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Methodenartikel

Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Onkogen-abgeleiteten Transkriptions-Replikationskonflikten

1.3K Ansichten

DOI:

10.3791/67537

10. Januar 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir eine sensitive und spezifische Methode zum Nachweis von onkogeninduzierten Transkriptions-Replikationskonflikten (TRCs) mit dem Proximity-Ligation-Assay (PLA) vor. Dieser Ansatz nutzt spezifische Antikörper, die auf PCNA- und Phospho-CTD-RNAPII abzielen, und ermöglicht so die Beurteilung der TRC-Prävalenz zwischen RNA-Polymerase-II-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie.

Zusammenfassung

Sowohl die DNA-Replikation als auch die RNA-Transkription verwenden genomische DNA als Vorlage, was eine räumliche und zeitliche Trennung dieser Prozesse erforderlich macht. Konflikte zwischen der Replikations- und der Transkriptionsmaschinerie, die als Transkriptions-Replikationskonflikte (TRCs) bezeichnet werden, stellen ein erhebliches Risiko für die Genomstabilität dar, ein kritischer Faktor für die Krebsentstehung. Obwohl mehrere Faktoren identifiziert wurden, die diese Kollisionen regulieren, bleibt es schwierig, die Hauptursachen zu lokalisieren, da die Werkzeuge für eine direkte Visualisierung und klare Interpretation begrenzt sind. In dieser Studie visualisieren wir TRCs direkt mit einem Proximity-Ligation-Assay (PLA) unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für PCNA und phosphorylierte CTD der RNA-Polymerase II sind. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Messung von TRCs zwischen Replikations- und Transkriptionsprozessen, die durch RNA-Polymerase II vermittelt werden. Die Methode wird durch DNA-Primer, die kovalent an diese Antikörper konjugiert sind, in Verbindung mit der PCR-Amplifikation mit Fluoreszenzsonden weiter verbessert, was ein hochempfindliches und spezifisches Mittel zum Nachweis endogener TRCs bietet. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung dieser Konflikte und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Genominstabilitätsmechanismen, die mit Krebs verbunden sind. Diese Technik schließt die Lücke in der direkten TRC-Visualisierung und ermöglicht eine umfassendere Analyse und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse, die zur Genominstabilität in Zellen führen.

Einleitung

Das Genom dient als Vorlage für essentielle biologische Prozesse, einschließlich Replikation und Transkription. In gesunden Zellen arbeiten RNA-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie typischerweise zusammen und sind räumlich und zeitlich getrennt 1,2,3,4. Unter pathologischen Bedingungen, wie z.B. einer Überexpression von Onkogenen, kann diese harmonische Zusammenarbeit jedoch gestört werden.

Onkogene führen häufig zu erhöhten Transkriptionswerten, was die Wahrscheinlichkei....

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Protokoll

1. Produktion von Lentiviren und Transduktion in die Zielzelllinie

  1. Produktion von Lentiviren24
    1. 293T-Verpackungszellen bei 3 × 106 Zellen pro 10-cm-Platte in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; vollständiges Medium) mit hohem Glukosegehalt aussäen. Züchten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator für weitere 18-20 Stunden.
    2. Bereiten Sie in zwei 1,5-ml-Röhrchen eine DNA-Mischung aus insgesamt 24 μg Plasmid-DNA in 500 μl Opti-MEM (reduziertes Serummedium) vor, die 9,2 μg psPAX2, 2,8 μg pMD2.G sowie 12 μg pLVX-KRAS-P....

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Ergebnisse

γH2AX dient als Biomarker für DNA-Schäden. Eine Überexpression von KRAS (G12D) beeinträchtigt die genomische Stabilität in diesen Zellen, wie das erhöhte γH2AX-Signal in der Western-Blot-Analyse zeigt (Abbildung 2A). Darüber hinaus deutet das verstärkte S9.6-Dot-Blot-Signal in KRAS (G12D)-exprimierenden Zellen im Vergleich zu Vektorkontrollen (Abbildung 2B) darauf hin, dass die onkogene KRAS-Expression zur Akkumulation von aberranten R-Schleifen führt, die zur B.......

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Diskussion

Die RNAPII-Transkriptionsmaschinerie kann das Fortschreiten der DNA-Replikationsgabel behindern26,27 und TRCs und DNA-Schäden fördern, insbesondere in Krebszellen28,29. Die Entschlüsselung der Proteine, die die TRCs regulieren, und das Verständnis der detaillierten Mechanismen können uns helfen zu verstehen, wie diese schädlichen Ereignisse ablaufen, und die Entwicklung n.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Startup-Finanzierung der University of South China unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Clarity Western ECL SubstratBio-Rad1705061
Duolink In Situ Detektionsreagenzien GreenSigmaDUO92014
FLAG AntikörperMilliporeF7425
gamma H2AX AntikörperCell Signaling25955
Glykogen, molekularbiologischThermoFisherR0561
Image JNIHhttps://imagej.net/ij/
Nitrozellulose-Membranen Amersham10600004 PCNA-Antikörper
Zell-Signalisierung13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.G Addgene 12259
Proteinase K, rekombinant, PCR-QualitätThermoFisherEO0491
psPAX2Addgen 12260
RNAPII AntikörperSCBTsc-56767
S9.6 AntikörperAktives Motiv65683
UV-VernetzerFisher ScientificFB-UVXL-1000

Referenzen

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication co....

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Genomische Instabilit tRNA Polymerase IIPCNA Antik rperFluoreszenzmikroskopieDNA ReplikationPCR AmplifikationStabilit t des Krebsgenomsendogener TRC Nachweis
Video demnächst verfügbar