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Methodenartikel

Beurteilung der Eisenablagerung im Gehirn von 5xFAD-Mäusen durch Perls'/DAB-Färbung

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DOI:

10.3791/67501

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23. Mai 2025

 ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology, NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Narcotic and Psychotropic Drugs, School of Anesthesiology, Xuzhou Medical University, 2Department of Anesthesiology, the Eye & ENT Hospital of Fudan University Shanghai, 3Department of Anesthesiology, Shanghai Tenth People's Hospital, Tongji University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Beurteilung der Verteilung und Menge der Eisenablagerung in Geweben, insbesondere im Gehirn, vor. Das Protokoll beschreibt die Verfahren für die Probenvorbereitung, die Perls/DAB-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.

Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit (AD), eine häufige neurodegenerative Erkrankung, ist die Hauptursache für Demenz bei älteren Menschen. Die Eisenablagerung ist eng mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit verbunden. Im AD-Gehirn korrelieren erhöhte Eisenspiegel stark mit charakteristischen AD-Pathologien, einschließlich β-Amyloid-Plaques, Tau-Neurofibrillentangles und Apoptose. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass oxidativer Stress aufgrund eines fehlregulierten Eisenstoffwechsels eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der Alzheimer-Krankheit spielt. Das Verständnis der Rolle der Eisenakkumulation in der Pathologie der AD ist daher entscheidend für die Behandlung von AD. Ein umfassendes Eisenfärbeprotokoll ist unerlässlich, um die Eisenexpression und -verteilung im Gehirn zu erkennen. Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Beurteilung der Menge und Verteilung der Eisenablagerung im Gehirn zu beschreiben. Wir beschreiben die Prozesse bei der Reagenzienvorbereitung, der Mausbehandlung und der Vorbereitung von Hirnschnitten. Darüber hinaus präsentieren wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für den histochemischen Eisennachweis in zerebralen Gewebeschnitten, begleitet von einem systematischen analytischen Rahmen, der sowohl die quantitative als auch die morphologische Bewertung integriert, um eine umfassende Interpretation der Färbeergebnisse zu gewährleisten. Dieses experimentelle Protokoll wird den Forschern helfen, Eisenablagerungen im Gehirn zu verstehen und die Alzheimer-Forschung zu unterstützen.

Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung und hat sich zu einem ernsthaften Problem für die Gesellschaft entwickelt. Die Prävalenz von AD nimmt mit dem Altervon 1,2,3,4 Jahren dramatisch zu. Zu den primären pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) gehören die Ablagerung von β-Amyloid (Aβ)-Plaques und neurofibrillären Tangles (NFTs) aufgrund einer aberranten Phosphorylierung von Tau-Proteinen. Aβ wird durch die sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase-Enzyme erzeugt. Eine Dysregulation der Aβ-Produktion oder -Clearance führt zu einer Akkumulation im Gehirn und zur Bildung von Amyloid-Plaques, die als einer der frühesten pathologischen Marker der Alzheimer-Krankheit gelten. Diese Plaques verursachen nicht nur direkte neuronale Schäden, sondern lösen auch eine Kaskade schädlicher Effekte aus, darunter Neuroinflammation, oxidativer Stress und synaptische Dysfunktion. Zusammengenommen tragen diese Prozesse zum neuronalen Tod und dem fortschreitenden kognitiven Verfall bei, der in5 n. Chr. beobachtet wurde. Trotz jahrzehntelanger Forschung, die sich hauptsächlich auf die pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) konzentriert, einschließlich der Ablagerung von Amyloid-β-Plaques und der hyperphosphorylierten Tau-Proteinaggregation, sind klinisch bedeutsame therapeutische Durchbrüche nach wie vor schwer fassbar, da bestehende Interventionen eine begrenzte Wirksamkeit bei der Modifizierung des Krankheitsverlaufs zeigen6.

