Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Onkogen-abgeleiteten Transkriptions-Replikationskonflikten

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir eine sensitive und spezifische Methode zum Nachweis von onkogeninduzierten Transkriptions-Replikationskonflikten (TRCs) mit dem Proximity-Ligation-Assay (PLA) vor. Dieser Ansatz nutzt spezifische Antikörper, die auf PCNA- und Phospho-CTD-RNAPII abzielen, und ermöglicht so die Beurteilung der TRC-Prävalenz zwischen RNA-Polymerase-II-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie.

Zusammenfassung

Sowohl die DNA-Replikation als auch die RNA-Transkription verwenden genomische DNA als Vorlage, was eine räumliche und zeitliche Trennung dieser Prozesse erforderlich macht. Konflikte zwischen der Replikations- und der Transkriptionsmaschinerie, die als Transkriptions-Replikationskonflikte (TRCs) bezeichnet werden, stellen ein erhebliches Risiko für die Genomstabilität dar, ein kritischer Faktor für die Krebsentstehung. Obwohl mehrere Faktoren identifiziert wurden, die diese Kollisionen regulieren, bleibt es schwierig, die Hauptursachen zu lokalisieren, da die Werkzeuge für eine direkte Visualisierung und klare Interpretation begrenzt sind. In dieser Studie visualisieren wir TRCs direkt mit einem Proximity-Ligation-Assay (PLA) unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für PCNA und phosphorylierte CTD der RNA-Polymerase II sind. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Messung von TRCs zwischen Replikations- und Transkriptionsprozessen, die durch RNA-Polymerase II vermittelt werden. Die Methode wird durch DNA-Primer, die kovalent an diese Antikörper konjugiert sind, in Verbindung mit der PCR-Amplifikation mit Fluoreszenzsonden weiter verbessert, was ein hochempfindliches und spezifisches Mittel zum Nachweis endogener TRCs bietet. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung dieser Konflikte und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Genominstabilitätsmechanismen, die mit Krebs verbunden sind. Diese Technik schließt die Lücke in der direkten TRC-Visualisierung und ermöglicht eine umfassendere Analyse und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse, die zur Genominstabilität in Zellen führen.

Einleitung

Das Genom dient als Vorlage für essentielle biologische Prozesse, einschließlich Replikation und Transkription. In gesunden Zellen arbeiten RNA-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie typischerweise zusammen und sind räumlich und zeitlich getrennt 1,2,3,4. Unter pathologischen Bedingungen, wie z.B. einer Überexpression von Onkogenen, kann diese harmonische Zusammenarbeit jedoch gestört werden.

Onkogene führen häufig zu erhöhten Transkriptionswerten, was die Wahrscheinlichkei....

Protokoll

1. Produktion von Lentiviren und Transduktion in die Zielzelllinie

1. Produktion von Lentiviren²⁴
   1. 293T-Verpackungszellen bei 3 × 10⁶ Zellen pro 10-cm-Platte in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; vollständiges Medium) mit hohem Glukosegehalt aussäen. Züchten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ -Inkubator für weitere 18-20 Stunden.
   2. Bereiten Sie in zwei 1,5-ml-Röhrchen eine DNA-Mischung aus insgesamt 24 μg Plasmid-DNA in 500 μl Opti-MEM (reduziertes Serummedium) vor, die 9,2 μg psPAX2, 2,8 μg pMD2.G sowie 12 μg pLVX-KRAS-P....

Ergebnisse

γH2AX dient als Biomarker für DNA-Schäden. Eine Überexpression von KRAS (G12D) beeinträchtigt die genomische Stabilität in diesen Zellen, wie das erhöhte γH2AX-Signal in der Western-Blot-Analyse zeigt (Abbildung 2A). Darüber hinaus deutet das verstärkte S9.6-Dot-Blot-Signal in KRAS (G12D)-exprimierenden Zellen im Vergleich zu Vektorkontrollen (Abbildung 2B) darauf hin, dass die onkogene KRAS-Expression zur Akkumulation von aberranten R-Schleifen führt, die zur B.......

Diskussion

Die RNAPII-Transkriptionsmaschinerie kann das Fortschreiten der DNA-Replikationsgabel behindern^26,27 und TRCs und DNA-Schäden fördern, insbesondere in Krebszellen^28,29. Die Entschlüsselung der Proteine, die die TRCs regulieren, und das Verständnis der detaillierten Mechanismen können uns helfen zu verstehen, wie diese schädlichen Ereignisse ablaufen, und die Entwicklung n.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Clarity Western ECL Substrat	Bio-Rad	1705061
Duolink In Situ Detektionsreagenzien Green	Sigma	DUO92014
FLAG Antikörper	Millipore	F7425
gamma H2AX Antikörper	Cell Signaling	25955
Glykogen, molekularbiologisch	ThermoFisher	R0561
Image J	NIH	https://imagej.net/ij/
Nitrozellulose-Membranen	Amersham	10600004 PCNA-Antikörper
	Zell-Signalisierung	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
Proteinase K, rekombinant, PCR-Qualität	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgen	12260
RNAPII Antikörper	SCBT	sc-56767
S9.6 Antikörper	Aktives Motiv	65683
UV-Vernetzer	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000