Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.
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Methodenartikel
Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hämatopoetische Stammzellen besitzen die Fähigkeit zur langfristigen Selbsterneuerung und das Potenzial, sich in verschiedene Arten von reifen Blutzellen zu differenzieren. Die Anhäufung von krebsartigen Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) kann jedoch die normale Differenzierung blockieren, eine aberrante Proliferation induzieren und schließlich zur Leukämogenese führen. Um die krebsartigen Mutationen zu identifizieren und/oder zu bewerten, haben wir die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um ein Modellgen Trp53 zu untersuchen, das für die abnormale proliferative Fähigkeit von HSPCs essentiell ist. Insbesondere wurden für HSPCs angereicherte Knochenmarkzellen von Cas9-Mäusen entnommen und dann einer viralen Transfektion mit Single-Guide-RNAs (sgRNAs) unterzogen, die auf ein oder mehrere Kandidatengene abzielen, um genetische Veränderungen in HSPCs einzuführen. Anschließend wurde ein CCK-8-Assay durchgeführt, um die proliferative Kapazität von transfizierten HSPCs zu untersuchen. Die Effizienz des sgRNA-Targetings wurde durch einen Tracking of Indels by Decomposition Assay bestätigt. Diese identifizierten Gene könnten eine entscheidende Rolle bei der Leukämogenese spielen und als potenzielle therapeutische Ziele dienen.
Einleitung
Die Hämatopoese, bei der im Laufe des Lebens alle Abstammungslinien von Blutzellen produziert werden, wird von einer kleinen Population aufrechterhalten, die als hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bezeichnet wird. HSCs erhalten sich durch Selbsterneuerung und produzieren verschiedene verbindliche Vorläuferzellen, aus denen vollständig differenzierte funktionsfähige Blutzellen hervorgehen 1,2,3. Dieser Prozess ist streng reguliert. Die Akkumulation von krebsartigen Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) behindert jed....
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Protokoll
Alle Tierversuche, die im Rahmen dieses Protokolls durchgeführt wurden, wurden vom Animal Care and Welfare Committee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt.
1. Konstruktion von sgRNA-Plasmiden, die auf Kandidatengene abzielen (4 - 5 Tage)
- Entwerfen Sie die Ziel-sgRNA mit Online-sgRNA-Design-Tools. Geben Sie die genomische DNA-Sequenz des Ziels in ein Online-sgRNA-Design-Tool ein (z. B. https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Wählen Sie die geeigneten sgRNA-Ziele aus und bestellen Sie die erforderlichen Oligonukleotide.
- Bereiten Sie die s....
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Ergebnisse
Wirkung des Trp53-Knockouts auf die proliferative Kapazität von Maus-HSPCs
Hier haben wir den Trp53-Knockout als Beispiel verwendet, um dieses Protokoll zu demonstrieren. Um den Effekt des Trp53-Knockouts auf die proliferative Kapazität von Maus-HSPCs zu untersuchen, verwendeten wir lentivirale Transfektion, um Trp53 sgRNA in Cas9-exprimierende Knochenmarkzellen einzuführen, die nach 5-FU-Behandlung mit HSPCs angereichert waren. Gl.......
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Diskussion
Die CRISPR/Cas9-Technologie ist in der biomedizinischen Forschung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und hohen Effizienz weit verbreitet und erleichtert Anwendungen wie das Screening von Genfunktionen18, die Modellierung von Krankheiten19, die Immuntherapie20 sowie die Markierung und Bildgebung lebender Zellen21. Jüngste Studien haben groß angelegte CRISPR-Screenings durchgeführt, um neue t.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken der Beijing University of Chinese Medicine für die Nutzung ihrer gemeinsamen Dienste zur Durchführung dieser Forschung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31701280 an J. Zhang).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Mikrofiltrationsmembran | Sartoriu | 16533K-1 | |
| 1,5 mL EP-Röhrchen | LABLEAD | MCT-150-CLD-1 | |
| 10 cm Schale | Corning | 430167 | |
| 15 mL Röhrchen | LABLEAD | LXG1500 | |
| 1 mL sterile Spritze | |||
| 2x Accurate Taq Master Mix (Farbstoff plus) | Accurate Biology | AG11010 | Für die Kolonie-PCR |
| 50-ml-Röhrchen | LABLEAD | LXG5000 | |
| 5-Fluorouracil | Sigma | F6627-1 | |
| 6-Well-Platte | Corning | 3516 | |
| 70 & micro; m-Zellen-Sieb | Falcon® | 352350 | |
| 96-Well-Platten | Corning | 3599 | |
| ACK Lysepuffer | Leagene | CS0001 | |
| Agar | BIODEE | DE0010 | |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | |
| Applied Biosystems Thermocycler für PCR | Thermofisher | ||
| Zellzählkit-8 | Bimake | B34304 | |
| Zentrifuge | eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 Inkubator | Thermo SCIENTIFIC | ||
| DMEM | Gibco | C11995500BT | |
| DNA Clean& Konzentrator-5 | ZYMO | D4014 | |
| Dneasy Blut & Tissure Kit | Qiagen | 69504 | |
| Esp3I (BsmbI) | NEB | R0580L | |
| Fötales Rinderserum | ExCell | FSP500 | |
| GraphPad Prism 9.3 | |||
| HEK-293T | ATCC; Virginia,USA | ||
| HEPEs | Sigma | V900477 | |
| KOD-Plus-Neo | TOYOBO | KOD-401 | |
| lentiGuide-Puro | Addgene | 52963 | Rückgratvektor |
| LSL-Cas9 Mäuse | Model Animal Forschungszentrum von NANJING UNIVERSITY | ||
| Mikroplatten-Absorptionsspektralphotometer | BIO-RAD | xMark™ | |
| Nacl | Rhawn | R019772 | |
| PBS | Solarbio | P1003 | |
| PEI | Proteintech | B600070 | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x | Solarbio | P1400 | |
| pMD2.G | Plasmid Addgene | 12259 | |
| Polybren | Beyotime | C0351 | |
| Polyinosimin-Polycytidylsäure-Natriumsalz | Sigma | P1530 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | |
| RekombinantMurineIL-3 | Peprotech | 213-13-10ug | |
| RekombinantMurineIL-6 | Peprotech | 216-16-2ug | |
| RekombinantMurineSCF | Peprotech | 250-03-10ug | |
| Reguläre Agarose | BIOWEST | BY-R0100 | |
| Alkalische Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371S | |
| SpectraMax QuickDrop Ultra-Mikro-Spektralphotometer | MOLECULAR DIVICES | ||
| Zellen | BioMed | BC108-01 | |
| T4 Polynukleotidkinase | NEB | M0201L | |
| T4-Ligase | Takara | 2011B | |
| TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP105-03 | |
| Trypan Blue Lösung | LABLEAD | C0040-100ml | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| WEHI-CM | Nanjing Fuksai Biotechnologie | ||
| CBP50079 HEFE-EXTRAKT | OXOID LP0021 |
Referenzen
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015)....
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Nachdrucke und Genehmigungen
