Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.
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Methodenartikel
Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aus der Nabelschnur gewonnene mesenchymale Stroma-/Stammzellen (UC-MSCs) weisen eine geringe Immunogenität und starke immunmodulatorische Wirkungen bei der Behandlung verschiedener Krankheiten auf. Humane UC-MSCs sind eine heterogene Population, die aus drei Hauptsubpopulationen mit unterschiedlichen Zellformen, Proliferationsraten, Differenzierungsfähigkeiten und immunregulatorischen Funktionen besteht. Zuvor wurde festgestellt, dassBAMBI-hoheMFGE8-hohe UC-MSCs, die erste Untergruppe, die erfolgreich aus UC-MSCs isoliert wurde, die Lupusnephritis nicht lindern konnte. Daher ist die Funktion und der zugrundeliegende Mechanismus dieser Untergruppe in der MSC-Therapie bei Krankheiten unbekannt. Es ist notwendig, BAMBI-hoheMFGE8-hohe UC-MSCs in Bezug auf ihren Phänotyp, ihren Metabolismus und ihre Funktion zu isolieren und weiter zu untersuchen, um die Natur dieser MSC-Untergruppe vollständig zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierungder BAMBI-High-MFGE8-High-Subpopulation aus humanen UC-MSCs. Die Subpopulation der UC-MSCs wird durch durchflusszytometrische Sortierung mit zwei Oberflächenmarkern, BAMBI und MFGE8, markiert. Die isolierten Zellen werden kultiviert und durch Durchflusszytometrie verifiziert. Die spezifischen Gene, die in denBAMBI-hohenMFGE8-hohen UC-MSCs exprimiert werden, werden mittels RT-qPCR identifiziert. Dieses Protokoll führt zu einer hocheffizienten und reinen Zellsortierung und beschreibt die Markerprofile der BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs.
Einleitung
Humane mesenchymale Stroma-/Stammzellen (MSCs) sind somatische Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich in Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten und andere Zelltypen zu differenzieren1. MSCs wurden zuerst aus dem Knochenmark isoliert und stammen weitgehend aus der Nabelschnur, dem Fettgewebe und anderen Geweben2. Da UC-MSCs leicht zu beschaffen sind und eine geringe Immunogenität und immunsuppressive Wirkung aufweisen, werden sie in klinischen Studien häufig zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt 3,4,5. Obwohl die MSC-Therapie ein vielversprechendes Potenzial für die Behandlung von Krankheiten zeigt, sind die therapeutischen Wirkungen bei den Individuen uneinheitlich6. Der Grund für die Instabilität der MSC-Therapie ist jedoch noch unklar.
Molekulare Fluktuationen, Morphologie, Differenzierungsfähigkeit und therapeutische Funktion bilden die Heterogenität der MSC. Einige Studien haben auch postuliert, dass MSCs Subpopulationen mit unterschiedlichen Funktionen darstellen 7,8 und die MSC-Heterogenität mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) untersucht9,10. Die Ergebnisse zeigten, dass humane UC-MSCs unterschiedliche Subpopulationen mit spezifischen transkriptomischen Merkmalen aufweisen, während es nur wenigen Studien gelungen ist, sogenannte MSC-Subpopulationen zu isolieren. Zuvor haben wir humane UC-MSCs anhand ihrer Signaturen mittels scRNA-seq und bioinformatischer Analyse in drei Untergruppen zerlegt, wobei die BAMBI-Subpopulationmit hohemMFGE8-hohem UC-MSC-Gehalt weiter gereinigt und funktionell getestet wurde11. Diese Untergruppe konnte die Lupusnephritis jedoch nicht lindern. Daher ist es notwendig, die therapeutische Wirkung von BAMBIhochMFGE8hoch MSCs bei anderen Erkrankungen zu testen, um ihre authentischen Funktionen zu verstehen.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierungder BAMBI highMFGE8 high Subgruppe aus humanen UC-MSCs mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) mittels Durchflusszytometrie und die Eigenschaftender BAMBI highMFGE8 high Subgruppe.