Eisen ist ein wichtiges Metall für die Aufrechterhaltung der Gehirnfunktion und ist am Sauerstofftransport, der DNA-Synthese, der mitochondrialen Atmung, der Myelinsynthese, der Neurotransmittersynthese und dem Stoffwechsel beteiligt. Eisen wird jedoch schädlich, wenn die Konzentrationen die Kapazität der zellulären Sequestrierung überschreiten 6,7,8. Eine erhöhte Eisenablagerung, die in der Regel mit Aβ-Plaques kolokalisiert ist, wurde sowohl in kortikalen als auch in hippokampalen Regionen des Gehirns bei Patienten mitAD 9,10 beobachtet. Durch die Fenton-Reaktion11 kann intrazelluläres freies Eisen sowohl Hydroxylradikale (•OH) als auch reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Diese Schadstoffe induzieren nicht nur Neuroinflammation, indem sie Gliazellen aktivieren, sondern greifen auch die Biomoleküle der Zelle durch oxidativen Stress an, stören die normale Zellfunktion und führen zu synaptischer Dysfunktion 8,12. Darüber hinaus ist ein erhöhter Eisenspiegel direkt an der Entwicklung pathologischer Symptome der Alzheimer-Krankheit beteiligt: Eisen trägt zur Aβ-Produktion bei12 und erhöht auch die Dysfunktion des Tau-Proteins, was zu neurofibrillären Verwicklungen führt13.

Um den Eisengehalt im Gehirn zu bestimmen, wurden verschiedene Techniken entwickelt, darunter die Magnetresonanztomographie (MRT) sowie chemische und histochemische Methoden14. Die In-vivo-Quantifizierung des intrazerebralen Eisenspiegels mittels MRT ist klinisch wichtig für Patienten mit Alterung und Neurodegeneration15. Die MRT hat den Vorteil, dass sie nicht-invasiv und hochempfindlich ist: Sie kann Eisenablagerungen in den frühen Stadien der Erkrankung nachweisen. Insbesondere kann mit der feldabhängigen R2-Erhöhungstechnik (FDRI) zwischen verschiedenen Formen von Eisen unterschieden werden, wie z. B. Ferritineisen und Häm-Eisen16. Die MRT kann jedoch keine Eisenakkumulation auf zellulärer Ebene nachweisen und ist teuer, weshalb sie hauptsächlich in klinischen Untersuchungen eingesetzt wird17.

Die kolorimetrische Messung ist ein chemisches Verfahren, das die Konzentration einer Substanz (z. B. Eisen) bestimmt, indem die Intensität der Farbe gemessen wird, die durch die Reaktion der Substanz in Lösung mit einem chromogenen Mittel18 erzeugt wird. Diese Methode ist einfach durchzuführen und verwendet kostengünstige Reagenzien und Instrumente, wodurch sie für Labore mit begrenztem Budget geeignet ist18. Die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieser Methode sind jedoch sehr begrenzt, da die Ergebnisse von Umweltfaktoren, der Farbentwicklungszeit und dem subjektiven Urteil des Bedieners beeinflusst werden. Die Flammenatomabsorptionsspektrometrie (FAAS) ist eine weitere Methode, mit der der Eisengehalt19 bestimmt werden kann. Bei diesem Verfahren wird eine geklärte Probenlösung erhalten, indem das interessierende Gewebe in einem Hochtemperaturofen verbrannt wird. Die Probe wird dann mit Salzsäure aufgelöst und die Eisenkonzentration in der Lösung mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt. Diese Methode ist hochempfindlich und für alle Arten von biologischen Proben geeignet19. Das Verfahren ist jedoch zeitaufwändig und erfordert teure Geräte, so dass seine Verwendung begrenzt ist.

Die Perls'/DAB-Färbung zum Nachweis von Nicht-Häm-Eisen ist aufgrund ihrer hohen Spezifität und einfachen Implementierung im Vergleich zu anderen histochemischen Methoden die am häufigsten verwendete Eisennachweismethode14. Im Gegensatz zur kolorimetrischen Analyse handelt es sich bei der Perls-Färbung um eine qualitative histochemische Färbemethode, die auf der Reaktion zwischen Eisenionen und Kaliumferrocyanid beruht, um einen blauen Niederschlag zu erzeugen. Es wird verwendet, um das Vorhandensein und die Verteilung von Eisen im Gewebe mikroskopisch sichtbar zu machen. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Methode, die Eisenablagerung in verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden und die subzelluläre Verteilung der Eisenablagerung zu beobachten, was eine Methode zur Untersuchung von20 n. Chr. darstellt. Die Perls-Färbung weist in erster Linie Nicht-Häm-Eisen nach und hängt von der Bildung des Preußisch-Blau-Komplexes ab:

figure-introduction-1

(Preußisch blau)

