobielle Material, das für die Co-Kulturstimulation verwendet wird, kann, wie oben erörtert, auch verändert werden, mit dem Umfang, planktonische, verbrauchte Biofilmüberstände (gefiltert und ungefiltert), ganze Biofilme oder Biofilm-Ultraschallinkubationen mit dem Gewebe zu bewerten. So haben frühere Erkenntnisse gezeigt, dass Gewebemodelle wie die von EpiSkin nützlichen Modelle für die Untersuchung planktonischer Pilz-Wirt-Interaktionen liefern: Es wurde gezeigt, dass C. albicans-, Candida auris-, Malassezia furfur- und Trichophyton rubrum-Zellen sich an periphere Gewebeschichten in HOE, rekonstruierter menschlicher Epidermis (RHE) oder humanem Vaginalepithel anheften und mit ihnen interagieren, wobei einige dieser Studien die Stimulation einer Wirtsreaktion zeigen nach Pilzinfektion 1,5,6,11,12,49. Ähnliche Veröffentlichungen existieren für Bakterien-Wirt-Interaktionen, z. B. wurde die Biofilmbildung von Cutibacterium acnes, einem häufigen Erreger, der mit der Kopfhautmikrobiota bei Schuppen in Verbindung gebracht wird, auf der Oberfläche von RHE untersucht, wenn es allein und mit dem Hautpilzorganismus Malassezia restricta kultiviert wurde ¹⁰. Andere haben die Fähigkeit von Staphylococcus spp. untersucht, an RHE zu binden, indem sie die physikalisch-chemischen und mikrobiologischen Eigenschaften dieser Bakterien-Wirt-Interaktion gemessen^{haben 50}. N'Diaye und die Co-Autoren untersuchten, wie das vom Menschen stammende Neuropeptid, das Calcitonin Gene-Related Peptide, die Virulenz von Staphylococcus aureus im RHE-Gewebemodell beeinflusste⁵¹. Andere haben die schützende Wirkung probiotischer Interventionen auf die Infektion mit Pseudomonas aeruginosa des menschlichen Hornhautepithels^{untersucht 14}. In der Zwischenzeit haben verschiedene Gruppen aus polymikrobieller Sicht die Auswirkungen von gemischten Biofilmen auf verschiedene Gewebesubstrate untersucht 2,3,7,13.

Insgesamt dokumentieren diese oben genannten Protokolle und Studien die breite Palette von Anwendungen für organotypische Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Obwohl Studien gezeigt haben, dass EpiSkin-Modelle, insbesondere das RHE-Hautmodell, eine gute Anwendbarkeit für die Prüfung kosmetischer Produkte auf Korrosion/Reizung aufweisen 52,53,54,55, bestehen jedoch einige Einschränkungen zwischen diesen und realen Ex-vivo-Gewebeexplantaten oder anderen Anbietern von kommerziell erhältlichem Gewebe^56,57. Eine offensichtliche Einschränkung wäre, dass alle kommerziell erhältlichen Gewebemodelle aus Zelllinien in einer sterilen, "keimfreien" Umgebung erzeugt werden, was bedeutet, dass das Gewebe niemals mikrobiellen Störungen ausgesetzt war: Dies kann jede Entzündungsreaktion im Wirt verschlimmern, weit über das hinaus, was in vivo oder nach Stimulation von ex vivo-Gewebeexplantaten zu beobachten wäre⁵⁷. Umgekehrt enthalten diese Labormodellsysteme keine darunter liegenden Bindeschichten oder Gefäße, die man mit In-vivo-Gewebe in Verbindung bringen würde, Eigenschaften, die bei der Explantation von Explantation von Ex-vivo-Gewebe erhalten bleiben können, und Merkmale, die Entzündungsreaktionen beeinflussen. In einer kürzlich durchgeführten systematischen Übersichtsarbeit wurde hervorgehoben, dass sorgfältig erwogen werden sollte, Gewebemodelle mit geeigneten Gefäßen zu verwenden, die unter Verwendung verschiedener technischer Technologien, einschließlich Biomaterialien, hergestellt wurden⁵⁸. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde beispielsweise eine Fibrin-basierte Matrix verwendet, die in Zahnfleischfibroblasten und mikrovaskuläre Endothelzellen eingebettet ist, um ein vaskularisiertes Zahnfleischäquivalent zu schaffen. Die Autoren beschrieben eine differentielle Entzündungsreaktion im Modell nach Exposition gegenüber gesundheitlichen oder krankheitsassoziierten Mikroorganismen⁵⁹. Aus kommerzieller Sicht gibt es inzwischen komplexere Modelle, wie z. B. das "T-Skin-Modell", das ein Gewebe in voller Dicke enthält, das aus einer Dermis besteht, die aus Fibroblasten besteht, die mit der Epidermis überlagert sind. Es wäre interessant zu sehen, wie sich solche komplexen Modelle im Vergleich zu den reinen Epidermis-Systemen vergleichen lassen.

