Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Summary

Wir stellen eine Methode für ein Pilzpathogenesemodell vor, das die natürliche Positionierung von Pilzsporen in den Lungenatemwegen für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie beibehält.

Abstract

Pilze infizieren den Menschen, wenn Sporen aus der Umwelt in die Lunge eingeatmet werden. Die Lunge ist ein heterogenes Organ. Die leitenden Atemwege, einschließlich Bronchien und Bronchiolen, verzweigen sich, bis sie im alveolären Luftraum enden, wo der Gasaustausch stattfindet. Infektionen, die von den Bronchiolen oder Lungenbläschen ausgehen, lösen unterschiedliche Wirtsreaktionen und Krankheitsmanifestationen aus. Daher erweitert das genaue Verständnis, wo sich Sporen auf natürliche Weise in der Lunge lokalisieren, insbesondere kurz nach der Infektion, die Möglichkeiten für die Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen. Im Folgenden beschreiben wir eine in-situ-Analyse von Lungen von Mäusen, die mit Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien infiziert waren. Herkömmliche Methoden zur histologischen Konservierung beinhalten das flüssige Aufblasen der Atemwege mit einer Fixierlösung, die die natürliche Position der aspirierten Pilzpartikel verdrängt und die Sporen von den proximalen Bronchiolen in die terminalen Lufträume drückt.

Umgekehrt erhält diese Methode des Aufblasens mit Perfusionsfixierung des Blutgefäßsystems die physiologische Position der Pilzsporen in den Bronchiolen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Ansatz zur Kryokonservierung, Einbettung und Bildgebung von Lungenproben. Wir teilen auch Hochdurchsatz-Rechentechniken über das Open-Source-Programm QuPath, um die räumliche Verteilung von Pilzsporen in der Lunge zu analysieren. Die hier vorgestellte Methode ist einfach und schnell, erfordert nur minimale Ausrüstung und kann leicht für die Verwendung mit vielen Modellen von Pilzinfektionen der Atemwege angepasst werden.

Introduction

Der Mensch kann bis zu Milliarden von Sporen pro Tag von einer Vielzahl von Umweltpilzen einatmen¹. Um unsere Barriereabwehr gegen diese eingeatmeten Sporen zu verstehen, müssen wir die genauen mikroanatomischen Umgebungen verstehen, in denen diese Sporen in den Atemwegen und im Lungenparenchym landen. Die zelluläre Zusammensetzung der Atemwege (d. h. der Epithelzellen) verändert sich entlang der Luftröhre, der Bronchien, der Bronchiolen und der Lungenbläschen erheblich. Jede dieser unterschiedlichen Regionen besteht aus verschiedenen Zelltypen mit diskreten Funktionen, die ein Arsenal an Abwehrmechanismen zur Verhinderung pathologischer Infektionen zur Verfügung stellen.

Die genaue Lokalisation der pulmonalen Pilzsporenablagerung kann zwischen den Atemwegslumen der säulenepithelial ausgekleideten Bronchiolen, der Alveolargänge oder der Alveolen variieren². Die meisten klinisch relevanten Pilzarten produzieren Sporen mit einem Durchmesser zwischen 1 μm und 10 μm³. Die Ablagerung dieser Sporenpartikel in der Lunge hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. Aerodynamik, Dichte, elektrische Ladung und phoretische Kräfte, die den Mechanismus der Sedimentation nach Inhalation beeinflussen können⁴. Im Allgemeinen lagern sich große Partikel (> 6 μm) in den oberen Atemwegen ab, mittelgroße Partikel (2-6 μm) können sich in kleineren Atemwegen ablagern, und kleine Partikel (<2 μm) erreichen die Alveolarregion⁵. Es wurde berichtet, dass Aspergillus-Sporen (2-3 μm) die Alveolarräume erreichen, aber klinische pathologische Berichte deuten auch auf eine signifikante Belastung durch Bronchial- und Bronchiolenerkrankungen^{hin 6}. Aufgrund der zunehmenden Beliebtheit der flexiblen Bronchoskopie werden auch zunehmend endobronchiale Pilzinfektionen von Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida-Spezies, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum und Zygomyceten erkannt⁷. Jüngste Fortschritte in der mikroskopischen Bildgebung von Aspergillus-Infektionen bei Mäusen haben auch gezeigt, dass proximale Lufträume wie Bronchien und Bronchiolen die größte Belastung für die pathologische Pilzproliferation darstellen^{können 8}. Die Erforschung der Wirtsreaktion auf pulmonale Pilzinfektionen hat gezeigt, dass sowohl bronchioläre Epithelzellen als auch alveoläre Epithelzellen eine wichtige Rolle als Immunwächter spielen, so dass die Aufklärung der genauen Orte der Sporenablagerung und der epithelialen Interaktion für zukünftige Arbeiten von entscheidender Bedeutung sein wird ^2,9,10.