Die traditionelle Perls-Färbung ist jedoch unwirksam, um die Eisenlokalisation bei niedrigen Eisengehalten zu erkennen. Wenn Diaminobenzidin (DAB) zugesetzt wird, reagiert es mit Eisenhexacyanoferrat unter Bildung einer braunen Verbindung, wodurch die Spezifität des Assayserhöht wird 21.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie die Menge und Verteilung der Eisenablagerung im Gehirn eines AD-Mausmodells zu beurteilen ist. In diesem Protokoll wurden 8 Monate alte 5×FAD (C57BL/6J) transgene Mäuse als AD-Mausmodell verwendet und mit Wildtyp-Mäusen gleichen Alters verglichen. Einzelheiten zu den Verfahren zur Herstellung des chemischen Reagenzes, zum Schneiden des Gehirns, zur Durchführung der Perls/DAB-Färbung und zur Analyse von Bildern, die nach der Färbung aufgenommen wurden, werden hier vorgestellt.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Xuzhou Medical University und den Vorschriften der chinesischen Regierung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Perfusion von Tieren

  1. Bereiten Sie das Fixiermittel vor: Lösen Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (siehe Tabelle 1).
  2. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (15 mg/kg). Sobald die Maus betäubt ist, befestigen Sie sie mit vier Stiften auf dem Tablett für die Perfusionschirurgie, um die Gliedmaßen zu sichern.
    VORSICHT: Um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten, überprüfen Sie, ob die Reaktionen auf das Einklemmen der Zehen, die Entspannung der Gliedmaßenmuskulatur und der tiefe, langsame und gleichmäßige Atem verloren gehen.
  3. Schneide die Brust mit einer Schere auf, um das Herz freizulegen, und schneide den rechten Vorhof auf. Injizieren Sie 20 ml 1× PBS mit einer Spritze in den linken Ventrikel, um das Blut zu spülen. Injizieren Sie dann 20 ml 4% PFA zur Fixierung.
    HINWEIS: Kontrollieren Sie die Tiefe und Richtung der Nadel, um ein Durchstechen des interventrikulären Septums zu vermeiden. Denken Sie daran, dass eine optimale Perfusion eine blasse Leber und steife Gliedmaßen nach dem anfänglichen Tremor aufweist.
  4. Enthaupte die durchblutete Maus, schneide mit einer feinen Schere den Knochen um den Schädel herum, hebe den Schädel vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette an und entferne das Gehirn. Weichen Sie dann das Gehirn über Nacht in 4 % PFA bei 4 °C ein.
    ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig mit 4% PFA, einem starken Reizstoff für die Atemwege. Tragen Sie eine geeignete Maske und führen Sie diesen Schritt in einem Abzug durch.
    HINWEIS: Die Methode der Euthanasie wurde von der IACUC des Tierpflege- und Gebrauchsprogramms der Xuzhou Medical University für Euthanasie-Richtlinien genehmigt: Mäuse / Ratten.

2. Kryosektion des Gehirns

  1. Dehydrieren Sie das Gehirn mit abgestuften Saccharoselösungen (15 % und 30 %) bei 4 °C für 24 Stunden für jeden Schritt. Das Gehirn sollte schließlich auf den Boden der Saccharoselösung sinken.
  2. Hemisect des Gehirns entlang der interhemisphärischen Fissur mit einem Skalpell. Geben Sie die linke Hälfte in ein 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 1 ml 30%iger Saccharoselösung und einem gleichen Volumen der Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) gefüllt ist, um den Kontakt zwischen dem OCT und dem Gehirn zu verbessern.
  3. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge Fremdgewebe aus der linken Hemisphäre ab und bringen Sie es auf die OCT-Plattform.
  4. Betten Sie das Gewebe in OCT mit Unterstützung einer kreisförmigen Wand aus Aluminiumfolie ein.
  5. Frieren Sie das Gewebe in einem Kryostat-Mikrotom bei -22 °C für mindestens 1 h ein und stellen Sie die Temperatur des Schneidkopfes auf -19 °C ein.
    HINWEIS: Denken Sie daran, das Anti-Roll-Glas und die Bürsten im Kryostaten zusammen mit der Probe vorzukühlen.
  6. Montieren Sie den gefrorenen Gewebeblock. Schneiden Sie den Gewebeblock je nach interessierendem Bereich wieder in eine geeignete Position und beginnen Sie dann, das Gehirn in 20 μm dicke sagittale Schnitte zu schneiden.
    HINWEIS: Wenn die Abschnitte gefaltet sind, verwenden Sie weiche Bürsten, um die Abschnitte zu entfalten.
  7. Sammeln Sie jeden Abschnitt auf den mit Gelatine überzogenen Objektträgern und schmieren Sie einen Tropfen 1× PBS darauf. Drehen Sie den Gehirnteil mit einer feinen Bürste um und montieren Sie den Abschnitt dann schnell auf die Rutsche.
  8. Trocknen Sie die gesammelten Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur und lagern Sie sie bei -20 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 2 Wochen pausiert werden. Eine längere Lagerzeit kann die Gewebequalität beeinträchtigen und somit das Ergebnis des Versuchs beeinflussen.