Obwohl kein Modell perfekt ist, stellen organotypische Gewebemodelle vielversprechende Alternativen für präklinische Tests dar, die mit dem von den drei R's skizzierten Rahmen für Replacement, Reduction und Refinement in der Tierforschung übereinstimmen. Zu diesem Zweck liefern Tiermodelle zwar wichtige Einblicke in die komplexe pathophysiologische Natur von Biofilm-bedingten menschlichen Krankheiten, haben aber offensichtliche Nachteile. Diese 3D-Modelle sind leicht manipulierbar und ermöglichen große, subtile Änderungen an Untersuchungen ohne ethische Genehmigung. Die Kombination dieser Modelle mit bestehenden komplexen Biofilmsystemen, die oben beschrieben wurden, kann unser Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen erheblich verbessern und den Erfolg neuartiger Therapien vor in vivo-Untersuchungen besser vorhersagen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
13 mm Hydroxylapatit (HA) Scheiben	Plasma Biotal Limited	n/a (auf Bestellung)	Substrat für die Bildung von oralen Biofilmen, das die Zahnoberfläche nachahmt
19 G Nadel (40 mm)	VWR	613-2028	Wird verwendet, um bei der Entfernung von HA-Scheiben von Platten zu helfen und Gewebe aus Einsätzen von Einsätzen:
24 gut TC-behandelte Mikrotiterplatten mit flachem Boden und Deckeln	Wissenschaftliches Laborzubehör	3524 (Packung à 100)	Platten für die Kultivierung von Biofilmen und Gewebe-Co-Kulturexperimenten
Säuregewaschene Glasperlen (425-600 μ m)	Merck: Sigma-Aldrich	G8772	Für die Gewebelyse zur Verbesserung der Ausbeute bei der RNA-Extraktion
Actinomyces naeslundii DSM 17233	Leibniz-Institut DSMZ	n/a	Einer der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell
Bead Mill 24 Homogenizer (oder gleichwertig) verwendet werden	Fisher Scientific	15-340-163	Für die Gewebelyse zur Verbesserung der Ausbeute bei der RNA-Extraktion
Bijouxe  (7 ml)	Greiner Bio-One	189170 (700 pro Beutel)	Wird für die Biofilmbeschallung verwendet
cDNA-Synthesekit (hohe Kapazität)	Thermo Fisher	Scientific 4368814 (für 200 Reaktionen)	cDNA-Synthese aus Gewebe-RNA-Columbia-Blutagar
(CBA)-Basis	Thermo Fisher	Scientific CM0331B (für 500 Gramm)	Zur Vorbereitung von CBA-Platten für die Kultivierung aerober Mikroorganismen
Defibriniertes Pferdeblut	E& O Laboratories	DHB	Zur Ergänzung von CBA- und FAA-Platten zur Kultivierung von aeroben und anaeroben Mikroorganismen
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (dPBS: ohne CaCl2 und MgCl2)	Merck: Sigma-Aldrich	DB537	dPBS für die Zellco-Kultur mit Biofilm-Sonicat
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	American Type Culture Collection	n/a	Einer der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) verwendet werden, vincentii DSM 19507	Leibniz-Institut DSMZ	n/a	Einer der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell
verwendet werden GraphPad Prism (Version 10)	GraphPad Software, Inc	n/a	Für die Erstellung von Graphen und Datenanalysen
IL-8 ELISA-Kit für den Menschen (unbeschichtetes ELISA-Kit mit Platten)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (für 10 x 96 Tests)	ELISA-Kit und Platten für die Proteinbewertung von verbrauchten Gewebemedien