Die Untersuchung dieser Pathogenesedynamik der proximalen Atemwege ist schwierig, da Standardtechniken zur Lungenfixierung und -aufbereitung Sporen aus diesen proximalen Positionen in epithelial ausgekleideten Atemwegen verdrängen und in Richtung der distalen terminalen Alveolarregionen schieben können. Üblicherweise wird 10 % Formalin oder 4 % Paraformaldehyd verwendet, um die Lunge aufzublasen und die gesamte Lunge schnell einem Fixiermittel auszusetzen. Bei der Vorbereitung der Lunge für die Kryosektion verabreichen einige Gruppen eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) in die Lunge, um die Leistung der Kryosektion zu verbessern¹¹. Diese Praktiken sind im richtigen Kontext nützlich, haben aber von unserem Labor und anderen Gruppen festgestellt, dass sie Sporen und Partikel von proximalen Orten verdrängen und dadurch die Interpretationen über die sporenexponierten Zelltypen und die anschließende Wirtsreaktion beeinträchtigen¹².

Um die mikroanatomische Lokalisation von inhalierten Pilzsporen genau zu bestimmen, haben wir eine schnelle, ressourcenschonende Methode zur Konservierung der Position von Pilzsporen in den Atemwegen von Mäusen entwickelt. Wir adaptierten eine murine Luftblasmethode zur vaskulären Perfusionsfixation von Thomas et al. (2021), bei der wir den Aufwand an Ausrüstung, Zeit und technischen Fähigkeiten reduzierten, die erforderlich waren, um ein zufriedenstellendes Ergebnis zu erzielen¹³. Anhand der hier beschriebenen Methode haben wir beobachtet, dass Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien (3-5 μm groß) proximal reichern als zuvor gezeigt, nämlich in distalen Bronchiolen und broncho-alveolären Übergängen und nicht in terminalen Alveolen. Diese Informationen können biologische Fragen zu den kritischen Zelltypen, die mit diesen Regionen der Lunge assoziiert sind, und ihrem Einfluss auf die frühen Reaktionen auf eingeatmete Pilzsporen fokussieren.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Rutgers Biomedical Health Sciences genehmigt.

1. Markieren Sie Sporen mit intrazellulärer Fluoreszenz

1. 1 x 10⁶ Sporen in Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE), Cell Tracker Orange oder Cell Tracker Rot (oder einem intrazellulären Farbstoff Ihrer Wahl) bei 5 μM für 30 min bei 30 °C färben, dann mit PBS waschen und die Sporen bei 12.000 x g schleudern . Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.
2. Bereiten Sie das Sporeninokulum in der richtigen Konzentration vor, so dass 25 μl die richtige Sporendosis für eine Maus enthalten.

2. Inokulation der Maus mit Sporen durch Aspirationsinhalation mit Isofluran-Anästhesie

ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum und muss in einer Elektro-Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug verwendet werden.

1. Um das Isofluran-Expositionsglas vorzubereiten, legen Sie eine gefaltete Serviette in ein 1-Liter-Nalgene-Glas mit Schraubverschluss und legen Sie einen Kunststoffnetzkreis als Plattform für die Mäuse über die Serviette. Geben Sie 2 ml Isofluran in die Serviette, schließen Sie das Glas und warten Sie 1-2 Minuten, bis sich das Gas im Behälter ausgeglichen hat.

