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Methodenartikel

Herstellung von Mycobacterium tuberculosis-Kulturfiltrat zum Verständnis der TB-Pathogenese

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DOI:

10.3791/67540

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28. März 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir die Herstellung von Mtb-Kulturfiltrat (CF), dem bakteriellen Wachstumsmedium, das aus Proteinen besteht, die von den Bakterien sezerniert werden. Mtb sezerniert Proteine, um die Signalübertragung des Wirts und die Immunantwort zu modulieren, die für die Pathogenese entscheidend sind. Die präparierten CFs werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um alle sekretorischen Faktoren zu identifizieren.

Zusammenfassung

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sezerniert viele Proteine in den Wirt, um verschiedene zelluläre Prozesse wie Wirtssignalisierung, Immunantwort, Apoptose usw. zu modulieren und das Überleben zu verbessern. Während die Funktion einiger sekretorischer Faktoren aufgeklärt wurde, müssen viele noch charakterisiert werden. Daher ist die Erforschung des sekretorischen Proteins Mtb ein wesentliches Forschungsgebiet. Mtb sezerniert Proteine in den extrazytoplasmatischen Raum mit Hilfe von drei verschiedenen Sekretionssystemen: allgemeines, Twin-Arginin- und spezialisiertes Typ-VII-Sekretionssystem. Man muss das Sekretom präparieren, um neue sekretorische Moleküle zu identifizieren und die bekannten Faktoren funktionell zu charakterisieren. Im Folgenden wird die Methode zur Präparation des Sekretoms und zur Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie skizziert. Die Sekretomvorbereitung erfordert äußerste Sorgfalt, um eine Kontamination zytosolischer Proteine zu vermeiden, die durch Sondierung mit Antikörpern gegen gut charakterisierte Membran-, Sekretor- und zytosolische Proteine überwacht werden kann. Das so hergestellte Kulturfiltrat kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, einschließlich der Untersuchung der Immunmodulationseigenschaften des Wirts.

Einleitung

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), einer der tödlichsten Krankheitserreger weltweit, infiziert gesunde Menschen durch Aerosole, die von einer infizierten Person beim Niesen oder Husten übertragen werden1. Sobald es in die Lunge gelangt, wird es von den Alveolarmakrophagen verschlungen und kapert das Immunsystem des Wirts, um zu überleben. Unter den verschiedenen wirtsmodulatorischen Mechanismen, die Mtb für das Überleben hat, sind sekretorische Virulenzfaktoren einer davon. Die Proteine, die von den Bazillen während ihres Wachstums in den Nährboden sezerniert werden, werden als Kulturfiltrat (CF)-Proteine2 bezeichnet. Diese Kulturfiltratproteine helfen Bakterien, unter rauen Bedingungen in den Wirtszellen zu überleben. Mtb ist mit drei verschiedenen Arten von Sekretionssystemen ausgestattet: einem spezialisierten Typ-VII-Sekretionssystem (T7SS), einem allgemeinen Sec-Sekretionssystem (Sec-System) und einem Twin-Arginin-Sekretionssystem (Tat-System). T7SS ist das exklusivste Sekretionssystem bei Actinobakterien, im Gegensatz zu Typ I-VI bei gramnegativen Bakterien3. Die Sekretion des ungefalteten Proteins durch die Membran ist maßgeblich am Sec-System beteiligt, und die Proteine werden durch eine N-terminale Signalsequenz 4,5 erkannt. Gefaltete oder teilweise gefaltete Proteine werden durch das Tat-System transportiert, das durch eine N-terminale Signalsequenz mit einem Zwillings-Arginin-Motiv gekennzeichnet ist 6,7. Wie das Sec- und Tat-System die Proteinsekretion reguliert, muss noch geklärt werden.

Einige bekannte Kulturfiltratproteine in Mtb, die dem oxidativen Ansturm des Wirts bei einer Infektion standhalten und überleben, sind Enzyme wie KatG und SodA 8,9, die für den Abbau reaktiver Sauerstoffspezies notwendig sind. Darüber hinaus spielt CFP10-ESAT6, ein heterodimerer Proteinkomplex, eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Zytokinreaktionen, der bakteriellen Flucht, der ROS-Produktion usw.10. Der RD1-Locus ist an der Modulation des Typ-VII-Sekretionssystems beteiligt, zu dem auch die Sekretion von CFP10-ESAT6 gehört, und die genetische Deletion von cpf10-esat6 beeinträchtigt das Überleben von Bakterien in ex vivo- und in vivo-Infektionsmodellen. Mycobacterium bovis Dem BCG-Impfstoffstamm fehlt der RD1-Locus, der für die Sekretion von Virulenzfaktoren verantwortlich ist, und kann daher als abgeschwächter Lebendimpfstoff verwendet werden11. Verschiedene unerforschte zelluläre Prozesse regulieren den Sekretionsprozess streng. Die Kulturfiltratproteine enthalten wiederbelebungsfördernde Faktoren (RpFs), die den Bakterien helfen, aus dem latenten Zustand wieder zu wachsen. Reanimationsfördernde Faktoren (Rpfs) sind Peptidoglykan-Hydrolyse-Enzyme, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Ruhephase spielen. Mtb kodiert für fünf rpf-ähnliche Gene (rpf A-E), die den Bakterien helfen, entweder allein oder durch Interaktion mit anderen Proteinen aus der Ruhephase wieder zu wachsen12. Rpfs kommen in Bakterienkulturfiltrat vor und sind dafür bekannt, dass sie an der Mtb-Virulenz und der Wirtsimmunität beteiligt sind13,14. Die viel untersuchten rpf-Gene rpfE und rpfB zeigen in vitro eine schützende Immunität 13 und verstärken die Immunantwort in vivo. Daher können rpfE und rpfB als Mtb-Impfstoffkandidaten verwendet werden.