Orales Epithel (HOE) beim Menschen...	Episkin	n/a (made to order)	Das Epithelgewebe, das für das Co-Kultur-Modellsystem verwendet
wird Impfschleifen (Einweg, 10 & Mikro; L oder gleichwertig)	Fisher Scientific	12870155 (Packung mit 1000 Stück)	Für mikrobiologische Kulturen in festen und flüssigen Medien
MicroAmp Fast Reaction 96-Well-qPCR-Platten (0,1 mL)	Thermo Fisher Scientific	4346907 (für 10 Platten)	Für die qPCR-Genexpressionsprofilierung von Gewebe
Mikrobank-Kügelchen	Pro-Lab Diagnostics	PL.170	Lagerung und Cyrokonservierung von Mikroorganismen
Nukleasefreies Wasser	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1,5 mL)	RT-PCR-Wasser für qPCR-Experimente
Petrischalen (90 mm)	Fisher Scientific (Sterilin)	11309283 (Packung mit 500 Stück)	Zur Herstellung von Agarplatten für die mikrobielle
Kultur Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014 (Packung mit 100 Tabletten)	PBS für die Standardisierung von Mikroorganismen und die Waschschritte von Biofilmen
Rneasy Mini-Kit	Qiagen	74106 (für 250 Reaktionen)	Säulenbasiertes RNA-Extraktionskit für Gewebe
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium	Merck: Sigma-Aldrich	R7755-10L (für 10 L)	Medien für die Biofilmkultur
RT2-Profiler-Array	Qiagen	330171 (kundenspezifisch)	qPCR-Array mit vorgefertigten Primern für die Erstellung von Genexpressionsprofilen
Schaedler anaerobe Agar-Basis	Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (für 500 g)	Zur Herstellung von anspruchsvollen anaeroben Agarplatten
Schaedler anaerobe Brühe	Thermo Fisher Scientific	CM0497B (für 500 g)	Flüssigmedium für das Wachstum von anaeroben Mikroorganismen
Beadbug O-Ring-Tube mit Schraubverschluss	Wissenschaftliches Laborzubehör	Z763837-1000EA (Packung mit 1000 Stück)	Zur Verwendung in einem Homogenisator der Bead Mill 24, zur Lyse
Gewebe Beschallungsbad	Fisher Scientific (Fisherbrand)	n/a	Für die Beschallung von Biofilmen aus HA-Scheiben
Streptococcus intermedius DSM 20753	Leibniz-Institut DSMZ	n/a	Einer der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell
Streptococcus mitis verwendet werden NCTC 12261	National Collection of Type Cultures	n/a	Einer der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell
Streptococcus oralis NTCC 11427	National Collection of Type Cultures	n/a	Einer der verwendeten Mikroorganismen für das komplexe Biofilmmodell
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix für qPCR
Todd Hewitt Bouillon	Merck: Sigma-Aldrich	T1438	Medien für die Biofilmkultur
Trypton-Sojabrühe (TSB) Medium	Merck: Sigma-Aldrich	22092 (für 500 g)	Flüssiges Medium für die Züchtung aerober Mikroorganismen
Pinzette (150 mm, Edelstahl, gezahnt)	RS-Pro	545-187	Zum Bewegen von HA-Scheiben und Gewebeeinlagen/Gewebeextrakten
Universalschläuche (30 ml)	Greiner Bio-One	201150 (400 pro Beutel)	Gefäße zur Kultivierung von Mikroorganismen in Flüssigkultur
Veillonella dispar NCTC 11831	National Collection of Type Cultures	n/a'Einer	der Mikroorganismen, die für das komplexe Biofilmmodell verwendet
β-Metakapthoethanol	Merck: Sigma-Aldrich	M3148	RNase-Deaktivierung in Gewebeproben