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki von 1989 durchgeführt und von der Ethikkommission des Affiliated Drum Tower Hospital der Nanjing University Medical School genehmigt (Zulassungsnummer: 202019701). Menschliche Nabelschnüre wurden von gesunden Müttern am Affiliated Drum Tower Hospital der Nanjing University Medical School nach natürlichen Wehen gewonnen, die ihre informierte Zustimmung zu ihrer Verwendung in dieser Arbeit gaben. Primäre UC-MSCs wurden, wie bereits berichtet, aus humanen Nabelschnüren isoliert11.
1. UC-MSC-Kultur und Identifizierung vor der Isolierung
- Sobald die MSCs 70-80% Konfluenz (P0) erreichen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min bei 37 °C hinzu. Fügen Sie dann 9 ml vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 × g , um die Zellen zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie das entsprechende vollständige Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen in jeder Schale werden in drei T75-Kolben (P1) überführt und in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
- Nachdem Sie die UC-MSCs 2x durch Trypsinisierung passiert haben, ernten Sie die Zellen bei P3 mit den gleichen Schritten, die in Schritt 1.1 beschrieben wurden. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Färbepuffer (1x PBS mit 2% FBS) und zählen Sie sie. Geben Sie FACS-Färbepuffer bis zu einer Endkonzentration von 5-10 × 106 Zellen/ml und halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Verteilen Sie 100 μL pro Röhrchen dieser Zellsuspension auf verschiedene 1,5 mL Röhrchen. Geben Sie Isotypkontrollen und FACS-Antikörper gegen CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 und HLA-DR (alle bei 1:200) bei 4 °C für 30 min in die Zellen.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit dem FACS-Färbepuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min. Den Überstand verwerfen und die Ausfällungen in 200 μl FACS-Färbepuffer für die durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung von MSC-Markern resuspendieren.
2. Isolierung von BAMBI-hohen MFGE8-hohen UC-MSCs durch Durchflusszytometrie
- Kultur von UC-MSC mit einer Dichte von ca. 5-10 × 106 Zellen bei der Isolierung von BAMBI-hohen MFGE8-hohen UC-MSCs. Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,5 mM EDTA, bis sie eine runde Morphologie annehmen, fügen Sie das gesamte Medium hinzu, um die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu übertragen, und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Gesamtzahl der geernteten Zellen zu berechnen. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen mit der Zellsuspension bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu sammeln.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Medium auf eine Endkonzentration von 5-10 × 106 Zellen/ml und halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Teilen Sie die Zellen in vier 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf (nur leere Zellen; BAMBI-markierte Zellen; MFGE8-markierte Zellen; und sowohl BAMBI- als auch MFGE8-markierte Zellen).
- Geben Sie primäre Antikörper in geeigneten Konzentrationen (MFGE8 und BAMBI, beide bei 1:100) in die Röhrchen, mischen Sie die Zellen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die markierten Zellen einmal mit 1x PBS und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300×g. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Medium, fügen Sie den Zellen konjugierte fluoreszierende Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647, alle im Verhältnis 1:1.000) hinzu, mischen Sie die Zellen und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die markierten Zellen einmal mit 1x PBS, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl vollständigem Medium, filtrieren Sie durch ein 70-μm-Zellsieb, um Klumpen und Ablagerungen zu entfernen, und überführen Sie das Filtrat in ein 15-ml-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Sortierung.
- Führen Sie das leere Zellröhrchen ohne Zugabe eines Antikörpers (Negativkontrolle) durch und passen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) an, um die Skala der negativen Population mit Antikörperfärbung zu begrenzen.
- Führen Sie die einzelnen Antikörper-markierten Zellröhrchen (d. h. MFGE8 + Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 488 oder BAMBI + Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 647) als Gating-Kontrolle aus, um zu bestimmen, wo die Positivität im Diagramm beginnt.