Die reversible Phosphorylierung15 ist eine posttranslationale Modifikation, die verschiedene zelluläre Prozesse, die Zellhomöostase, die Zellteilung usw. verändert. Zum Beispiel spielt die Phosphorylierung von CFP10 eine wichtige regulatorische Rolle, wobei sowohl phosphoablative als auch mimetische Mutanten von CFP10 den beobachteten Phänotyp im CFP10-ESAT6-Deletionsstamm 16 nicht wiederherstellen können. SecA2 hingegen ist ein sekretorisches Protein, das an der DNA-Schädigung der Wirtszelle beteiligt ist17. Das Sekretom der SecA2-Mutante reicht aus, um die Immunantwort und die Signalkaskade des Wirts zu verändern18,19. Daher ist es wichtig und spannend, das Sekretom von H37Rv und den Mtb-Mutanten zu untersuchen, bei denen die Gene der sekretorischen Proteine gelöscht werden (unveröffentlichte Daten), um Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie sie sich auf die Immunmodulation und das Überleben des Wirts auswirken.

Dieser Bericht konzentriert sich auf drei Aspekte: die Schritte zur Herstellung von Mtb-Kulturfiltrat , die Aufbereitung der Proben für die Massenspektrometrie und die Durchführung von Ex-vivo-Experimenten mit Kulturfiltraten zur Untersuchung immunmodulatorischer Funktionen. Frühere Studien zeigten die Identifizierung von Kulturfiltratproteinen durch 2D-Gelelektrophorese, gefolgt von massenspektrometrischer Analyse8. Kulturfiltratproteine aus arzneimittelempfindlichen und resistenten Stämmen wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert, um Einblicke in die Sekretomveränderungen zu gewinnen und Virulenzfaktoren zu identifizieren, die eine Rolle bei der Arzneimittelresistenz spielen könnten20. Wir haben bereits das Sekretom und das Phosphosekretom von Mtb mit Hilfe der Massenspektrometrieuntersucht 16. Techniken wie die 2D-Gelelektrophorese haben einen geringen Durchsatz und werden nicht verwendet, um globale Veränderungen im Proteom oder Sekretom zu untersuchen. Die Kulturfiltratproteine würden von Bakterienstämmen, Stadien der wachsenden Zellen und sogar unter verschiedenen Stressbedingungen variieren. Abhängig von verschiedenen Situationen würde die Veränderung der sekretorischen Proteinpools in den Zellen dazu beitragen, das gesamte Sekretom ganzheitlich zu erforschen und mehr Informationen über das bakterielle Sekretionssystem für therapeutische Eingriffe zu liefern. Es wäre sogar noch attraktiver, das Sekretom in den Knockout- oder Depletionsstämmen sekretorischer Systeme zu betrachten, um weitere Einblicke in die Signalwege und Ziele jedes sekretorischen Signalwegs zu erhalten. Die Behandlung von Zellen mit Kulturfiltratproteinen anstelle von Bakterien verändert die Zytokinspiegel und andere immunmodulatorische Faktoren17. Mit Hilfe der Sekretomstudie kann man neue Virulenzfaktoren und deren Rolle bei der Virulenz identifizieren.

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Protokoll

HINWEIS: Hier verwenden wir den pathogenen Laborstamm H37Rv von Mtb. Man sollte die erforderlichen Schritte zum Züchten der Bakterienkultur und zur Isolierung des Kulturüberstands im Biosicherheitslabor Stufe 3 (BSL-3) durchführen. Von der Wiederbelebung der Kultur bis zur Filtrataufbereitung kommt die BSL-3-Anlage zum Einsatz.