3. Perls/DAB-Färbung

  1. Die folgenden Lösungen werden hergestellt: 2%iges Kaliumferrocyanid (K4[Fe(CN)6]·3H2O), 2%ige Salzsäure (HCI) und 20× DAB-Lösung (siehe Tabelle 1).
  2. Legen Sie einen Objektträger mit Abschnitten in ein mit 1× PBS gefülltes Färbeglas und stellen Sie das Glas für 5 Minuten auf einen Orbitalschüttler, um das OCT aus dem Gewebe zu waschen.
    HINWEIS: Stellen Sie die Drehzahl des Orbitalschüttlers sorgfältig ein (empfohlene Drehzahl: 20 U/min), um zu vermeiden, dass Gewebe bei hohen Geschwindigkeiten vom Objektträger fällt.
  3. Mischen Sie 20 ml 2%ige Kaliumferrocyanidlösung und ein gleiches Volumen 2%ige Salzsäure in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  4. Übertragen Sie den Objektträger mit einer Kunststoffzange auf das 50 mL Röhrchen und erhitzen Sie das Röhrchen dann in einem Wasserbad bei 60 °C für 30 min.
  5. Spülen Sie den Objektträger mit 1× PBS ab und tupfen Sie überschüssige Lösung mit Seidenpapier ab.
  6. Geben Sie mit einer Pipette 50 μl DAB-Lösung in jeden Gehirnabschnitt und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  7. Aspirieren Sie die überschüssige DAB-Lösung mit einer Pipette und waschen Sie den Objektträger dann 3 Mal in PBS.
  8. Dehydrieren Sie die Schnitte mit abgestuften Alkohollösungen (50 %, 70 %, 95 %, 100 %) und Xylol (100 %, 100 %). Inkubieren Sie die Objektträger jeweils 3 Minuten lang.
  9. Versiegeln Sie die Abschnitte mit neutralem Gummi22 und legen Sie dann das Deckglas auf.
  10. Trocknen Sie die Objektträger 24 Stunden lang in einem Abzug, bevor Sie sie in einer Objektträgerbox aufbewahren.

4. Bildgebung

  1. Schalten Sie das Mikroskop ein, stellen Sie die Helligkeit der Lichtquelle ein und fokussieren Sie auf den Gehirnausschnitt unter einem Objektiv mit 4× Vergrößerung.
  2. Nehmen Sie das Bild mit der Kamerasteuerungssoftware auf und passen Sie die Parametereinstellungen an, um eine Überbelichtung zu vermeiden. Die spezifischen Einstellungen (10×, 40× Ziel) sind in Abbildung 1 dargestellt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie den automatischen Weißabgleich, um für jedes Bild die gleiche Belichtungszeit zu gewährleisten.
  3. Wechseln Sie zu einem Objektiv mit 10× Vergrößerung, bewegen Sie den Mikroskoptisch, um auf die Bereiche mit hohen Perls/DAB-Färbesignalen zu fokussieren, insbesondere den Hippocampus und die Großhirnrinde, und nehmen Sie Bilder auf (Abbildung 1A).
  4. Wechseln Sie zu einem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung, um Bilder mit klaren Färbesignalen aufzunehmen.
  5. Speichern Sie jedes Bild als 8-Bit-TIFF und exportieren Sie die Bilder zur weiteren Analyse.