Abbildung 1: Vorrichtung für die offene Isofluran-Drop-Methode zur Sporeninokulation. Eine gefaltete Serviette wird in den Boden eines 1-Liter-Schraubglases gelegt, und dann wird ein kreisförmiges Plastiknetz eingesetzt, das als Plattform für die Mäuse dient. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bevor Sie die Maus einer Anästhesie aussetzen, bereiten Sie eine Pipette mit 25 μl des Inokulums vor. Platzieren Sie die Maus in den Isofluran-Behälter und kippen Sie den Behälter, um den Verlust des Aufrichtreflexes zu überwachen, wenn die Maus das Bewusstsein verloren hat und auf dem Kopf steht. Dies dauert in der Regel ca. 10 s.
3. Überwachen Sie die Atemfrequenz (RR), bis sie sich auf konstante 50-80 Atemzüge pro Minute (bpm) verlangsamt, etwa 50% der Ruhe-RR. Dies dauert in der Regel weitere 10 s. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Maus aus dem Isofluran-Glas.
   HINWEIS: Hierbei handelt es sich um eine hohe Konzentration von Isofluran, die eine schnelle Einleitung der Anästhesie bewirkt, und die Maus muss sehr genau überwacht werden. Eine tödliche Überdosierung von Isofluran ist ein Risiko, da die Konzentration von Isofluran variabel sein kann und die Dosis-Wirkungs-Kurve zu Isofluran sehr steil ist. Wenn die Atemfrequenz unter 50 Schläge pro Minute sinkt und/oder unregelmäßig ist, entfernen Sie die Maus von Isofluran, lassen Sie sie 3-5 Minuten lang einwirken und versuchen Sie es erneut (maximal zwei wiederholte Versuche).
4. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Positionieren Sie dann die Maus in Rückenlage in einer Hand und lassen Sie die Maus 3-5 regelmäßige Atemzüge mit zunehmender Frequenz (beginnend bei 50-60 Schlägen pro Minute) und Kraft nehmen. Zu Beginn dieser Operation platzieren Sie die Pipettenspitze am hinteren Rand des Oropharynx der Maus und geben Sie das Inokulum während einer Inhalation frei.
   HINWEIS: Diese Keuchen durch den Mund erschüttern den Kopf aufgrund der Rekrutierung von akzessorischen Muskeln für die Atmung nach unten. Wenn die Pipette während dieser Atemzüge eingeführt wird, sollte sich der Mund bei jedem Atemzug öffnen. Wenn sich der Mund nicht öffnet, ist die Maus unzureichend betäubt und wird wahrscheinlich keinen Inhalt aus dem Oropharynx einatmen. Die Pipette sollte die Zunge niederdrücken und sie nach unten und vorne in den Mund drücken, um ein Verschlucken des Inokulums zu verhindern. Wenn sich die Pipette im Mund befindet und die Maus ausreichend betäubt ist, öffnet die Maus mit jedem Atemzug ihren Mund.
5. Fühlen Sie mit der Hand und dem Daumen, die die Maus halten, nach Knistern an den hinteren und vorderen Aspekten des Brustkorbs der Maus, um die Inhalation des Inokulums zu bestätigen.

3. Euthanasie von Mäusen

1. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal einen Cocktail aus 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin 10 Minuten vor dem Opferzeitpunkt.
2. Warten Sie 10 Minuten nach der Injektion, bis die Maus in eine chirurgische Anästhesieebene eintritt, was durch ein mangelndes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bestätigt wird.

4. Durchblutung der Lunge mit PBS und Formalin

1. Besprühen Sie die betäubte Maus mit 70% Ethanol. Schneide mit einer Schere die Haut der Maus zurück und ziehe die Haut auseinander, um das Bauchfell von allen Seiten freizulegen. Ziehen Sie die Haut von der oberen Hälfte der Maus über den Kopf und ziehen Sie die Arme aus der Haut heraus.
2. Schneiden Sie die Peritonealmembran am Brustbein und entlang der unteren Seite des Brustkorbs und legen Sie das Peritoneum frei. Verschieben Sie die Leber nach unten und legen Sie das Zwerchfell frei. Verwende eine Schere, um das Zwerchfell vorsichtig vom Lungenparenchym weg zu punktieren, um ein Loch in der Lunge selbst zu vermeiden.
   HINWEIS: Ein versehentliches Durchstechen der Lunge macht ein anschließendes Aufblasen der Luft unmöglich.
3. Nachdem das Zwerchfell durchstochen wurde, tritt Luft in den Thorax ein und kollabiert die Lunge. Schneide den Brustkorb auf der linken Seite auf, um das Herz freizulegen. Injizieren Sie 5-10 ml PBS mit einer 30-g-Nadel in den rechten Ventrikel mit einer Rate von 1 ml pro 5 s (um eine Beschädigung der Gefäße zu vermeiden) und hellen Sie die Lunge schnell auf.
   VORSICHT: Formalin ist eine gefährliche flüchtige Substanz, die in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug gehandhabt werden sollte.
4. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Nadel und injizieren Sie mit einer neuen Nadel 5 ml 10% neutralgepuffertes Formalin (NBF) mit der gleichen Geschwindigkeit in den rechten Ventrikel.

5. Aufblasen der perfundierten Lunge

1. Entferne die vordere Hälfte des Brustkorbs. Um die Luftröhre freizulegen, schneiden Sie die oberen Rippen und Schlüsselbeine rechts und links des Halses ab. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in der Nähe der Mittellinie schneiden, wo die Luftröhre liegt. Fassen Sie mit einer Pinzette die verbleibenden oberen Rippen und Schlüsselbeine an der Mittellinie des Halses an und ziehen Sie überlegen, bis die Luftröhre freiliegt.
2. Bereiten Sie einen Nahtanden von 10 cm Länge vor, ziehen Sie ihn unter die Luftröhre und binden Sie einen losen Knoten am unteren Ende der freiliegenden Luftröhre. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit Luft und einem 18-G-Katheter vor. Verwende eine 18 G Nadel, um ein Loch in die Luftröhre am oberen Ende des freiliegenden Bereichs zu bohren.
3. Platzieren Sie den Katheter in diesem Loch und achten Sie auf einen relativ festen Sitz, um zu verhindern, dass Luft entweicht. Injizieren Sie die 1 ml Luft langsam über einen Zeitraum von 10 s in die Lunge und achten Sie dabei auf das Aufblasen aller Lungenlappen. Das vollständige Aufblasen führt dazu, dass sich die Lungen leicht um das Herz wickeln und das Volumen füllen, das sie im unpunktierten Zwerchfell einnehmen.
4. Ziehe den Knoten fest um die Luftröhre und entferne den Katheter. Halten Sie die Luftröhre fest und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Lunge von der Maus zu entfernen, und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu punktieren.

