Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zur Entfernung der Statozyste und des assoziierten Gewebes im Ctenophor Mnemiopsis leidyi, das für die Live-Bildgebung zugänglich ist.
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Methodenartikel
Chirurgische Entfernung eines komplexen Sinnesorgans in hochregenerativen Ctenophoren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Ctenophor Mnemiopsis leidyi ist ein klassisches Tiermodell der Ganzkörperregeneration. Die erhöhte Nachvollziehbarkeit vieler Labortechniken und ihre phylogenetische Einordnung als wahrscheinliche Schwestergruppe der verbleibenden Metazoen hat in jüngster Zeit zu einem erneuten wissenschaftlichen Interesse an der Arbeit mit Ctenophoren geführt. Sie können jedes fehlende Organ oder jeden Zelltyp regenerieren, einschließlich der vollständigen Ganzkörperregeneration aus einem Fragment, das nur ~15% des Körpers ausmacht, im Laufe weniger Tage. Wie die meisten Ctenophoren haben M. leidyi ein aboral lokalisiertes, schwerkraftempfindliches Organ, das den sensorischen Input mit dem motorischen Output verbindet, um ihre Körperposition und -orientierung zu steuern. Dieses Protokoll demonstriert die chirurgische Entfernung des Komplexes des aboralen Organs (AO) und der damit verbundenen Strukturen bei M. leidyi sowie Kultivierungs-, Handhabungs- und Montagemethoden, die geeignet sind, die Prozesse der Wundheilung und -regeneration abzubilden, die in den folgenden Stunden bis Tagen stattfinden. Diese einfachen Techniken sind weitgehend an verschiedene experimentelle Paradigmen und Laborkontexte anpassbar.
Einleitung
Ctenophoren, auch bekannt als Rippenquallen sind kosmopolitisch für die Meeresumwelt der Erde und können eine wichtige Rolle in Ökosystemen spielen, insbesondere als Teil des Nahrungsnetzes. Der Ctenophor Mnemiopsis leidyi ist ein geschichtsträchtiges und zunehmend populäres Tiermodell der Ganzkörperregeneration 1,2. Ihre Fähigkeit, fehlende Organe oder Zelltypen zu regenerieren, entsteht gegen Ende der Embryogenese und bleibt während ihrer gesamten postembryonalen Lebenszeit bestehen 3,4 (~0,1 bis >1.000 mm Körpergröße). Sie sind außerdem während ihrer gesamten Lebensdauer transparent und können für verschiedene Live- und stationäre Bildgebungsverfahren verwendet werden. Der jüngste gemeinsame Vorfahre aller Ctenophoren hatte viele Zelltypen und komplexe Organe; Die meisten heute existierenden Ctenophoren besitzen die meisten davon während mindestens eines Lebensstadiums: ein aborales, schwerkraftempfindendes Organ (historisch als apikales Organ und hier als aborales Organ bezeichnet, AO), spezialisierte lokomotorische Strukturen, die aus hochorganisierten Makrozilien bestehen, die koordiniert schlagen (Kammreihen), einziehbaren Fresstentakeln und Photozyten, die als Reaktion auf schädliche Reize biolumineszieren (Abbildung 1).
Trotz ihrer zahlreichen Zelltypen und komplexen, kontextabhängigen Verhaltensweisen unterstützt ein robuster Bestand an genomischen Daten die Einordnung von Ctenophoren als wahrscheinliche Schwestergruppe aller anderen lebenden Tiere 5,6,7,8. Wesentliche Unterschiede in der zellulären und funktionellen Basis des Nervensystems des Ctenophors im Vergleich zu anderen Tieren mit einem Nervensystem (Bilaterien und Nesseltiere) haben die Hypothese nahegelegt, dass das Nervensystem des Ctenophors einen unabhängigen Ursprung darstellt; Dies bleibt jedoch ungewiss 9,10,11,12.
Der aborale sensorische Organkomplex umfasst die Statozyste, die viele Zelltypen umfasst, einschließlich mehrerer Arten von mutmaßlichen neurosensorischen Zellen 13,14,15,16,17,18, und in unmanipulierten Ctenophoren unter ständiger Wartung steht. Mechanosensorische Zellen tragen große Ziliarbündel, die von einem Statolithen aus biomineralisierten Zellen (Lithozyten genannt) abgelenkt werden, um die Schwerkraft zu erkennen. Zwei "polare Felder", die mutmaßliche sensorische Strukturen unbekannter Funktion14 und wahrscheinliche photosensorische Zellen16 enthalten, befinden sich neben der Statozyste.