1. Inokulation der Mtb-Kultur

  1. Vorbereitung des Arbeitsbereichs in BSL-3
    1. Schalten Sie das UV-Licht der Biosicherheitswerkbank vor Gebrauch für 10 min ein. Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank vor und nach dem Gebrauch mit 75% Ethanol. Entsorgen Sie die verwendeten Materialien in geeigneten Abfallbehältern gemäß den Richtlinien zur biologischen Sicherheit.
  2. Aufbereitung von primären und sekundären Mtb H37Rv-Kulturen
    1. Nehmen Sie die Glycerinbrühe von -80 °C und tauen Sie die Brühe bei Raumtemperatur auf. Verwenden Sie vier unabhängige Stämme für biologische Vierlinge.
    2. 10 ml 7H9-Medium (Tabelle 1) mit 10 % ADC (9 ml 7H9-Medium und 1 mL ADC) werden in einen autoklavierenden 100-ml-Konuskolben mit Schraubverschluss gegeben.
      HINWEIS: 7H9 + ADC: 7H9 ist ein kommerziell hergestelltes nährstoffreiches Medium, zu dem wir ADC hinzufügen (ADC: Albumin, Dextrose und Katalase; Tabelle 2). Sowohl ADC als auch OADC können verwendet werden, um die Kultur zu erweitern. Konische Kolben sorgen für mehr Belüftung der Kultur; Man kann aber auch eine Gewebekulturflasche verwenden, um die Bakterienzellen zu züchten.
    3. Impfen Sie den gesamten Glycerinbestand auf das Medium, um die Kultur wiederzubeleben, die zur Primärkultur wird. Nehmen Sie eine600~0,8 wachsende Mtb-Kultur zur Herstellung von Glycerinaktien. 15% Glycerin und die wachsende Mtb-Kultur in einem Kryofläschchen mischen und bei -80 °C lagern.
    4. Inkubieren Sie die Kulturkolben bei 37 °C in einem Inkubatorschüttler für 3-4 Tage bei 100 U/min.
    5. Am 5. Tag ist die Extinktion bei 600 nm (A600) zu messen. Wenn die Kulturen A600 ~ 0,8-1 erreichen, verwenden Sie die Kultur zur Inokulation der Sekundärkultur bei A600 ~ 0,2 in 100 ml 7H9 +10 % ADC-Medium in einem 500 ml-Kolben. Führen Sie die gleichen Schritte für die Replikate aus.
      1. Messen Sie den A600 der Primärkultur. Wenn der A600 ~ 0,8 beträgt, wird die Kultur durch Zentrifugation bei 2100 x g für 10 min granuliert. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL 7H9 + 10 % ADC-Medium und messen Sie den A600. Berechnen Sie, wie viel Inokulum in 100 mL Sekundärkultur vonA 600 ~ 0,2 gegeben wird. Wenn beispielsweise der A600 ~ 4 verwendet wird, müssen 5 ml dieser Kultur zu 100 ml frischer 7H9 + 10 % ADC-Sekundärkultur von A600 ~ 0,2 hinzugefügt werden.
    6. Züchten Sie sie bei 37 °C in einem Inkubator-Shaker bei 100 U/min für 2-3 Tage bis OD A600 ~0,8.
    7. Entnehmen Sie 10 μl mit einer Pipette, die mit einer Filterspitze ausgestattet ist, und lokalisieren Sie die Kultur auf einer LB-Agar-Platte, die keine Antibiotika in der Bakterienhaube enthält. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 12-16 Stunden, um die bakterielle Kontamination (falls vorhanden) sichtbar zu machen. Entsorgen Sie die Kulturen und beleben Sie die neuen Kulturen des Experiments, wenn eine bakterielle Kontamination festgestellt wird.
  3. Bakterienwachstum in Sautons Medien
    1. Bei A600~0,8 inokulieren Sie Bakterien mit A600 ~0,2 in 100 mL Sauton-Medium in einem 500-ml-Kolben (Tabelle 3) und wachsen Sie 3-4 Tage lang, nachdem die OD ~0,8 erreicht hat.
    2. Verwendung von Kulturen, die bis A600 ~ 0,8 in Sauton-Medien (Sautons Primärkultur) gezüchtet wurden, zur Inokulation von Kulturen, die für die Herstellung von Kulturfiltrat verwendet werden sollen.
      HINWEIS: 7H9 + ADC ist ein nährstoffreiches Medium, das Albumin enthält. Albumin kann nicht in der Sekretomanalyse verwendet werden, da Albumin die Filtratproteine der Kultur maskieren kann. Daher werden die Medien von Sauton zur Herstellung von Kulturfiltrat verwendet. Die Herstellung des Sauton-Mediums erfolgt durch Rekonstitution der in Tabelle 3 genannten Komponenten.