- Führen Sie die Versuchsprobenröhrchen aus, um die BAMBI-Population mithohem MFGE8-Gehalt zu sortieren und zu sammeln.
- Tellern Sie die sortierten BAMBIhighMFGE8high MSCs in eine 24-Well-Platte und kultivieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2.
- Wenn die sortiertenBAMBI highMFGE8 high MSCs zwei Passagen lang gewachsen sind, um genügend Zellen zu erhalten, dissoziieren Sie die Zellen und führen Sie eine Nachsortieranalyse durch, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie sicherzustellen, wie in den Schritten 2.1 bis 2.9 beschrieben. Alternativ kann die Reinheit der sortierten Zellen mit konventioneller Immunfluoreszenz gegen humane BAMBI- und MFGE8-Expression untersucht werden, wenn die Anzahl der gesammelten Zellen zu gering ist.
3. Charakterisierungder BAMBI high MFGE8 high MSCs
- Züchten Sie die sortierten BAMBIhighMFGE8high MSCs in einer 12-Well-Platte, untersuchen Sie ihre Zellmorphologie unter dem Mikroskop und vergleichen Sie sie mit der von unsortierten MSCs.
HINWEIS: Im Allgemeinen wachsen BAMBI-Zellenmit hohem MFGE8-Gehalt schneller als unsortierte UC-MSCs. - Wenn die Zellen zu etwa 90 % in der 12-Well-Platte konfluiert sind, aspirieren Sie das Zellkulturmedium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und geben Sie 500 μl RNA-Extraktionsreagenz zu den Zellen. Schütteln Sie die Platte langsam bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
- Pipettieren Sie das Gemisch und geben Sie es in ein RNase- und DNase-freies Röhrchen. Fügen Sie 100 μl Chloroform hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und schütteln Sie die Mischung kräftig, indem Sie sie 15 s lang vortexen. Lassen Sie die Röhre dann 3 Minuten lang bei RT stehen.
- Das Röhrchen 15 min lang bei 11.000 × g und 4 °C zentrifugieren.
- Übertragen Sie ca. 200 μl der oberen wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen. Geben Sie die gleiche Menge Isopropanol hinzu und pipettieren Sie mehrmals gründlich auf und ab. Lassen Sie die Mischung dann 10 Minuten bei RT stehen.
- 15 min bei 11.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
- Geben Sie 500 μl 75%iges Ethanol in das Pellet in der Tube und drehen Sie die Tube mehrmals vorsichtig um.
- Das Röhrchen 5 min lang bei 6.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Zentrifugation einmal für 10 s bei 6.000 × g, saugen Sie die restliche Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette ab und trocknen Sie das Röhrchen bei RT.
- Fügen Sie 10 μl RNase-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen, und messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Erststrang-cDNA aus bis zu 1 μg Gesamt-RNA zu synthetisieren.
- Verwenden Sie ein qPCR-Kit, um die Genexpression gemäß den Anweisungen des Herstellers nachzuweisen und zu quantifizieren.
HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten DNA-Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Expressionsprofile der Zelloberflächenmarker von humanen UC-MSCs. Kultivierte MSCs waren stark positiv für die CD44-, CD73-, CD90- und CD105-Expression und negativ für die CD14-, CD34-, CD45-, CD79- und HLA-DR-Expression. Die BAMBI-hohen MFGE8-hohen MSCs wurden aus kultivierten humanen UC-MSCs sortiert und ihre BAMBI- und MFGE8-Expression wurde nach einer Expansion über 3-4 Passagen mittels Durchflusszytometrie erneut analysiert (Abbildung 2
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie die BAMBI-Subpopulationmit hohemMFGE8-Gehalt aus humanen UC-MSCs isoliert und angereichert werden kann. Die Methode ist wichtig für die weitere Untersuchung der Morphologie, des Wachstums und der Funktion dieser MSC-Untergruppe. Einige Schritte sind entscheidend für die erfolgreiche Isolierung und hohe Ausbeute von BAMBI-Zellenmit hohemMFGE8-Gehalt.