Die experimentelle Untersuchung der Regenerationsfähigkeit von M. leidyi erstreckte sich von den kleinsten Tieren am Übergang vom Embryo zum Schlüpfling (~100 μm) bis zu den freilebenden makroskopischen Erwachsenen (>2 cm). M. leidyi mit einem Körperdurchmesser von ~1 mm sind groß genug, um eine manuelle chirurgische Manipulation ohne spezielle Instrumente wie Mikromanipulatoren zu ermöglichen, aber klein genug, um auf einem Standard-Objektträger montiert zu werden, um die Bildgebung mit Hochleistungsobjektiven zu ermöglichen. Dieses Protokoll demonstriert die chirurgische Entfernung des aboralen Sinnesorgans und der damit verbundenen Strukturen sowie Kultivierungs- und Bildgebungsmethoden, die geeignet sind, die Prozesse der Wundheilung und -regeneration zu dokumentieren, die in den folgenden Stunden bis Tagen stattfinden.
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Protokoll
1. Bereiten Sie Werkzeuge und Verbrauchsmaterialien vor
- Ziehen Sie mit einem handelsüblichen Bunsenbrenner die Glasdissektionsnadeln von Hand aus Glaskapillar-Mikropipetten. Verwenden Sie für Tiere über 1 mm kalibrierte Mikropipetten aus Kalknatronglas, die für die Handhabung von Flüssigkeiten vorgesehen sind.
HINWEIS: Die Größe von 100 μl funktioniert gut über einen Brennweitenbereich von 0,5 bis 3 mm.- Stellen Sie einen scharfen blauen Flammenkegel in den Bunsenbrenner ein.
- Halten Sie den Mittelpunkt der Glaspipette in die Flamme, bis er weich genug ist, um sich unter sanftem Druck zu bewegen.
- Nehmen Sie die Pipette von der Flamme und ziehen Sie die beiden Seiten sofort gerade auseinander, um eine kurze, starke Nadel zu erhalten.
HINWEIS: Das Glasnadelmaterial kann wieder eingeschmolzen werden, wenn beim ersten Versuch kein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wurde, und abgebrochene Nadeln können aufbewahrt und wieder gezogen werden. In Abbildung 2 finden Sie Beispiele für verwendbare und unbrauchbare Nadeln, die mit dieser Methode gezogen wurden.
ALTERNATIVE: 26 G 1/2 Zoll Nadeln funktionieren auch gut, insbesondere am größeren Ende des Brennweitenbereichs.
- Bereiten Sie steriles Meerwasser vor, indem Sie natürliches oder künstliches Meerwasser durch einen 0,22 μm Filter leiten.
- Erstellen Sie Messpipetten.
- Schneiden Sie mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge eine Transferpipette aus Kunststoff so ab, dass eine Öffnung mit dem Innendurchmesser der gewünschten Größe entsteht. Halten Sie mindestens eine Pipette für den oberen Rand des gewünschten Bereichs und eine für den unteren Rand des gewünschten Bereichs bereit. In Abbildung 3 sehen Sie ein Beispiel für einen Satz Messpipetten.
HINWEIS: Diese Pipetten funktionieren gut bis zu ~8 mm. Es ist auch möglich, die Größe mit einem Mikrometer oder Messwerkzeugen anhand von Fotos zu schätzen.
- Schneiden Sie mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge eine Transferpipette aus Kunststoff so ab, dass eine Öffnung mit dem Innendurchmesser der gewünschten Größe entsteht. Halten Sie mindestens eine Pipette für den oberen Rand des gewünschten Bereichs und eine für den unteren Rand des gewünschten Bereichs bereit. In Abbildung 3 sehen Sie ein Beispiel für einen Satz Messpipetten.
2. Bereiten Sie die Tiere auf den Versuch vor
- Wählen Sie morphologisch normale Individuen der gewünschten Größe und des gewünschten Stadiums aus.
HINWEIS: Wir finden, dass Tiere mit einem Durchmesser von ~0,5-3 mm optimal für die Montage auf Dias sind. Vergewissern Sie sich, dass die Tiere nicht in die Pipette der unteren Größenklasse passen, aber bequem in die Pipette der oberen Größenklasse. - Versuchstiere 8-16 h aushungern lassen.