2. Vorbereitung von Filtratproteinen der Mtb-Kultur

  1. Zentrifugation für Kulturüberstand
    1. Verwenden Sie die Sauton-Primärkultur zur Inokulation von 300 mL der Sauton-Sekundärkultur bei A600 ~0,2. Züchten Sie Kulturen, bis OD A600 ~0,4-0,5 beträgt. Verwenden Sie aktiv wachsende Kulturen in der frühen Log-Phase, um eine Kontamination durch abgestorbene Zellen zu vermeiden.
      1. Messen Sie die OD der Sekundärkultur. Wenn der Außendurchmesser A600 ~ 0,8 erreicht, wird die Kultur durch Zentrifugation bei 2.100 x g für 10 Minuten granuliert. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Pellet in 10 ml Sauton-Medium und nehmen Sie den OD erneut auf. Berechnen Sie, wie viel Inokulum aus dem gemessenen OD in eine 300-ml-Kultur mit 0,2 OD gegeben wird. Wenn der OD beispielsweise 8 beträgt, müssen 7,5 ml dieser Kultur zu 300 ml frischem Sauton-Medium mit 0,2 OD hinzugefügt werden.
        HINWEIS: Halten Sie sich an die erwähnte OD, um die Zelllyse und die GroEL-Kontamination zu reduzieren. GroEL ist ein Chaperon und wird konstitutiv in den Bakterienzellen exprimiert. Ein Teil der Literatur zeigte das Vorhandensein von GroEL in Kulturfiltraten aufgrund von Stress während des Wachstums. Hier verwenden wir das Sauton-Medium für die Herstellung von Kulturfiltrat, das den Zellen leichten Stress ausübt. daher kann GroEL im Kulturfiltrat vorhanden sein. Wenn der Kultur-OD mehr als 1 beträgt, findet außerdem eine Zelllyse statt, die zu einer GroEL-Kontamination im Kulturfiltrat führt.
    2. Pelletieren Sie 300 mL wachsender Kulturen in 6,50 mL Röhrchen bei 2.100 x g für 10 min bei 4 °C (Abbildung 1A).
    3. Entnehmen Sie 45 mL Überstand, wobei das Pellet unberührt bleibt, mit einer serologischen Pipette von 25 mL in ein jeweils neues Röhrchen. Bewahren Sie das Pellet für die Herstellung von Ganzzelllysat (WCL) beiseite.
    4. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 2.100 x g für 10 min bei 4 °C. 40 ml Überstand (5 ml Kultur unberührt lassen) mit einer serologischen 25-ml-Pipette in ein neues Röhrchen entnehmen und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
    5. Entnehmen Sie 35 mL des Überstands in ein frisches Röhrchen und filtrieren Sie den Kulturüberstand mit einem 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter. In ein frisches Rohr filtrieren, um pathogene bakterielle Kontaminationen zu beseitigen. Aus 300 ml Kultur werden 210 ml Kulturfiltrat pro Replikat zurückgewonnen.
      HINWEIS: Bei dem Filter, der hier zum Filtrieren von Kulturfiltrat verwendet wurde, handelt es sich um einen sterilen Spritzenvorsatzfilter von 0,22 μm (Typ SY25PL-S).
    6. Nach der Filtration des Kulturfiltrats wird 1 ml aliquot des filtrierten Kulturfiltrats auf eine Agarplatte geimpft und 4 Wochen lang im 37 °C-Inkubator inkubiert, um sicherzustellen, dass das Kulturfiltrat andere pathogene bakterielle Kontaminationen enthält. Nehmen Sie 1 ml Aliquot aus dem Ganzzelllysat (WCL) und befolgen Sie die gleichen Sicherheitsmaßnahmen.
    7. Wischen Sie die Probenröhrchen mit 75%igem Ethanol ab und nehmen Sie sie durch eine Passbox aus BSL-3.
  2. Herstellung von Ganzzelllysat (WCL)
