Vergleich des transperitonealen retroperitonealen Zugangs und der perkutanen Punktion für die Modellierung der lumbalen Bandscheibendegeneration bei Kaninchen

Summary

In diesem Protokoll wurden perkutane und transretroperitoneale Punktionen in einem Modell der Bandscheibendegeneration (IVDD) bei Kaninchen verglichen. Beide Methoden induzierten IVDD; Der transretroperitoneale Ansatz führte jedoch zu umfangreicheren Veränderungen und einer geringeren Mortalität.

Abstract

In dieser Studie wird die Wirksamkeit von zwei Methoden zur Induktion der Bandscheibendegeneration (IVDD) bei Kaninchen verglichen: die perkutane und die transretroperitoneale Punktion des Anulus fibrosus. Fünfzehn gesunde männliche neuseeländische weiße Kaninchen wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: Scheinpunktion, perkutane Punktion und transretroperitoneale Punktion. Eine umfassende Bewertung, die Mortalitätsraten, morphologische und histologische Bewertungen, radiologische Bildgebung und Biomarker-Analysen umfasste, wurde durchgeführt, um einen genauen und detaillierten Vergleich zwischen den beiden Methoden zu gewährleisten. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Punktionstechniken erfolgreich IVDD im Kaninchenmodell induzierten. Der transretroperitoneale Ansatz führte jedoch zu ausgeprägteren degenerativen Veränderungen der Bandscheiben bei einer signifikant niedrigeren Mortalitätsrate im Vergleich zur perkutanen Methode. Diese Ergebnisse unterstreichen die Vorteile des transretroperitonealen Ansatzes bei der IVDD-Modellierung. Diese Studie liefert wertvolle Einblicke in die Etablierung von IVDD-Modellen und legt den Grundstein für zukünftige Untersuchungen zu effektiven Behandlungsstrategien für Kreuzschmerzen, die letztendlich die Patientenergebnisse verbessern.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten haben sich Rückenschmerzen (LBP) als die bedeutendste Muskel-Skelett-Erkrankung herausgestellt, die die Lebensqualität beeinträchtigt¹. LBP ist zu einem immer wichtigeren Problem der öffentlichen Gesundheit geworden und stellt eine erhebliche wirtschaftliche Belastung für die Gesellschaft dar, da Arbeitskräfte ausfallen und zusätzliche medizinische Kosten anfallen ^2,3. Allein in den Vereinigten Staaten belaufen sich die direkten und indirekten Kosten im Zusammenhang mit LBP auf über 100 Milliarden US-Dollar pro Jahr, einschließlich medizinischer Ausgaben, Einkommensverluste und Arbeitsverluste⁴. LBP wird häufig durch Bandscheibendegeneration (IVDD) verursacht5,6,7,8. Angesichts der hohen Prävalenz und der wirtschaftlichen Auswirkungen von LBP ist eine genaue Modellierung der IVDD entscheidend für die Erforschung von Behandlungsstrategien.