6. Immersionsfixierung und Dehydrierung

1. Legen Sie die Lunge auf den oberen Rand eines konischen 50-ml-Röhrchens, das mit 20 mL 10 % NBF gefüllt ist. Halten Sie die Nahtfäden außerhalb des Konischen, schrauben Sie die Kappe fest und drehen Sie den Konus um, so dass die Lunge kopfüber in 20 ml NBF aufgehängt wird. Stellen Sie es 24-48 h lang bei 4 °C auf.
2. Spülen Sie die Lunge mit PBS und legen Sie sie dann für 72-96 h bei 4 °C in eine 30%ige Saccharose-PBS-Lösung, um die Lunge zur Vorbereitung der Kryokonservierung zu dehydrieren. Entfernen Sie die Lunge von der Saccharose, legen Sie die Lunge in ein Kryomold mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) und frieren Sie die Probe bei -80 °C ein.

7. Kryosektion

1. Äquilibrieren Sie die Proben in OCT-Kryoblöcken 1 h lang auf die -20 °C Temperatur des Kryostaten, bevor Sie schneiden. Die Blöcke bei einer Dicke von 20-100 μm schneiden.
   HINWEIS: Das Aufblasen von Luft kann zu einer erhöhten Zerbrechlichkeit der Probe führen, und das Schneiden mit erhöhter Dicke kann einen Gewebebruch während des Schnitts verhindern.
2. Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern und lassen Sie sie 30 Minuten bis 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Objektträger haftet.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger bei -80 °C gehalten werden.

8. Vorbereitung und Blockieren von Objektträgern

1. Legen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in ein PBS-Bad (in eine Schüssel oder ein Coplin-Glas), um die OCT von den Objektträgern zu entfernen.
   HINWEIS: Dickere Abschnitte (40-100 μm) haften möglicherweise nicht so gut an Objektträgern wie dünnere Abschnitte, daher ist es am besten, sie flach und aufrecht in einer Schale aufzubewahren, anstatt sie auf der Seite in ein Coplin-Glas zu legen.
2. Trocknen Sie die Objektträger, nachdem sich OCT vom Gewebe gelöst hat. Verwenden Sie ein Tuch, um überschüssige Tröpfchen vom Umfang des Objektträgers um die Gewebeprobe herum zu trocknen.
3. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Pap-Stift einen Umfang um die Probe und lassen Sie sie 5 Minuten trocknen.
4. Bereiten Sie einen Blockierungspuffer aus tierversuchsfreier Blockierungslösung mit 0,3 % Tween-20 und 1:100 Fc Block in 300 mL pro Objektträger vor.
   HINWEIS: Für intrazelluläre Ziele kann 1 % Tween-20 verwendet werden. Ein Volumen von 300 μl ist in der Regel ausreichend, aber das notwendige Volumen, um das Gewebe vollständig abzudecken, hängt von der Perimetergröße des hydrophoben Markers ab. Ab diesem Zeitpunkt sollte das Gewebe nicht mehr trocknen.
5. Lassen Sie die Blocklösung 1 h bei RT auf den Objektträgern.

9. Immunfärbung

1. Waschen Sie den Objektträger, indem Sie die Flüssigkeit abpipettieren und 300-500 μl PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschgang einmal.
2. Bereiten Sie den primären AlexaFluor-647-konjugierten Anti-Maus-EpCAM-Antikörper (Klon G8.8) für Ratten (Epithelmarker der Atemwege) in tierversuchsfreier Blockerlösung mit 0,33 % Tween-20 (oder 1 % für intrazelluläre Ziele) vor. Fügen Sie 300 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und färben Sie sie über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Antikörper sollten empirisch auf Färbekonzentration, Zeit und Temperatur getestet werden. Dünnschliffe (8-20 μm) werden für 30 min bei 37 °C und dickere Schnitte (20-100 μm) bei 4 °C über Nacht mit Verdünnungen von 1:100 für die meisten Antikörper gefärbt. Bei Verwendung von unkonjugierten Antikörpern waschen Sie sich 2x (wie oben) und legen Sie einen sekundären fluoreszierenden Antikörper für eine empirisch bestimmte Zeit und Temperatur auf. Im Allgemeinen wird die Sekundärantikörperfärbung bei RT für 1 h bei einer Verdünnung von 1:1000 durchgeführt.
3. Entfernen Sie die Antikörperlösung aus der Probe und waschen Sie den Objektträger 5 Minuten lang mit 300 mL PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Trocknen Sie die Objektträger und entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus der Probe und dem umgebenden Glas.
4. Geben Sie einen Tropfen RT Softset-Eindeckmedium (z. B. SlowFade Glas) auf jedes Gewebestück. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, indem Sie die Flasche auf dem Kopf stehen lassen und jeden Tropfen langsam auf das Taschentuch tropfen lassen. Legen Sie ein Deckglas in geeigneter Größe an, das über den Umfang der Probe und des hydrophoben Markers hinausragt.

10. Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Verwenden Sie ein Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop, um ganze Lungenabschnitte unvoreingenommen zu scannen, indem Sie ein Objektiv mit ausreichender Auflösung verwenden, um einzelne Sporen und Wirtszellen aufzulösen (z. B. Zeiss Axioscan 7 mit 20x Ölobjektiv mit NA = 0,8 oder ähnlichem).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung und die PMT-Spannungsverstärkung so eingestellt sind, dass die Signal-Rausch-Verhältnisse des Ziels über dem Hintergrund maximiert werden, die mit einem FMO-Regler (Fluoreszenz minus eins) bestimmt werden.
2. Sammeln Sie ausreichend Bildkacheln, um den gesamten Lungenlappen zu erfassen (z. B. ~200 Kacheln mit einer Größe von 400 μm x 400 μm). Verwenden Sie die Mikroskop-Software (z. B. Zeiss ZEN 3.7 oder ähnlich), um das zusammengeführte Kachelbild für die Weiterverarbeitung zu exportieren.

11. Räumliche Analyse über QuPath

1. Erstellen Sie in QuPath, einer kostenlosen Open-Source-Software¹⁴, eine Projektdatei und fügen Sie die Fluoreszenzbilder zur Datei hinzu.
2. Klassifizieren Sie die EpCAM+-Pixel als Epithel, indem Sie auf die obere Menüoption Klassifizieren und dann auf Pixelklassifizierung > Schwellenwert erstellen klicken. Wählen Sie die Auflösung, den Kanal, das Glättungs-Sigma und den Schwellenwert aus, der den Zielbereich am besten identifiziert. Speichern Sie den Klassifikator unter einem eindeutigen Namen, und wählen Sie Objekte erstellen aus.
3. Wählen Sie im neuen Fenster Objekte erstellen die Option Neuer Objekttyp als Anmerkung aus. Legen Sie für das Lungenepithel die minimale Objektgröße und die minimale Lochgröße auf 100 mm² fest. Hier ist es nicht erforderlich, Objekte teilen auszuwählen. Nachdem Sie OK ausgewählt haben, werden die Anmerkungen erstellt und können mit dem Pinsel im oberen linken Bereich mit dem Auge geändert werden.
4. Um Sporen zu klassifizieren, wiederholen Sie die Schritte von 11.3 bis 11.4 mit dem Kanal, in dem die Sporen gefangen wurden, und legen Sie den neuen Objekttyp Erkennung anstelle von Anmerkung fest. Legen Sie die minimale Objektgröße und die minimale Bohrungsgröße auf 0 mm² fest, und wählen Sie Objekte teilen aus.
5. Um eine räumliche Analyse der Sporen durchzuführen, wählen Sie im oberen Menü die Option Analysieren > Räumliche Analyse > Berechnen der vorzeichenbehafteten Entfernung zu den Anmerkungen 2D. Die Entfernungen zum EpCAM+-Epithel werden für jede detektierte Spore berechnet. Exportieren Sie diese über den oberen Menüpunkt Messen > Messungen exportieren.

Results

Diese Methode erzeugt schließlich Immunfluoreszenzbilder von Mauslungen unter Verwendung physiologischer Luftblase, um die Atemwege ungestört zu lassen. Wichtig ist, dass mehrere Prüfpunkte auf dem Weg bestätigen, dass Komponenten des Protokolls erfolgreich ausgeführt wurden. Während der Inokulation ist es wichtig zu bestätigen, dass das Inokulum aspiriert wurde, indem man nach "Knistern" an der hinteren Brustwand der Maus tastet, die darauf hinweisen, dass die Flüssigkeit in die Atemwege gelangt ist. Wenn kein Knistern zu spüren ist, ist es möglich, dass die Maus das Inokulum verschluckt hat. Die Perfusion der Lungen von Mäusen mit PBS sollte zu einer weißen Fleckigkeit der Lunge führen, gefolgt von einer vollständigen Aufhellung der gesamten Lunge (Abbildung 2A). Kommt es zu einer unvollständigen Aufhellung, erreicht die anschließende Formalinperfusion nicht alle Bereiche des Lungenparenchyms (Abbildung 2B). Wenn Sie die Lunge mit Luft aufblasen, sollten sich die Lungen langsam ausdehnen, bis sie die physiologische Größe erreicht haben. Nach dem Binden der Trachealnaht, um die Luft in der Lunge zu sichern, sollte sich die Lunge nicht in der Größe zusammenziehen. Wenn dies der Fall ist, wurde die Lunge wahrscheinlich während des Eingriffs punktiert.