    1. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 1x PBSG mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1x Proteaseinhibitor-Cocktail und überführen Sie das Lysat in 2 mL Schraubverschluss-Bead-Schlagröhrchen mit 1/3 Volumen von 0,1 mm Zirkonoxid-Kügelchen.
      HINWEIS: Das 1x PBSG setzt sich aus 1x PBS + 5% Glycerin zusammen. Nehmen Sie ein Gewichtsverhältnis von Pellet zu Puffer von 1:3.
    2. Lysieren Sie die Proben, indem Sie sie in einem Mini-Bead-Beater mit Perlen schlagen: 1 Minute Perlenschlagen, gefolgt von 2 Minuten Inkubation auf Eis. Wiederholen Sie dies 8x.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.000 x g für 15 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie ihn auf Eis.
    4. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Der Überstand wird durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter geleitet, um pathogene bakterielle Kontaminationen zu eliminieren.
      HINWEIS: Bei dem hier zum Filtern von Kulturfiltrat verwendeten Filter handelt es sich um einen sterilen Spritzenvorsatzfilter von 0,22 mm (Typ SY25PL-S).
    5. Wischen Sie die Proben mit 75 % Ethanol ab und entnehmen Sie sie durch eine Passbox aus BSL-3. Überprüfen Sie die Konzentrationen von Lysaten mit dem BCA-Assay-Kit, wie unten erwähnt. Lagern Sie die Lysate bei -80 °C.
  3. Konzentrieren Sie die Filtratproteine der Kultur mit Zentrifugalfiltereinheiten.
    1. Konzentrieren Sie 210 mL Mtb-Kulturfiltratproteine mit Hilfe von Zentrifugalfiltereinheiten. Verwenden Sie 3 kDa 15 mL Zentrifugalfiltereinheitsröhrchen (Zentronen), um das Kulturfiltrat in ~1 mL zu konzentrieren (Abbildung 1A). Die Röhrchen der 3-kDa-Zentrifugalfiltereinheit halten Proteine gleicher Größe oder größer als 3 kDa zurück.
    2. Geben Sie ca. 15 mL jedes Replikats des Kulturfiltrats in ein Zentrionröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 2.100 x g für 1 h bei 4 °C.
    3. Verwerfen Sie den Durchfluss gemäß den Normen und wiederholen Sie Schritt 2.3.2 für 15x–16x bis 210 mL des Kulturfiltratkonzentrats auf ~1 mL.
    4. Aliquotieren Sie 100 μl der konzentrierten Kulturproteine in zehn Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung und schätzen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit.
  4. Schätzung konzentrierter Proteine
    1. Schätzen Sie die Proteinkonzentration in Bezug auf BSA als Standard. Verwenden Sie 1 μg, 2 μg, 3 μg und 4 μg BSA in 25 μl Volumen in Duplikaten. Wenn die Probe unverdünnt war, verwenden Sie für die Schätzung eine 5x verdünnte (in PBS) Probe mit einem Volumen von 25 μl in Duplikaten. Die Schätzungen werden in 96-Well-Platten durchgeführt. Verwenden Sie eine Kontrolle ohne Probe (Blank) mit 25 μl PBS.
    2. Fügen Sie 175 μl gemischtes Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Proben mit Hilfe einer Mehrkanalpipette mischen und bei 37 °C 1 h inkubieren. Messen Sie die Messwerte bei 562 nm mit einem ELISA-Reader. Ziehen Sie die Werte von den leeren Werten ab, um Werte für BSA und die Stichproben zu erhalten.
    3. Passen Sie die Standardkurve an die lineare Regressionskurve an und schätzen Sie die Stichproben in Bezug auf die Norm. Befolgen Sie das BCA-Kit für das Handbuch zur Proteinschätzung.