Um die Pathophysiologie der IVDD zu verstehen und Behandlungsstrategien zu evaluieren, wurden verschiedene präklinische in vivo Tiermodelle entwickelt und eingesetzt⁹. In diesen Modellen wurden mehrere Methoden eingesetzt, um eine Bandscheibendegeneration zu induzieren, darunter chirurgische oder chemische Bandscheibenverletzungen, nicht-invasive mechanische Beanspruchung, genetische Modifikation und natürliches Auftreten¹⁰. Unter diesen Methoden machen chirurgische Verletzungen bis zu 64,9 % der IVDD-Induktion aus, wobei die Nadelpunktion die primäre chirurgische Technik ist¹¹. Das Nadelpunktionsmodell zeichnet sich durch seine einfache Etablierung und minimale Schädigung der Versuchstiere aus. Zu den gängigen Ansätzen der Nadelpunktion gehören der offene retroperitoneale Zugang zum lumbalen Bandscheibenraum und die perkutane posterolaterale Punktion. Die Einstichtiefe kann mittels Röntgenüberwachung oder Nadellänge bestimmt werden. Insbesondere kann der perkutane Ansatz die iatrogene Gewebeschädigung im Vergleich zu offenen chirurgischen Methoden reduzieren, während der retroperitoneale Zugang den Vorteil direkter Visualisierungsmerkmale bietet, die in der bisherigen Literatur nicht quantitativ verglichen wurden. Während Studien die Auswirkungen der Verwendung von Nadeln mit unterschiedlichen Durchmessern¹² und der Punktion verschiedener Bandscheiben¹⁰ auf die IVDD-Induktion untersucht haben, sind vergleichende Studien, die sich auf verschiedene Ansätze zur Nadelpunktion konzentrieren, nach wie vor begrenzt. Das ausgewählte Kaninchenmodell bietet aufgrund seiner anatomischen Ähnlichkeit mit menschlichen Bandscheiben und seiner Vorteile gegenüber Nagetiermodellen in Bezug auf Größe und Struktur einen besonderen Nutzen für Forscher, die kostengünstige Längsschnittstudien mit häufigen bildgebenden Untersuchungen benötigen¹³.

In dieser Studie wurden Kaninchenmodelle der lumbalen IVDD mit zwei Methoden etabliert: offener retroperitonealer Zugang zur Punktion des lumbalen Bandscheibenraums und perkutane posterolaterale Punktion. Eine umfassende Reihe von Ergebnismessungen, einschließlich morphologischer, histologischer und radiologischer Veränderungen, wurde analysiert.

Protocol

Die tierexperimentellen Verfahren hielten sich strikt an den von den National Institutes of Health herausgegebenen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Ethikkommission für Versuchstiere der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu genehmigt (Ethik-Zulassungsnummer: 2021-23). Fünfzehn gesunde, 4 Monate alte, saubere neuseeländische weiße Kaninchen (2,25 kg ± 0,25 kg) wurden verwendet, darunter sieben männliche und acht weibliche Kaninchen. Die Tiere wurden eine Woche lang in einer Umgebung mit einer Raumtemperatur von 23 °C ± 3 °C und einer Luftfeuchtigkeit von ca. 60 % ± 10 % untergebracht, mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. Vor dem Experiment wurden die 15 Kaninchen nach dem Zufallsprinzip einer von drei Gruppen zugeteilt: der Scheingruppe (Gruppe A), der perkutanen Anulus-Fibrosus-Punktionsgruppe (Gruppe B) und der transretroperitonealen Raumanulus-Fibrosus-Punktionsgruppe (Gruppe C), mit jeweils fünf Kaninchen. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Etablierung des Kaninchen-IVDD-Modells durch perkutane Anulus-Fibrosus-Punktion

HINWEIS: Das Kaninchen-IVDD-Modell wurde mit der perkutanen Anulus-Fibrosus-Punktionsmethode erstellt. Das Verfahren folgte der von Luo TD et ^al.14 beschriebenen Punktionsmodellierungsmethode und wurde unter Röntgenkontrolle durchgeführt (Abbildung 1).