Hier zeigen wir repräsentative Bilder von Schnitten mit markierten Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Sporen (grün) und EpCAM+ säulenförmigem bronchiolärem Epithel (magenta) sowohl in luft- als auch in formalinflüssigkeitsaufgeblähten Lungen (Abbildung 3A,B). Diese Sporen akkumulieren sich hauptsächlich in den distalen Bronchiolen und in den Alveolarräumen unmittelbar neben diesen distalen Bronchiolen, wahrscheinlich in den Alveolargängen. Die luftaufgeblasene Lunge mit Fixiermittel enthält Sporen, die häufiger in den Bronchiolen vorkommen und sich näher an den Bronchiolen ansammeln (Abbildung 3A), als das flüssige Fixiermittel, wo die Sporen etwas stärker vom Bronchiolarepithel verteilt erscheinen (Abbildung 3B). Durch die räumliche Analyse von QuPath messen wir den Abstand einzelner Sporen zum nächstgelegenen EpCAM+-Bronchiolarepithel, um den Grad der Ausbreitung der Sporen weg von den Bronchiolen in weiter entfernte Alveolarräume anzuzeigen. Wir zeigen, dass die Flüssigkeitsinflation die Sporen weiter von den Bronchiolen entfernt verteilt, verglichen mit der physiologischen Luftinflation (Abbildung 4A,B). Die luftaufblasende Gefäßperfusion bewahrt die natürliche Positionierung dieser Sporen in den distalen Bronchiolen und verhindert die künstliche Ausbreitung dieser Sporen in distalere Alveolarräume durch intratracheale fixierende Instillation.

Abbildung 2: Indikation des Erfolgs der Lungenperfusion. (A) Die erfolgreich perfundierte Lunge ist vollständig weiß. (B) Unvollständig durchblutete Lungen erscheinen rosa oder gesprenkelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Sporenverteilung in luftaufgeblasenen Formalin-perfundierten Lungen im Vergleich zu formalin-aufgeblähten Lungen. Intrazelluläre fluoreszierende Sporen (grün) sind in (A) luftaufgeblähten Lungen in größerer Nähe des EpCAM+ bronchiolären Epithels (magenta) verteilt als in (B) formalin-aufgeblähten Lungen. Die Bilder wurden von Schnitten mit einer Tiefe von 1,2 mm von der hinteren Oberfläche der linken Lappen der Mäuse in jeder Behandlungsgruppe an einem Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen, und die Kacheln wurden mit Hilfe einer Mikroskopiesoftware zusammengefügt. Maßstabsleiste = 800 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich des Sporenabstands (mm) zum Bronchiolarepithel zwischen luft- und formalinaufgeblähten sporenbehandelten Lungen. Lungen von 3 Mäusen pro Behandlungsgruppe wurden entnommen, verarbeitet und 1,5 h lang nach der Inokulation mit 1 x 10⁶ Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien abgebildet. Vier Schnitte pro Maus wurden in einem Abstand von 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm und 2,0 mm von der hinteren Oberfläche des linken Lappens entnommen, gefärbt und an einem Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Alle Sporen aus jeder Gruppe wurden in QuPath nachgewiesen und räumlich analysiert, um den (A) Abstand zum nächsten säulenförmigen EpCAM+-Bronchiolarepithel zu bestimmen, und (B) die Median- und 95%-Konfidenzintervalle werden in Einheiten von Mikrometern angezeigt. Sporen, die in der Luft aufgeblasen werden, n = 11.673. Sporen beim Aufblasen von Flüssigkeiten, n = 9.837. Der Mann-Whitney-t-Test wurde aufgrund mangelnder Normalität durchgeführt und p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Wir haben eine Pipeline für die Sporeninhalation und die Analyse der räumlichen Ablagerung der eingeatmeten Sporen eingerichtet. Diese Pipeline liefert wertvolle Informationen zur Bestimmung der relevanten Stromaregionen der Lunge, die von der Inhalation von Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien betroffen sind. Wir haben beobachtet, dass sich Kokzidioides-Sporen und ähnlich große inerte Partikel (Daten nicht gezeigt) in distalen bronchiolären Regionen und broncho-alveolären Verbindungen ansammeln, anstatt vollständig in den Lumen der alveolären Atemwege verteilt zu sein. Dieses Modell erfordert ein relativ geringes Maß an Ausrüstung und technischem Know-how, um Kryosektionen für die Immunfluoreszenz (oder andere nachgeschaltete Pipelines wie die Immunhistochemie [IHC]) herzustellen, die die physiologische Integrität des Atemwegsinhalts bei gleichzeitiger Beibehaltung der natürlichen Lungenmorphologie erhalten. Ohne Luftaufblasung verzerrt der Kollaps der Alveolen die natürliche Architektur des Lungenparenchyms, das die Bronchiolen umgibt^13,15. Der Verlust des Luftvolumens der Lunge während der histologischen Verarbeitung wurde in einer gemeinsamen offiziellen Forschungsgrundsatzerklärung der American Thoracic Society und der European Respiratory Society bei der Definition von Standards für die quantitative Beurteilung der Lungenstruktur als "ernstes Problem" bezeichnet¹⁶. Darüber hinaus kann die intratracheale Instillation von Fixiermitteln die Art und Lage der molekularen und zellulären Komponenten der proximalen Atemwege wie Muzine, Tenside und Atemwegszilien stören 17,18,19. Das hier beschriebene Verfahren bewahrt sowohl das Luftvolumen der Lunge als auch die molekularen und zellulären Komponenten entlang der Atemwege, die mit eingeatmeten Pilzsporen interagieren, ausreichend auf.