3. Bestätigung von Kulturfiltratproteinen mit verschiedenen Markern

  1. Nachweis von Proteinen durch Coomassie-Färbung
    1. Um das Vorhandensein der Proteine im Kulturfiltrat zu bestätigen, nehmen Sie 30 μg Protein und lösen Sie 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE; Tabelle 4).
      HINWEIS: Befolgen Sie die Tabellenbeschreibung, um die SDS-PAGE-, Coomassie-Färbe- und Entfärbungslösungen als Puffer herzustellen.
    2. Geben Sie 20 ml Coomassie-Färbelösung (Tabelle 5) in das Gel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Wippen bei Raumtemperatur. Färbelösung verwerfen.
    3. Geben Sie 30 ml Entfärbungslösung (Tabelle 6) in das Gel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Entfärbungslösung und fügen Sie eine frische Entfärbungslösung hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das Gel richtig entfärbt ist.
    4. Überprüfen Sie den Proteinstreifen auf dem Trans-Illuminator (Abbildung 1B). Da das Kulturfiltratprotein mehrere Proteine enthält, ist nach der Entfärbung ein Streifen von Proteinbanden im Gel zu sehen (Abbildung 1B).
  2. Western-Blot-Bestätigung für sezernierte Proteinmarker
    1. Verwenden Sie den Antikörper des sezernierten Proteins, um das Vorhandensein des sezernierten Proteins im Kulturfiltrat zu überprüfen. Ag85B (ab43019) ist ein bekanntes Mtb-sezerniertes Protein in Kulturfiltrat und liegt im Zytosol vor; Der Ag85B-Antikörper (Konzentration 5 mg/ml) (1:5000 Verdünnung in 5% BSA) wird als Positivkontrolle für das sezernierte Protein verwendet.
    2. Beladen Sie eine WCL mit den Kulturfiltratproteinen, um zwischen der zytosolischen/membranischen und der sezernierten Proteinfraktion zu unterscheiden. Ag85B ist zytosolisch und sezerniert, daher sollte es in beiden Fraktionen vorhanden sein; andererseits ist bekannt, dass PknB an der Membran lokalisiert ist und im Kulturfiltrat nicht vorhanden ist.
    3. Bestimmen Sie die Konzentration von Proteinen in WCL/Kulturfiltrat mit Hilfe eines BCA-Kits. Mischen Sie 30 μg WCL/Kulturfiltrat mit 2x-Lamelli-Puffer in einem Volumen von 30 mL (Tabelle 7). Die Proben werden mit dem SDS-Gel-Runnimg-Puffer in 10 % SDS-PAGE für PknB und 12 % SDS-PAGE für Ag85B aufgelöst, bis die Farbstofffront den Boden erreicht (Tabelle 8). Lassen Sie die Farbstofffront nicht aus dem Gel abperlen.
      HINWEIS: Die Größe des Ag85B beträgt ~35 kDa, daher werden 12 % SDS-PAGE verwendet.
    4. Schneiden Sie eine 9 cm x 6 cm große 0,2 μm Nitrozellulosemembran für den Transfer (Tabelle 9) des Proteins aus dem Gel auf die Membran. Richten Sie den Transfer mit einer Transferkassette ein, indem Sie die Kassetten, Schaumstoffpads, Löschpapier, Gel und Membran in 1x eiskaltem Transferpuffer einweichen.
    5. Legen Sie das Schaumstoffkissen an eine Seite der Kassette, legen Sie dann ein Löschpapier hinein, legen Sie das Gel ein, legen Sie eine Nitrozellulosemembran auf das Gel, legen Sie wieder ein Löschpapier auf und legen Sie zuletzt ein weiteres Schaumstoffkissen auf und schließen Sie den Kassettenhalter. Setzen Sie den Kassettenhalter so in den Transfertank ein, dass die Membranseite zur Anode und die Gelseite zur Kathode zeigt.
    6. Schließen Sie die Kathode und das Anodenkabel an den Tank an, um das Setup zu schließen, und stellen Sie es für 120 min auf 120 mA Strom ein. Beginnen Sie mit der Übertragung in einem Kühlraum.
    7. Legen Sie die Membran nach dem Transfer in eine kleine Plastikbox. Blockieren Sie die Membran mit 10 mL 5%iger BSA-Lösung, die in 1x PBST20 hergestellt wurde, um die unspezifische Bindung für 1 h bei Raumtemperatur auf der Wippe zu reduzieren.
    8. Entfernen Sie die Blockierungslösung, fügen Sie 5-10 ml Primärantikörper hinzu, bei dem es sich um einen Anti-Maus-Ag85B-Antikörper handelt (1:5.000 Verdünnungen in 5%iger BSA-Lösung), und inkubieren Sie bei 4 °C über Nacht in einer Wippe. Lagern Sie den Antikörper bei -20 °C und verwenden Sie ihn bis zu 3x wieder.
    9. Entfernen Sie den primären Antikörper, fügen Sie 5-10 mL 1x PBST20 hinzu und waschen Sie die Membran 8 Minuten lang bei Raumtemperatur durch kräftiges Schütteln. Nehmen Sie die erste Wäsche heraus, fügen Sie erneut 5-10 mL 1x PBST20 hinzu und waschen Sie. Wiederholen Sie dies 2x.
    10. Geben Sie 5-10 ml 1x PBST20 mit Sekundärantikörper hinzu, bei dem es sich um einen Anti-Maus-Rotoxperoxidase (HRP)-konjugierten Antikörper (1:10.000 Verdünnung) handelt, und inkubieren Sie 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe.
    11. Die Membran wird nach dem Sekundärantikörper gemäß Schritt 3.2.9 gewaschen. Fügen Sie die gleiche Menge HRP-Substrat und Enhancer hinzu, um die Membran unter einem Chemiluminometer zu entwickeln (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Um das Fehlen einer zytosolischen Proteinkontamination zu bestätigen, untersuchten wir den Western Blot mit einem Anti-PknB-Antikörper (Abbildung 1C). Der Antikörper wurde am National Institute of Immunology, einer Tiereinrichtung, gegen die gereinigte extrazytoplasmatische Domäne von PknB gezüchtet. Man kann die PknB-Bande im WCL beobachten, nicht in den Kulturfiltraten, und PknB ist ausschließlich zytosolisch und membrangebunden und sollte nicht im Kulturfiltrat vorhanden sein.