1. Bereiten Sie das Kaninchen vor.
   1. Fasten Sie die Kaninchen vor der Operation 24 Stunden lang, um den Zugang zu Wasser zu gewährleisten.
   2. Verabreichen Sie eine Anästhesie durch intravenöse Injektion von 3% Pentobarbital-Natrium (1,3 ml/kg) in die Ohrvene (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
   3. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Anästhesie, indem Sie auf Immobilität, entspannte Muskeln, fehlenden Hornhautreflex und fehlende Schmerzreaktion prüfen.
2. Positionieren und markieren Sie das Kaninchen.
   1. Befestigen Sie das Kaninchen in Bauchlage auf einem Fixierbrett.
   2. Rasieren und bereiten Sie den Operationsbereich vor, dann tasten Sie die Knochenmarkierungen ab.
   3. Palpieren Sie die knöchernen Orientierungspunkte auf dem Lendenwirbel des Kaninchens ab. Lokalisieren Sie die unterste Rippe des Kaninchens, die typischerweise dem Wirbel direkt über dem Dornfortsatz L1 entspricht.
   4. Identifizieren Sie den Dornfortsatz unmittelbar unter diesem Wirbel, um den Dornfortsatz L1 zu bestimmen.
   5. Lokalisieren Sie die höchsten Punkte der Beckenkämme, etwa auf Höhe des L6-Wirbels.
   6. Verfolgen Sie den Dornfortsatz L1 zurück, um jeden Dornfortsatz sequentiell bis hinunter zu L7 zu identifizieren.
   7. Verwenden Sie einen Markierungsstift, um den L1-Dornfortsatz deutlich auf dem Rücken des Kaninchens zu markieren.
   8. Wechseln Sie zum nächsten Dornfortsatz und markieren Sie ihn als L2.
   9. Markieren Sie weiterhin jeden nachfolgenden Dornfortsatz als L3, L4, L5, L6 und L7. Stellen Sie sicher, dass jede Markierung eindeutig und in sequenzieller Reihenfolge ist, um eine eindeutige Identifizierung zu gewährleisten.
3. Lokalisieren und markieren Sie die Einstichstelle.
   1. Palpieren Sie die Querfortsätze und lokalisieren Sie den Mittelpunkt zwischen den distalen Enden von L5 und L6.
   2. Markieren Sie diesen Punkt und bereiten Sie sich darauf vor, die Einstichnadel ca. 1 cm darüber einzuführen.
4. Führen Sie die Einstichnadel ein.
   1. Halten Sie die Einstichnadel waagerecht und führen Sie sie in Richtung Boden ein, wobei Sie die Haut verletzen.
   2. Schieben Sie die Nadel vor, um den L4-Wirbelkörper zu erreichen und überprüfen Sie die korrekte Positionierung unter Röntgenkontrolle.
   3. Kippen Sie die Nadel leicht kopfförmig in einem Winkel von ca. 20° in Richtung Bandscheibe L4-5. Punktion der Bandscheibe und Bestätigung der Genauigkeit der Punktion unter Röntgenuntersuchung.
5. Führen Sie Bandscheibenpunktionen durch.
   1. Punktion des Anulus fibrosus präzise, ggf. mit Röntgenführung.
   2. Wiederholen Sie den Punktionsvorgang für die Bandscheiben L2-3 und L3-4 und punktieren Sie jeweils einmal.
   3. Eine Einstichtiefe von ca. 5 mm bei einer Verweilzeit von 5 s pro Scheibe ist einzuhalten.
6. Pflege nach dem Eingriff
   1. Desinfizieren und verbinden Sie die Einstichstelle.
   2. Injizieren Sie Penicillin intramuskulär in den Gluteus maximus in einer Dosierung von 40.000 U pro Kaninchen täglich für 3 Tage.
      HINWEIS: Passen Sie den Ansatz an, wenn die Nadel auf hartes Gewebe trifft. Verwenden Sie die Röntgenführung für eine präzise Punktion. Überwachen Sie die Genesung des Kaninchens und sorgen Sie für eine angemessene Pflege.

2. Etablierung eines Kaninchen-IVDD-Modells mittels transretroperitonealer Raumanulus-Fibrosus-Punktion

HINWEIS: Das Kaninchen-IVDD-Modell wurde unter Verwendung der transretroperitonealen Raumanulus-Punktionsmethode¹² etabliert (Abbildung 2).