Die Immunfluoreszenzmikroskopie bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der räumlichen Dynamik von Lungenkomponenten und ist gut bewertet^20,21. Es gibt keine Einschränkungen für die Ziele, die über Immunfluoreszenz dieser Schnitte gefärbt werden können, außer dass Antikörper mit Epitopen, die empfindlich auf die Formalinfixierung reagieren, ihre Ziele möglicherweise nicht zufriedenstellend binden. Wenn Sie einen neuen Antikörper verwenden, ist es am besten, eine Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) vorzubereiten, um festzustellen, ob der Antikörper ein Signal über dem Hintergrund erzeugt. Wenn Sie einen Sekundärantikörper verwenden, verwenden Sie eine Behandlungsgruppe ohne den primären Antikörper, um eine Off-Target-Bindung des Sekundärantikörpers zu kontrollieren. Primär konjugierte monoklonale Antikörper sind sehr spezifisch, so dass eine Färbung bei höheren Temperaturen (37 °C) für kürzere Zeit (30 Minuten) üblich ist und im Allgemeinen spezifisch an ihr Ziel bindet. Auf der anderen Seite sind unkonjugierte polyklonale Antikörper empfindlicher für den Nachweis von Antigenen, aber weniger spezifisch, so dass längere Inkubationen (~16 h) bei kälteren Temperaturen (4 °C) das Signal-Rausch-Verhältnis optimieren. Alle Antikörper müssen empirisch optimiert werden.

Das in dieser Studie verwendete räumliche Analysemodell zur Sporenlokalisierung misst den Abstand einzelner Sporen zum nächstgelegenen Bronchiolarepithel. Dies erfordert eine geeignete Identifizierung des bronchiolären Epithels anhand seines hohen EpCAM-Signals und seines morphologisch unterschiedlichen Erscheinungsbildes als säulenförmiges Epithel, das röhrenartige Strukturen auskleidet. EpCAM kann auch in niedrigeren Konzentrationen durch Alveolarepithel exprimiert werden, daher ist es wichtig, das EpCAM-Signal in QuPath zu stimulieren, um die definierten Annotationen auf morphologisch bestätigte bronchioläre Regionen zu beschränken. Da Bronchiolen eine anatomische Mindestgröße haben, können wir die QuPath-Definition dieser Regionen auf die Mindestfläche von 100 mm² beschränken, wie in Schritt 11.3 angegeben. Dadurch werden isolierte Zellen mit hoher EpCAM-Expression oder Artefakte im Alveolarraum, wie z. B. alveoläre Typ-II-Epithelzellen, von den QuPath-Annotationen ausgeschlossen. Diese Schritte ermöglichen es uns, ausschließlich das bronchioläre Epithel als QuPath-Annotationen zu definieren und die Nähe der Sporen zu diesem definierten Bronchiolarepithel zu bestimmen.