4. Vorbereitung der Proben für die Massenspektrometrie

  1. Führen Sie einen Proteinverdau in Lösung durch Trypsin durch.
    1. Man nehme 100 μg Kulturfiltratprotein, füge 6x Volumen eiskaltes Aceton hinzu und halte es über Nacht bei -20 °C.
      HINWEIS: Verwenden Sie Glaswaren, um alle Reagenzien für die Massenspektrometrie-Probe vorzubereiten. Verwenden Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung und proteinarme Bindungsspitzen. Verwenden Sie kein Kunststoffmaterial, um Polymerverunreinigungen in der Massenspektrometrie zu vermeiden.
    2. Die Proteine durch Zentrifugation bei 18.000 x g bei 4 °C für 30 min ausfällen. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Das Pellet mit 500 μl Aceton waschen, das Pellet bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C abspritzen. Entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie das restliche Aceton mit Hilfe eines Vakuumkonzentrators.
    4. 20 μl 8 M Harnstoff, gelöst in 25 mM Ammoniumbicarbonat (2 M Stoff, in MS-Wasser hergestellt), zugeben. Die Proben vortexen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Ad 60 μl 25 mM Ammoniumbicarbonat zur Verdünnung von 8 M Harnstoff zu 2 M. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. 4 μl TCEP (10 mM Endkonzentration in 25 mM Ammoniumbicarbonat) zugeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und bei 1.800 x g schütteln.
    6. 4 μl IAA (25 mM Endkonzentration in 25 mM Ammoniumbicarbonat) zugeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und im Dunkeln bei 1.800 x g schütteln. 110 μl 25 mM Ammoniumbicarbonat zugeben.
    7. Fügen Sie Trypsin hinzu (1:20; Trypsin: Protein in μg) in die Lösung geben und bei 37 °C halten, bei 300 U/min schütteln, für den Aufschluss über Nacht (Abbildung 2). Stoppen Sie die Aufschlussreaktion durch Zugabe von 10% TFA (Trifluoressigsäure). Vakuumieren Sie die Proben vollständig zum Trocknen.
  2. Entsalzung der Probe
    1. Fügen Sie den verdauten Peptiden 100 μl 5 % ACN + 0,1 % TFA hinzu. 30 min bei 1.500 U/min bei Raumtemperatur vortexen.
    2. Zentrifugieren Sie bei 18.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Den Überstand (Peptid) ohne Berührung des Pellets in frische Mikrozentrifugenröhrchen zu geben und mit der Entsalzung fortzufahren. Stellen Sie alle Wasch- und Elutionslösungen vor dem Entsalzungsschritt her.
    3. Äquilibrieren Sie die C-18-Säulenspitze mit 100 μl 100 % ACN + 0,1 % TFA, indem Sie die Lösung pipettieren und den Vorgang 5x wiederholen.
    4. Fügen Sie 100 μl 50 % ACN + 0,1 % TFA hinzu und wiederholen Sie den Vorgang 5x. Fügen Sie 100 μL 5 % ACN + 0,1 % TFA hinzu und wiederholen Sie den Vorgang 5x.
    5. Lassen Sie die Peptidbindung in der C-18-Säulenspitze stattfinden, indem Sie 30x pipettieren. Halten Sie die Lösung bei -20 °C, bis die Probe für die Massenspektrometrie verarbeitet wird. Nun wird das Peptid an die C-18-Säule gebunden.
    6. Waschen Sie die C-18-Säule mit 100 μl Wasser in MS-Qualität + 0,1 % TFA durch Pipettieren und wiederholen Sie den Vorgang 5x.
    7. Waschen Sie die C-18-Säule mit 100 μl 5 % ACN + 0,1 % TFA durch Pipettieren und wiederholen Sie den Vorgang 5x. Eluieren Sie die Peptide aus der C-18-Säule in 100 μl 50 % ACN + 0,1 % TFA durch 30-faches Pipettieren (Abbildung 2).
      HINWEIS: Nach der Elution kann die C-18-Säulenspitze bei 4 °C gelagert werden, bis die Massenspektrometrie abgeschlossen ist.
    8. Vakuumieren Sie das eluierte Peptid vollständig und lagern Sie es bei -20 °C, bis die Probe für die Massenspektrometrie abgegeben wird.
  3. Injektion der Peptidproben in eine Massenspektrometrie.
    1. Geben Sie 20 μl Lösung A (von der Massenspektrometrie-Einrichtung zur Verfügung gestellt) zu den getrockneten Peptidproben. Die Proben 30 min lang vorläufig und 90 min bei 4 °C zentrifugieren.
    2. Injizieren Sie 20 μl der Probe in das Massenspektrometriegerät für einen 90-minütigen Gradientenlauf.

5. Datenanalyse für sezernierte Proteine, die im Kulturfiltrat vorhanden sind

  1. Protein-Identifizierung
    1. Analysieren Sie Proteomik-Proben mit dem Quadrupol-Massenspektrometer. Fragen Sie die erhaltenen Spektren mit der Mtb H37Rv UniprotKB-Datenbank ab.
    2. Die Massentoleranzen für Vorläufer und Fragmente werden auf 10 ppm und 0,5 Da eingestellt. Das Enzym wird auf Trypsin mit einem maximalen Wert für die verpasste Spaltung von zwei eingestellt.
    3. Verwenden Sie die Proteom-Software mit Sequest als Suchalgorithmus mit der Carbamidomethylierung von Cystein als feste Modifikation.
    4. Identifizieren Sie alle Peptid-Spektrum-Übereinstimmungen (PSM) mit einer Falschentdeckungsrate von 1 %. Wenden Sie die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter an.
    5. Ordnen Sie die rohen Massenspektrometrie-Dateien der Peptidsequenz mit der UniProt-ID der jeweiligen Mtb-Proteine ab. Listen Sie alle Mtb-Proteine, ihre Uniprot-IDs und die funktionelle Klassifizierung mithilfe der Mycobrowser-Datenbank auf.
    6. Für die weitere Analyse ordnen Sie die UniProt-IDs der identifizierten Proteine ihrer jeweiligen Rv-Nummer zu. Hinterlegen Sie die massenspektrometrischen Sekretomdaten über den PRIDE-Partner beim ProteomeXchange-Konsortium.