5. Bildanalyse

  1. Wählen Sie in ImageJ/Fiji im Menü Plugins > Stitching > Grid/Collection-Stitching aus und wählen Sie dann Unbekannte Position , um die Bilder auszuwählen, die zusammengefügt werden sollen (Abbildung 2A).
  2. Wählen Sie File > Save As > Tiff , um das fertige Bild als TIFF zu speichern (Abbildung 2B).
  3. Verwenden Sie ImageJ/Fiji, um ein Bild zu öffnen, und stellen Sie sicher, dass das Bildformat RGB-Farbe ist (Abbildung 2C).
  4. Wählen Sie im Menü Plugins > IHC Profiler Image und dann Mode > Cytoplasmic Stained Image und den Color Deconvolution default H DAB (Abbildung 2D). Konvertieren Sie dann das Bildformat in 8-Bit-Graustufen.
  5. Konvertieren Sie die Grauwerte des Bildes in OD-Werte, indem Sie Analysieren > Kalibrieren > nicht kalibrierten OD auswählen (Abbildung 2E).
  6. Verwenden Sie die Threshold-Funktion , um den Bereich der positiven Perls/DAB-Färbung auszuwählen, und passen Sie dann die horizontalen Bildlaufbalken an, bis alle braunen Signalflecken rot bedeckt sind (Abbildung 2F).
  7. Klicken Sie auf Analysieren > Messwerte festlegen und wählen Sie dann die Optionen Fläche, Mittlerer Grauwert, Integrierte Dichte und vor allem Grenzwert begrenzen , um Hintergrundgeräusche auszuschließen (Abbildung 2G).
  8. Wählen Sie Analyze > Measure aus, um die Ergebnistabelle zu erhalten (Abbildung 2H).
  9. Gruppieren Sie die Ergebnisse und verwenden Sie Statistiksoftware, um statistische Analysen durchzuführen. In unserem Fall verglichen wir die Eisenakkumulation im Hippocampus und in der Hirnrinde von 5xFAD-transgenen Mäusen mit der in der Negativkontrolle (Wildtyp-Mäuse). Für Dreigruppenvergleiche wurde die unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) für Daten aus der Gaußschen Verteilung mit gleicher Standardabweichung verwendet.

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Ergebnisse

Um die Verteilung und Akkumulation von Eisen in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu untersuchen, führten wir eine Perls/DAB-Färbung in sagittalen Schnitten von 8 Monate alten 5xFAD-Mäusen durch. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden Perls/DAB-Färbesignale bei 8 Monate alten 5xFAD- und Wildtyp-Mäusen sowie bei 2 Monate alten Wildtyp-Mäusen beobachtet. In 5xFAD-Mäusen wurden hohe Perls'/DAB-Färbesignale im Hippocampus und im Kortex beobachtet, insbesondere im Subiculum des Hippocampus. Wi...

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Diskussion

Die Eisenablagerung ist eng mit der Alzheimer-Krankheit verbunden. Einerseits kann es durch mehrere Mechanismen zur Aβ-Produktion führen, einschließlich einer erhöhten Expression des Amyloid-Vorläuferproteins{NOTE:20}23, und auch einer erhöhten γ-Sekretase-Aktivität, die zu einer beschleunigten Aβ-Produktion führen kann24; Auf der anderen Seite kann die durch erhöhtes Eisen induzierte Lipidperoxidation die Tau-Polymerisation fördern, was au...

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Offenlegungen

Diese Forschung wurde durch ein allgemeines Projekt der Natural Science Foundation of China (Fördernummer: 32271010) unterstützt.

Danksagungen

Bei der Erstellung dieser Arbeit haben die Autoren DeepSeek verwendet, um die Sprache und Lesbarkeit zu verbessern. Nach der Nutzung dieses Tools/Dienstes haben die Autoren den Inhalt nach Bedarf überprüft und bearbeitet und übernehmen die volle Verantwortung für den Inhalt der Publikation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 M PBSBiosharpBL601AFügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um eine Lösung herzustellen
4% PFA BeyotimeP0099Wiederherstellen bei 4 > C für den Einsatz
20X DAB-LösungBiossC-0003Mix 10 μ l Lösung A, 10 μ l Lösung B und 180 μ l PBS
AlcoholSupelco107017
HCLSigma7647-01-0Destilliertes Wasser zu 50 ml
Ketamin hinzufügen China National MedicinesH20193336100 mg/kg für die Anästhesiemikroskop
OlympusCX43
Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT)Sakura Finetek4583
KaliumferrocynidlösungSigma14038-43-8Fügen Sie destilliertes Wasser zu 50 ml
SaccharoseSigma57-50-1
Xylazin hinzu & nbsp;Y-S BiotechnologieYS-(BC)-284215 mg/kg zur Betäubung
von XylolenSigma1330-20-7

Referenzen

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