1. Fasten Sie die Kaninchen vor der Operation 24 Stunden lang, um Zugang zu Wasser zu erhalten.
2. Betäuben Sie das Kaninchen, indem Sie intravenös 3% Pentobarbital-Natrium (1,3 ml/kg) in die Ohrvene injizieren (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
3. Stellen Sie sicher, dass das Kaninchen unbeweglich ist, mit entspannten Muskeln, ohne Hornhautreflex und ohne Schmerzreaktion auf Druck, um eine erfolgreiche Anästhesie zu bestätigen.
4. Befestigen Sie das Kaninchen in Bauchlage auf einem Fixierbrett.
5. Rasieren Sie sich und bereiten Sie das Operationsgebiet vor.
6. Palpatieren Sie Knochenmarkierungen, indem Sie die L1-L7-Dornfortsätze L1-L7 auf dem Lendenwirbelrücken des Kaninchens mit einem Markierungsstift markieren.
7. Palpieren Sie die Querfortsätze des Kaninchens erneut, um die Stelle des chirurgischen Schnitts zu bestimmen.
8. Legen Sie ein steriles Tuch auf und desinfizieren Sie die lokale Haut, um aseptische Bedingungen zu gewährleisten.
9. Verwenden Sie einen posterioren retroperitonealen Ansatz, um die Faszie und die Muskeln Schicht für Schicht zu präparieren und den lateralen Aspekt der lumbalen Bandscheibe freizulegen.
10. Den Anulus fibrosus mit einer Punktionsnadel bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm und einer Verweilzeit von 5 s punktieren.
11. Punktion der Bandscheiben L3-4, L4-5 und L5-6 nacheinander und stellen Sie sicher, dass jede Bandscheibe nur einmal punktiert wird.
12. Vernähen Sie das Gewebe Schicht für Schicht mit einem Nahtfaden mit einem Durchmesser von 0,25 mm.
13. Desinfizieren und verbinden Sie die Einstichstelle nach dem Modellieren.
14. Injizieren Sie Penicillin täglich intramuskulär in den Gluteus maximus des Kaninchens in einer Dosierung von 40.000 U pro Kaninchen an drei aufeinanderfolgenden Tagen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Penicillin mit einer Spezifikation von 800.000 Einheiten/Durchstechflasche und der Zulassungsnummer Veterinary Drug 140051251.