6. Behandlung von H37Rv mit Kulturfiltratprotein, um die Veränderung der Signalübertragung des Wirts zu überprüfen

  1. Isolierung von Peritonealmakrophagen aus Mäusen.
    HINWEIS: Befolgen Sie die Referenz21 für die Isolierung von Peritonealmakrophagen, die Aussaat der Zellen und die Infektion.
    1. Injizieren Sie Balb/c-Mäusen (im Alter von 4-6 Wochen) 1 ml 4 % Thioglykolat und isolieren Sie Peritonealmakrophagen aus dem Peritoneum der Maus am 4. Tag der Infektion21 (Abbildung 3).
    2. Sammeln Sie die Makrophagenzellen, indem Sie 1x PBS in das Peritoneum der Maus injizieren. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 1.800 x g , verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml 1640-RPMI-Medium hinzu, das mit 10 % FBS (fetales Rinderserum; vollständiges Medium) und 1x Pen-Streptokokken (Antibiotika) ergänzt wird.
    3. Säen Sie 3 x 105 Zellen pro Well in 24 Well-Platten und inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 °C Inkubator. Tauschen Sie das Medium am nächsten Tag in ein frisches, vollständiges Medium aus, und die Zellen sind bereit für die Infektion oder Behandlung mit Kulturfiltratproteinen.
  2. Behandlung von Peritonealmakrophagen mit Kulturfiltratproteinen
    1. Bringen Sie die Makrophagenzellen zu BSL-3 und bewahren Sie sie im Inkubator auf. Behandeln Sie die Zellen mit 1 mg/ml Kulturfiltratproteinen (Abbildung 3). Ernten Sie die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten von 4 h, 24 h und 48 h nach der Filtratbehandlung.
      1. Aussaat der isolierten Makrophagenzellen in 24-Well-Platten in dreifacher Ausfertigung zu jedem Zeitpunkt. Die Zellen werden mit 1 mg/ml Kulturfiltratproteinen behandelt und bei einem 37 °C heißen Inkubator in Gegenwart von CO2 inkubiert. Ernten Sie die Zellen zu drei Zeitpunkten, 4 h, 24 h und 48 h nach der Behandlung.
      2. Behandeln Sie die Zellen mit i) 2x-Lamellenpuffer, um die Makrophagenzellen zu lysieren und durch Western Blotting auf verschiedene Wirtszellmarker zu prüfen, und ii) verschiedenen Puffern für die immunologischen Assays, die von den Herstellern zusammen mit den Kits bereitgestellt werden.
    2. Bereiten Sie Zelllysate des Wirts vor und prüfen Sie auf verschiedene Marker, Zytokin-Profiling der Wirtszellen und verschiedene Proteinexpressionen des Signalwegs auf Kulturfiltrat-behandelten Makrophagenzellen.
      HINWEIS: Wenn ein Labor eine Genersatzmutante des sekretorischen Signalwegproteins hat, können Kulturfiltrate, die aus Mtb H37Rv und der Mtb-Mutante hergestellt wurden, verwendet werden, um deren Einfluss auf die immunmodulatorischen Parameter des Wirts zu bewerten.

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Ergebnisse

In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von Kulturfiltratproteinen aus Mykobakterien demonstriert (Abbildung 1A). Die Kulturfiltratproteine wurden dann auf die verschiedenen Marker überprüft, um die Isolierung des Kulturfiltrats zu bestätigen. Wie im Protokoll erwähnt, wurde eine Coomassie-Färbung durchgeführt, um die Proteinbeladung zu überprüfen. Man kann eine gestreifte Proteinbande in der WCL-Fraktion (auf der letzten Spur Abbildung 1B) beobach...

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Diskussion

Einer der wichtigsten Forschungsbereiche betrifft das Verständnis der Mtb-Pathogenese und die Entwicklung wirksamer Diagnostika und Impfstoffe22,23. Die Isolierung von Kulturfiltratproteinen aus Mtb-Kulturmedien ist ein Verfahren, das die Identifizierung der vom Erreger sezernierten Virulenzfaktoren ermöglicht. Die Untersuchung der Rolle sekretorischer Proteine bei der Modulation der Mtb-Pathogenese lie...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; m SpritzenvorsatzfiltermdiSYPL0601MNXX204
0,2µ m NitrozellulosemembranAmersham10600001
37% HClMerckH1758
AcetonEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonytrileSigma-Aldrich34851-2L
AcrylamidBIORAD1610107
AlbuminBio Basic KanadaKat.-Nr.: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
AmmoniumbiocarbonatSigma-Aldrich09830-500G
AmmoniumpersulpahteSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
Anti-Maus HRP konjugierter SekundärantikörperThermo Fischer62-6520
AsparaginSigma-AldrichA0884-500G
Bis-AcrylamidSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 SäuleThermo FischerSEM SS18V
Katalase Sigma-AldrichC1345
ZitronensäureSigma-AldrichC0759-500G
DextroseSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Middle Brook 7H9 Brühe   Fisher Scientific271310
Eisenammonium(III)-citratSigma-AldrichF5879-100G
Ameisensäure 98-100%MerckZ0823704246
Eisessig 100%MerckCD0C700160
GlycinSigma-AldrichG8898-1KG
GlycinSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Westliches Chemilumineszenz-HRP-SubstratMerckWBKLS0500
IodacetamidAmershamRPN6302V
MagnesiumsulpahteSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
ÖlsäureSigmaKat.-Nr.: O1008
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (Proteomik-Experimente - Peptidsequenzierung, Proteinidentifizierung und -quantifizierung)Thermo Fischer Scientific
NatriumchloridSigmaKat Nr.: S3014
NatriumchloridSigma-AldrichS7773-1KG
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt Protein Datenbank
UreaMP Bio194857

Referenzen

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