Das hier beschriebene Infektionsmodell verwendet eine Isofluran-Anästhesie, um bei Mäusen eine orale Keuchreaktion zur Aspiration der Pilzsporen zu induzieren. Die Isofluran-Open-Drop-Methode wurde als schnelle, ressourcenarme Technik entwickelt, um eine Kurzzeitanästhesie bei Mäusen zu induzieren ^9,22,23. Diese Methode erfordert etwas Übung, um konsistent zu funktionieren. Die Zeit unter Narkose muss lang genug sein, um die Maus ausreichend zu betäuben, um den Racheninhalt abzusaugen. Ist die Maus unzureichend betäubt, kann sie das Inokulum schlucken, anstatt es abzusaugen. Das Zeichen einer ausreichenden Anästhesie ist erreicht, wenn die Maus ein regelmäßiges orales Keuchen von zunehmender Vitalität mit einer Rate von etwa 50-60 Atemzügen/min produziert. Der Kopf der liegenden Maus sollte sich mit jedem Atemzug nach vorne bewegen. Eine unzureichende Anästhesie kann durch ein fehlendes Keuchen oder eine Bewegung der Schnurrhaare, der Zunge oder der Gliedmaßen festgestellt werden. Es empfiehlt sich, die Zunge während der Verabreichung des Inokulums mit der Pipettenspitze niedergedrückt, um ein Verschlucken zu verhindern. Eine Überdosierung von Isofluran kann zum Tod der Maus führen und muss verhindert werden. Eine gute Faustregel, um dies zu verhindern, ist, die Maus nach der gleichen Zeit, die die Maus benötigt, um den Aufrichtreflex zu verlieren, von Isofluran zu entfernen. Wenn die Maus z. B. 10 s braucht, um den Aufrichtreflex zu verlieren, entfernen Sie die Maus nach weiteren 10 s. Da das Isoflurangas im Laufe mehrerer Mäusebehandlungen entweicht, kann sich dieser Zeitrahmen verlängern. In unseren Händen können wir 6-8 Mäuse behandeln, ohne mehr Isofluran hinzuzufügen.

Es gibt einige Einschränkungen für die Komponenten dieses Protokolls. Bei der Inokulation werden Sporen verwendet, die in 25 μl flüssigem PBS-Medium suspendiert sind, was weniger physiologisch ist als eine aerosolisierte Inokulation von Sporen. Es bleibt die Frage, ob die Verwendung von aspirierter Flüssigkeit die Lokalisation von Sporen/Partikeln im Vergleich zu anderen Inokulationsmethoden, wie z. B. der Inhalation von Sporen in der Luft, verändert. Die aerosolisierte Inhalation erfordert jedoch umfangreiche Ressourceninvestitionen und weist andere Einschränkungen auf (begrenzte Inokulumgröße, variable Exposition, Berufsrisiko), die je nach Art der Studie und der Laborumgebung möglicherweise nicht optimal sind. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Kryosektion eine Gewebefragilität auftreten kann, die entweder auf das Vorhandensein von Luft im gesamten Gewebe oder auf die verminderte Wirksamkeit der Gefäßfixation im Vergleich zur intratrachealen Fixation zurückzuführen sein könnte. Diese Fragilität bei der Kryosektion kann überwunden werden, indem dickere Schnitte von 60-100 μm geschnitten und mit konfokaler Mikroskopie zweidimensionale (2D) Ebenen im Gewebe abgebildet werden.

Wir glauben, dass die Einfachheit und Anpassungsfähigkeit dieser Methode es anderen Gruppen ermöglichen wird, mit den von ihnen ausgewählten inhalativen Krankheitserregern und den interessierenden Wirtsreaktionen Nutzen zu finden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 Nadel (305185)	Fisher	305185
1 L  Schraubglas   (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Spritzen 10 mL Luer	Lock Fisher	14-817-175
AnaSed Injektion (sterile Xylazinlösung)	Akorn	59399-110-20
Tierfreier Blocker und Verdünner, RTU	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Katheter mit BD Vialon Katheter Material 18 G x 1,88 Zoll	BD	381547
BD Pharmingen gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block&Trade;)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Farbstoff	Fisher	Scientific NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 Mikron Siebe	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoklonaler Antikörper	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Spritzen zum Einmalgebrauch (1 ml, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glukose-Monohydrat	Azer Scientific	ES17530-500G
Hochvakuumfett	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Lösung 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isofluran USP	Covetrus	29405
Ketaminhydrochlorid	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wischer (4,4'' x 8,4")	VWR	21905-026
Lexer Babyschere	FST	14078-10
Micro-Adson-Pinzette	FST	11018-12
Neutral gepuffertes Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask Gewebekulturflaschen, T75, Filterkappen	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way Einbettformen	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-Source	https://qupath.github.io/
Silk Nahtgarn Stärke 3/0	FST	18020-30
ObjektträgerMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glas Soft-Set Antifaden Eindeckmittel (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Saccharose		Sigma S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophober Barrierestift 2er-Set	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Brille, rechteckig (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
Weißes Kunststoff-Drahtgeflecht	MAPORCH	789862904922
Hefeextrakt	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	Mikroskopie-Software