Erstens, der kritischste technische...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 82271843) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Beijing Labgic Technology | MCT-001-150 | |
| 100 mm Zellkulturschale | Beijing Labgic Technology | 12311 | |
| 12-Well-Platte | Beijing Labgic Technology | 11210 | |
| 15-ml-Zentrifugenröhrchen | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00115 | |
| 24-Well-Platte | Beijing Labgic Technology | 11310 | |
| 50-ml-Zentrifugenröhrchen | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 mL Rohre mit rundem Boden | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ m cell Sieb | Falcon | 352350 | Verdünnung: 1:1000 |
| APC anti-human CD79a (Igα) Antikörper | BioLegend | 333505 | 581 Verdünnung: 1:200 |
| APC/Cyanin7 Anti-Human-CD73 (Ecto-5'-Nukleotidase) Antikörper | BioLegend | 344022 | G46-6 Verdünnung: 1:200 |
| APC-Cy7 Maus IgG1, κ Isotypkontrolle | BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (Isotyp-Kontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| BAMBI-Antikörper | Bioss | bs-12418R | |
| Brilliant Violet 510 Anti-Maus/humaner CD44-Antikörper | BioLegend | 103044 | 5E10 Verdünnung: 1:200 |
| Brilliant Violet 510 Ratte IgG2b, κ Isotyp Ctrl Antikörper | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (Isotypkontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| CD105 (Endoglin) monoklonaler Antikörper APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Verdünnung: 1:200 |
| Zellzählkammer Objektträger | Shanghai QIUJING | XB-K-25 | |
| Zentrifuge | Peking BAIYANG | BY-320C | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Chloroform | XILONG Scientific | 13700908 | |
| DMEM/F-12 (1:1) basisch (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNASE-frei | Invitrogen | AM9260G | Verdünnung: 1:1000 |
| Ethanol | XILONG Scientific | 12803405 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Maus Anti-Human CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Verdünnung: 1:200 |
| FITC Maus Anti-Human CD45 | BD Bioscience | 555482 | AD2 Verdünnung: 1:200 |
| FITC Maus Anti-Human HLA-DR | BD Bioscience | 555811 | SN6 Verdünnung: 1:200 |
| Durchflusszytometer | BD Bioscience | FACSAria™ III ZellsortiererAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Reagenz für sanfte Zelldissoziation | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| Ziege Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Verdünnung: 1:200 |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Verdünnung: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix für qPCR (+gDNA Wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| Inverse Mikroskope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Isopropylalkohol | XILONG Scientific | 12802505 | |
| MFGE8 Antikörper | Biorbyt | orb388429 | Verdünnung: 1:100 |
| Mikrozentrifuge | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| Maus IgG1 kappa Isotypkontrolle APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (Isotypkontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| Maus IgG1 kappa Isotypsteuerung FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (Isotypkontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| Maus IgG2b kappa Isotypsteuerung FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (Isotyp-Kontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Shanghai) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Maus Anti-Human-CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (Isotyp-Kontrolle) Verdünnung: 1:200 |
| PE-Cy5 Maus IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle | BD Bioscience | 550618 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Cytiva | SV30010 | Verdünnung: 1:100 |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems byThermo Fisher | Scientific Q6 | |
| RNasefreies Wasser | QIAGEN | 129112 | |
| Spektralphotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop One (840-317400) | |
| Sterile Mikropipettenspitzen | Beijing Labgic Technology | Verdünnung: 1:100 | |
| T75 Zellkulturflasche | Beijing Labgic Technology | 13212A | |
| Thermocycler | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Veriti | |
| Tri Reagenz | Sigma Aldrich | T9424 | |
| Typsin-EDTA Lösung | Bio-Channel Biotechnologie | BC-CE-005 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
