Extraktion und Identifizierung von Mikrokernen aus humanen Lymphozyten des peripheren Blutes

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Mikrokernen aus menschlichen Lymphozyten mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Es bietet eine experimentelle Grundlage, um die Zusammensetzung und Funktion von Mikrokernen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Ein Mikronukleus (MN) ist eine abnormale Kernstruktur, die sich in Zellen, insbesondere im Knochenmark oder in Blutzellen, bildet, wenn sie äußeren Schäden wie Strahlung aufgrund von ungelösten DNA-Schäden oder mitotischen Fehlern ausgesetzt wird. Einmal gebildet, können MNs aktiv zu verschiedenen krebserregenden Prozessen beitragen, einschließlich entzündlicher Signalwege und chromosomaler genetischer Umlagerungen. MNs enthalten Kern-DNA, Histone, Nukleoproteinfragmente und andere aktive Proteine, die eng mit ihren Funktionen verbunden sind. Die Untersuchung der Bildung und der Bestandteile von MN ist entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle bei der Steuerung krebserregender Prozesse. Die Extraktion und Reinigung von MN sind für das Erreichen dieser Forschungsziele unerlässlich. Die Instabilität der MN-Kernmembran und ihre Anfälligkeit für Brüche machen diese Prozesse jedoch technisch anspruchsvoll. Derzeit gibt es nur wenige Studien, die über den Einsatz der Dichtegradientenzentrifugation für die MN-Trennung berichten. Diese Studie fasst die Prozesse der MN-Trennung und -Reinigung zusammen und vereinfacht sie. Humane periphere Blutlymphozyten, die der Strahlung ausgesetzt waren, wurden isoliert, und MNs wurden mit Saccharosepuffern unterschiedlicher Konzentrationen in einem zweistufigen Prozess getrennt und gereinigt. Die Integrität und Reinheit der MNs wurde verifiziert und bietet Forschern, die die Ursachen und Funktionen von MNs untersuchen, eine klare und praktische Demonstration des experimentellen Verfahrens.

Einleitung

Der Mikronukleus (MN) ist eine subzelluläre Struktur im Zytoplasma, die Kern-DNA, Histone und Nukleoproteinfragmente enthält, die von Membranstrukturen umgeben sind ^1,2. Das MN ist vollständig vom Hauptkern getrennt und erscheint typischerweise in seiner Nähe in einer ovalen oder kreisförmigen Form mit einer Größe von 1/16 bis 1/3 des Durchmessers des Hauptkerns. Die Bildung von MNs ist in erster Linie mit azentrischen Chromosomenfragmenten, chromosomaler Missegregation, dizentrischem Chromosomenbruch, Chromosomeninstabilität und der Aggregation von Doppelminuten (DBs)

Protokoll

Alle Experimente mit humanen peripheren Blutproben wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde vom Ethical Committee of Nuclear Industry 416 Hospital, China (2020 Review [Nr. 48]), genehmigt und von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Zu den Ausschlusskriterien gehörten Personen mit schweren chronischen Krankheiten wie Tumoren, Gicht oder Bluterkrankungen sowie Personen, die in ihrem Beruf radioaktiven oder genotoxischen Substanzen ausgesetzt waren. Für diese Studie wurden 10 ml peripheres Blut von einem gesunden 28-jährigen Mann in ein Blute....

Ergebnisse

Nach der Strahlenexposition wurde humanes peripheres Blut 60 Stunden lang mit RPMI-1640 inkubiert, und dann wurde Cytochalasin B zur Vorbereitung des Mikronukleus (MN) hinzugefügt. Die Lymphozyten wurden mit einer Lymphozytentrennungslösung isoliert, gefolgt von einer Lyse mit einem speziell konfigurierten Zelllysat und einer schonenden Homogenisierung in einem Glashomogenisator. Das Homogenat wurde 1:1 mit 1,8 M Saccharosepuffer gemischt. Ungereinigte Mikrokerne wurden nach der ersten Saccharose-Dichtegradientenzentrifu.......

Diskussion

Bei dieser Methode wurden bestrahlte humane Lymphozyten aus dem peripheren Blut zur Isolierung und Reinigung von Mikrokernen (MNs) verwendet. Viele frühere Studien haben über die detaillierten Schritte für die Zelllyse und die primäre Trennung der MNs^berichtet 4,32,33,34. Die Zelllyselösung enthält typischerweise 0,1 % NP-40, um die Zellmembran zu zerstören, wä.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15  mL konisches Röhrchen	Thermo	339650
4%ige Paraformaldehyd-Lösung	Beyotime	P0099
50  mL konisches Röhrchen	Thermo	339652
Anti-& Gamma;-H2AX Antikörper	Bioss	bsm-52163R
Rinderserumalbumin	Beyotime	ST023
Calciumchlorid	Biosharp	BS249
Cytochalasin B	Macklin	14930-96-2
DAPI Färbelösung	Bioss	S0001
Dithiothreitol ( DTT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	Ethylendiamin Tetraessigsäure
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	Ti2-U
Homogenisator	Ybscience	YB101103-1 (20 mL)
Horizontale Zentrifuge mit kontrollierter Temperatur	Thermo	Sorvall ST1R plus	Bremsdrehzahl ist auf "5" eingestellt
Humane Lymphozytentrennungslösung	Beyotime	C0025
Magnesiumacetat	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	10% ige Lösung
Phosphatpufferlösung (PBS)	HyClone	SH30256.01B
Proteasehemmer	Coolaber	SL1086	Cocktail (100&mal;)
Sekundärer Antikörper	Bioss	Bs-0295G	Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L/FITC
Spermidin	Coolaber	CS10431
Spermin	Coolaber	CS10441
Saccharose	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096