HINWEIS: Während M. leidyi optisch transparent und nicht stark autofluoreszierend sind, ist die Nahrung, die durch ihr Verdauungssystem zirkuliert, im Allgemeinen undurchsichtig und oft autofluoreszierend.
3. Schnitte durchführen
- Verwenden Sie eine Transferpipet, die breiter ist als die Körpergröße des Versuchstieres, um es in eine 35-mm-Styroporschale mit sterilem Meerwasser zu übertragen.
- Visualisieren Sie die Probe mit dem Präpariermikroskop. Rollen Sie ein Tier auf die adesophageale Seite (Abbildung 1). Diese Ansicht bietet den einfachsten Zugang zur Entnahme des aboralen Organs. Konzentrieren Sie sich auf das aborale Organ.
HINWEIS: Die nützlichste Vergrößerung kann je nach Tiergröße und Benutzerpräferenz variieren. Im Allgemeinen funktioniert eine 12-20-fache Vergrößerung gut. - Halten Sie das Tier vorsichtig mit einer Glasnadel mit der nicht dominanten Hand an Ort und Stelle.
- Führen Sie mit der dominanten Hand die Spitze einer Nadel etwas unterhalb des Aboralorgans ein. Gehe schräg hinein, um einen Schnitt von einer sichtbaren Kante des Aboralorgans bis unter dessen Basis zu machen. Ziehen Sie die Nadel zurück und machen Sie einen zweiten Schnitt, um ein keilförmiges Stück Gewebe zu entfernen, das alle Strukturen des Aboralorgans enthält (siehe Abbildung 4, oberes Bild). Untersuchen Sie das Tier und das herausgeschnittene Gewebe sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Operation erfolgreich war.
- Verwenden Sie dieselbe Transferpipette, um das frisch geschnittene Tier in eine frische Schüssel mit sterilem Meerwasser zu geben.
HINWEIS: Die Wunde schließt sich schnell, so dass je nach experimentellen Zielen (z. B. für mehrere synchron regenerierende Proben oder zur Abbildung früher Stadien der Heilung und Regeneration) schnell gehandelt werden muss, um mehrere Proben zu erzeugen. Verwenden Sie einen Timer, um die Operationszeit zu begrenzen und Kohorten von regenerierenden Tieren näher beieinander zu halten.
4. Überprüfen Sie, ob die Schnitte korrekt sind
HINWEIS: Auch bei sorgfältiger Kontrolle unter dem Präpariermikroskop kann es gelegentlich vorkommen, dass chirurgische Fehler übersehen werden.
- Befolgen Sie die folgenden Montageschritte, um jede postoperative Person vorübergehend auf einem Objektträger zu befestigen und unter einem Compoundmikroskop mit DIC zu überprüfen, ob alle beabsichtigten Strukturen korrekt entfernt wurden. Führen Sie diese Prüfung auch dann durch, wenn zu diesem Zeitpunkt keine weitere Bildgebung durchgeführt wird.
HINWEIS: Die hervorragenden Heilungsfähigkeiten von Ctenophoren eignen sich gut für Transplantationsexperimente; Wir entfernen immer die herausgeschnittenen aboralen Organe aus dem Kulturgefäß, um zu verhindern, dass die Schnittwunden eines entfernten AO und der Rest des Tieres, von dem es entnommen wurde, zusammenkleben und verschmelzen.
Wenn Sie nicht direkt mit der Langzeitbildgebung fortfahren, versiegeln Sie den Objektträger nicht. Dies wird die schnelle Genesung und Rückkehr zur Kultur dieses Versuchstieres erleichtern. Es wird empfohlen, die chirurgische Genauigkeit bei hoher Vergrößerung zu überprüfen. Insbesondere kann der Statolith aus der Kuppel geschlagen werden, ohne die Operation abzuschließen.
5. Live-Bildgebung
- Montage
- Behandeln Sie einen Standard-Glasobjektträger mit einem Silanisierungsmittel, wie z. B. einem wasserabweisenden Mittel für die Glasbehandlung, und lassen Sie ihn vollständig trocknen.
- Übertragen Sie ein postoperatives Tier mit einer Transferpipette auf einen vorbereiteten Objektträger. Vergewissern Sie sich, dass das Wasser mit dem Tier darin abperlt.