3. Auswahl von IVDD-Modellen und Outcome-Evaluation

1. Beurteilung der Mortalität und des Allgemeinzustands von Kaninchen
   1. Beobachten Sie Kaninchen wöchentlich, um das Überleben zu bestimmen und den Allgemeinzustand aufzuzeichnen, einschließlich des mentalen Zustands, der Aktivitätsmuster, der Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie der Kot- und Harnausscheidung.
   2. Notieren Sie die Beobachtungen genau und notieren Sie alle Änderungen des Zustands.
2. Gewichtsüberwachung von Kaninchen
   1. Erfassen Sie das Körpergewicht von Kaninchen vor und nach der Etablierung des Modells sowie vor der Gewebeentnahme.
   2. Stellen Sie eine genaue Gewichtsaufzeichnung sicher und notieren Sie alle wesentlichen Änderungen.
3. Radiologische Beurteilung
   1. Erhalten Sie eine sagittale 1,5 T T2-gewichtete Magnetresonanztomographie der gesamten Lendenwirbelexplantatsequenz jedes weißen Kaninchens vor und 4 Wochen nach der Modelletablierung.
   2. Beobachten Sie das Ausmaß der Bandscheibendegeneration.
   3. Durchführung einer quantitativen Beurteilung der Bandscheibendegeneration unter Verwendung des modifizierten Pfirrmann-Grading-Systems, das von Griffith et al. vorgeschlagen ^wurde.15. Lassen Sie drei unabhängige verblindete Radiologen T2-gewichtete MRT-Sequenzen nach festgelegten Kriterien bewerten: Bandscheibenhöhe, Signalintensität des Nucleus pulposus und Integrität des Anulus fibrosus.
   4. Bestimmen Sie die Abschlussnoten im Konsens, wenn die Abweichungen eine Notenstufe überschreiten. Führen Sie alle Bewertungen mit standardisierter DICOM-Anzeigesoftware mit kalibrierten Anzeigeeinstellungen durch.
4. Histopathologische Bewertung und Bewertung
   1. Einschläferung der Kaninchen 4 Wochen nach der Modellierung mit einer intravenösen Überdosis Pentobarbital-Natrium (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) und rasche Entnahme der Bandscheiben L2-L3, L3-L4 und L4-L5 auf Eis¹⁵.
   2. Fixieren Sie die L2-L3-Scheiben in 4 % Paraformaldehyd und lagern Sie die restlichen Proben bei -80 °C.
   3. Tauchen Sie die festen Scheiben in eine Entkalkungslösung, z. B. 10 % EDTA, um ein vollständiges Eintauchen zu gewährleisten. Wechseln Sie die Entkalkungslösung alle 2-3 Tage, um die Wirksamkeit zu erhalten.
   4. Überwachen Sie den Entkalkungsprozess regelmäßig, bis eine vollständige Entkalkung erreicht ist, was je nach Scheibengröße und -dicke mehrere Tage bis zu einer Woche dauern kann.
   5. Spülen Sie die entkalkten Scheiben gründlich mit fließendem Wasser ab, um alle Spuren der Entkalkungslösung zu entfernen.
   6. Dehydrieren Sie die Scheiben, indem Sie sie in eine Reihe von abgestuften Ethanollösungen tauchen, beginnend mit 70 % Ethanol und allmählich auf 100 % Ethanol erhöhend. Führen Sie jeden Dehydratisierungsschritt 1-2 Stunden pro Klasse durch.
   7. Infiltrieren Sie die dehydrierten Scheiben mindestens 2 Stunden lang mit Paraffinwachs (Schmelzpunkt 56-58 °C), um eine vollständige Infiltration zu gewährleisten.
   8. Betten Sie die infiltrierten Scheiben in einen Wachsblock ein und positionieren Sie sie für das Schneiden. Lassen Sie den Wachsblock abkühlen und vollständig erstarren.
   9. Schneiden Sie die eingebetteten Discs mit einem Mikrotom in dünne, gleichmäßige Scheiben (5-10 μm). Die Schnitte werden für weitere Analysen, wie z. B. histologische Färbung oder Immunhistochemie, auf Objektträger montiert^12,13.
   10. Führen Sie Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbungen durch, nehmen Sie Bilder unter einem optischen Mikroskop auf und weisen Sie HE-Färbewerte mit der histopathologischen IVD-Notenskala¹² zu.
5. TUNEL-Assay
   1. Entwachsung und Rehydrierung von Bandscheibengewebeschnitten, anschließende Antigen-Retrieval und Membranpermeabilisierung.
   2. Eine Mischung aus Reagenz 1 (TdT) und Reagenz 2 (dUTP) im Verhältnis 1:9 zugeben und in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
   3. Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer, tragen Sie DAPI-Beize auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   4. Nehmen Sie Bilder mit einem vollautomatischen Panoramascanner und einer Verarbeitungssoftware auf.
6. Nachweis von Zytokinen
   1. Die Versuchskainchen einschläfern (Schritt 3.4.1) und Blutproben aus der Bauchschlagader entnehmen.
   2. Kaninchenblutproben bei 2000 × g für 10 min bei 25 °C zentrifugieren, um das Serum von den Blutzellen zu trennen. Sammeln Sie den Überstand (Serum) vorsichtig und stellen Sie sicher, dass keine Zelltrümmer enthalten sind.
   3. Befolgen Sie die Anweisungen im ELISA-Kit, um die Expression von TGF-β in Serumproben nachzuweisen.
   4. Bereiten Sie Reagenzien und Standards gemäß den Anweisungen im ELISA-Kit vor.
   5. Geben Sie Serumproben in die entsprechenden Vertiefungen in der ELISA-Platte.
   6. Inkubieren Sie die Platte bei der empfohlenen Temperatur und Dauer gemäß den Anweisungen des Kits.
   7. Waschen Sie die Platte wie angewiesen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen.
   8. Fügen Sie den Nachweisantikörper und andere notwendige Reagenzien gemäß dem Protokoll des Kits hinzu.
   9. Inkubieren Sie die Platte erneut für die angegebene Zeit und Temperatur.
   10. Waschen Sie die Platte gründlich, um überschüssige Reagenzien zu entfernen.
   11. Geben Sie die Substratlösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie für den empfohlenen Zeitraum, damit sich die Farbe entwickeln kann.
   12. Messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer bei der in den Kit-Anweisungen angegebenen Wellenlänge.
   13. Berechnen Sie die Probenkonzentrationen, indem Sie die OD-Werte in die bereitgestellte Gleichung einfügen oder die Standardkurve verwenden, die aus den bekannten Konzentrationen der Standards generiert wird.

4. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit kommerziell erhältlicher Software durch.
2. Drückt stetige Variablen als Mittelwert ± Standardabweichung aus.
3. Verwenden Sie die unidirektionale ANOVA, um Unterschiede zwischen Gruppen zu testen.
4. Wenden Sie LSD-Tests für paarweise Vergleiche an.
5. Verwenden Sie die ANOVA für wiederholte Messungen, um Daten zu wiederholten Messungen zu analysieren.
6. Führen Sie eine Spearman-Korrelationsanalyse durch, um die Korrelation zwischen Variablen zu bewerten.
7. Legen Sie das Signifikanzniveau auf α = 0,05 fest, und betrachten Sie P-Werte kleiner als 0,05 als statistisch signifikant.

Results

Die chirurgischen Eingriffe verliefen ohne Komplikationen. Ein Kaninchen aus Gruppe B (perkutane Punktionsgruppe) starb nach dem Eingriff. Alle anderen Tiere nahmen postoperativ ihre normalen Fress- und Aktivitätsmuster wieder auf und überlebten während des gesamten Versuchszeitraums. An den Operationsstellen wurden keine anhaltenden Blutungen oder Infektionen beobachtet.

Bewertung der Mortalität und des Allgemeinzustands
Die Sterblichkeitsrate lag sowohl in Gruppe A als au...

Discussion

Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass sowohl die perkutane als auch die transretroperitoneale Punktion bei der Induktion einer Bandscheibendegeneration (IVDD) in Kaninchenmodellen wirksam sind. Basierend auf einer umfassenden Bewertung des Allgemeinzustands, der Mortalität, der histopathologischen Beurteilung, des TUNEL-Assays und der TGF-β-Spiegel im Serum führte das transretroperitoneale Punktionsmodell zu umfangreicheren degenerativen Veränderungen der Bandscheiben bei ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 T Veterinärmedizinische Maenetische Resonanz (MRT)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alkohol medizinisches	LIRCON	20230107
Benzylpenicillin Kalium	Jiangxi Keda Tierpharmazeutische	140051251
hämostatische Pinzette	SHINVA	20211239
Injektionsspritze	CONPUVON	20153151307
Messerklingen	Hons Medincal	20210615
Medical saugfähiger Wattebausch	Cofoe	20210006
Medical Nahtnadel	Shanghai Xiaoyi Medical Devices
Medullo-Punktionsnadel	Yangzhou Jiangzhou Medizinprodukte	20190902	Zur Punktion der Lendenwirbelsäule
Physiologische Kochsalzlösung	NeilMed
Povidon-Jod-Lösung	Sichuan IJIS Medizintechnik
Quasi-Mikrowaage	Explorer
Operationstisch zum Sezieren von Kaninchen	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Rasierer	AUX
Statistische Analysesoftware	IBM	SPSS
Sterile Gaze	Cofoe	20202140675
Chirurgische Handschuhe	DR. LERSH	20172140028
Chirurgisches Messer	Hons Medinca	20210019
Chirurgische Pinzette	SHINVA	20210233
USB-C Datenübertragungsleitung	KINI
Weißlichtmikroskop	Nikon	Eclipse Ci-L