- Geben Sie eine kleine Menge Modelliermasse (~1,5 mg) auf jede Ecke eines Deckglases, um "Füße" zu bilden, die als Abstandshalter dienen, um das Deckglas vom Tier wegzuheben.
- Legen Sie das Deckglas vorsichtig mit dem Lehm nach unten auf das Tier. Halten Sie jede Ecke des Deckglases fest und rollen Sie das Tier für die Bildgebung in Position. Drücken Sie nach unten, um das Tier leicht zusammenzudrücken, und halten Sie es an Ort und Stelle. Positionieren Sie die Probe so weit wie nötig, um eine zufriedenstellende Ansicht zu erhalten.
- Für eine Bildgebung von mehr als ~30 Minuten tragen Sie eine dünne Schicht Vaseline auf jede Kante des Deckglases auf, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
HINWEIS: M . leidyi , das auf diese Weise montiert wird, kann leicht für weitere Kulturen oder andere Assays gewonnen werden. Die Tiere befreien sich jedoch in der Regel innerhalb von 1-2 Stunden und positionieren sich neu, so dass eine kontinuierliche Zeitrafferaufnahme von mehr als 2 Stunden einen anderen Bildgebungsansatz erfordern würde.
6. Kultivieren
- Bedingungen der Cydippiden-Kultur
- Züchten Sie chirurgisch manipulierte Tiere und Kontrollen in gefiltertem natürlichem oder künstlichem Meerwasser nahe Raumtemperatur. Verwenden Sie einen auf 20-22 °C eingestellten Inkubator, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
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Ergebnisse
M. leidyi im Cydippidalstadium schließt den Wundverschluss in der Regel innerhalb von ~20 Minuten nach der Verletzung ab (Abbildung 4 und Abbildung 5), während die vollständige Regeneration des Organs 1-3 Tage dauern kann. Dieser Zeitpunkt weist eine gewisse biologische Variabilität auf, ist aber fast immer 72 Stunden nach der Operation abgeschlossen (Abbildung 6).
Die chirurgische Entfernung von...
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Diskussion
Ähnliche Experimente könnten an jeder gewünschten Größe von M. leidyi durchgeführt werden; Die Morphogenese des Organs wird gleichzeitig mit dem Einsetzen der Regenerationsfähigkeit abgeschlossen4. Tiere dürfen in der Wildnis gesammelt19 oder im Labor aufgezogen werden20,21. Wenn eine bestimmte Körpergröße gewünscht wird, können die Tiere laichen gelassen und der Nachwuchs ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Jovita Joseph.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m SFCA-Spritzenvorsatzfilter | Thermo/Nalgene | 723-2520 | Steriles Meerwasser erzeugen |
| 35 mm Petrischale aus Polystyrol | Falke/Corning | 351008 | Schnitte durchführen; Zucht von Kleintieren |
| 60 mL Einweg-Luer-Lock-Spritze | BH Zubehör | BH60LL | Steriles Meerwasser erzeugen |
| Kalibrierte Glaspipetten, 100 μ L | Drummond | 2-000-100 | Schnitte durchführen |
| Deckgläser, #1,5, 18 mm quadratisch | VWR | 16004-326 | Halterung für die Bildgebung |
| Ctenophoren | Golf-Exemplare | lebende Tiere | |
| Doppelkavitäten-Glas-Vertiefungsschieber, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | Halterung für die Bildgebung |
| Objektträger für Glasmikroskope | VWR | 16004-398 | Halterung für die Bildgebung |
| Instant-Meersalz aus dem Ozean | Sofortiger Ozean | Nährmedium für Tiere | |
| Mini-Lineal | Ted Pella | 13623 | Messen Sie Kunststoffpipetten |
| Modelliermasse (Plastilin) | Pepy Plastilina | Halterung für die Bildgebung | |
| Petroelum-Gelee | Vaseline | Halterung für die Bildgebung | |
| Kunststoff-Transferpipetten (verschiedene Größen) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | Kleintiere bewegen |
| Rain-X Glasbehandlung | Regen-X | Silanisieren von Objektträgern | |
| Lineal | Westcott | 10564 | Messen Sie Kunststoffpipetten |
| Schere | OXO | geschnittene Kunststoffpipetten |
Referenzen
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