Kultivierungs- und Verarbeitungstechniken dreidimensionaler Organoide zur Erzeugung von myometrialen und Gebärmuttermyomen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine manuell durchgeführte Technik zur Herstellung kollagenhaltiger Hydrogele, die mit 3D-Organoidkulturen von Stammzellen aus myometrialem und Gebärmuttermyomgewebe eingebettet sind.

Abstract

Gebärmuttermyome sind die häufigsten gutartigen, monoklonalen gynäkologischen Tumore in der Gebärmutter einer Frau. Um die häufigen Hindernisse im Zusammenhang mit den Methoden zur Untersuchung dieser Pathologien zu überwinden, wollten wir eine Strategie entwickeln, um dreidimensionale organoide Modelle von Myometrium- und Gebärmuttermyom-Stammzellen unter Verwendung kollagenhaltiger Hydrogele als Einbettungsgerüste zu erstellen. Konkret wurden kollagenhaltige Hydrogele in einer V-unteren 96-Well-Platten mit niedriger Bindung ausgewertet. Diese Methode ermöglichte die Entwicklung von 3D-Organoiden zweier Stammzelltypen aus normalem Myometrium und Gebärmuttermyom-haltigem Myometrium, indem sie in kollagenhaltige Hydrogele eingebettet und Organoide in einem geeigneten Stammzellproliferationsmedium gebildet wurden. Die Organoide differenzierten, vermehrten sich und organisierten sich erfolgreich zu komplexen Strukturen und entwickelten so ein nachhaltiges System. Die Bedeutung dieses Modells liegt im Verständnis der Pathophysiologie und Ätiopathogenese sowie im Testen neuer Medikamente zur Vorbeugung oder Behandlung von Gebärmuttermyomen.

Introduction

Gebärmuttermyome, oder Leiomyome, sind die häufigsten gutartigen Tumore der Gebärmutter¹. Sie betreffen einen erheblichen Teil der Frauen während ihrer reproduktiven Jahre, wobei Studien darauf hindeuten, dass etwa 77 % der Frauen sie irgendwann erleben. Während viele Frauen Myome ohne Symptome haben, erleben beträchtliche 25 % Symptome wie abnormale Gebärmutterblutungen, Beckenschmerzen oder Unfruchtbarkeit². Die Entwicklung und das Wachstum von Myomen werden von verschiedenen Faktoren beeinflusst, darunter Sexualhormone, Wachstumsfaktoren, genetische Veränderungen und andere

Protocol

Das Protokoll wurde vom Ethnics Committee der University of Chicago mit der Genehmigungsnummer IRB#20-1414 genehmigt. Laut der Gewebebank der University of Chicago wurde von allen Probanden informierte Einwilligung eingeholt, von denen das Gewebe entnommen wurde.

1. 3D Kultur des Organoids

1. Kultivieren und pflegen Sie die isolierten und gereinigten Myometrial- und UF-Stammzellen (SC) wie zuvor beschrieben⁹.
2. Entnehmen Sie SCs aus flüssigem Stickstoff und lassen Sie sie auftauen. Ein Flussdiagramm des Kulturprozesses ist in Abbildung 1 dar....

Results

Bereits am ersten Tag nach der Aussaat begannen SCs, sich selbst zu aggregieren und bildeten Organoide, wie dargestellt. Wir haben die optimale Aussaatdichte auf 10.000 SCs bestimmt, die bei Kultivierung in einem definierten Kultursystem konsequent Organoide bilden. Dieses System verwendete kollagenhaltige Hydrogele als ECM-Gerüst für die eingebetteten Stammzellen und das Stammzellproliferationsmedium für 7 Tage in einer ultraniedrigen 96-Well-Platte,

Discussion

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die miniaturisierten Organen ähneln und aus selbstorganisierten Zellen bestehen, die aus Stammzellen oder^Gewebeproben abgeleitet sind. Die gewebebasierten Stammzellorganoide der Patienten haben das Potenzial, die biomedizinische Forschung und klinische Anwendungen zu revolutionieren, da sie aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, UF-Physiologie und Krankheit¹² genau nachzubilden. Hier versucht d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Photon-Konfokal  Mikroskop	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 Sphäroid-Mikroplatten	InSphero	CS-09-004-03	V-Bodenplatten mit niedriger Befestigung
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-Alpha-Aktin-Antikörper gegen glatte Muskulatur	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & Mikro; g/mL
Anti-Kollagen-III-Antikörper	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anti-SOX1-Antikörper	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Bindungsfaktor	Gibco, USA	S-006-100
Blocking buffer	Dako	X0909	5%  Pferdeserum + 0,5%  Triton X-100  in 1X  PBS
Kryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol)	Thermowissenschaftlich, Deutschland	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Litauen	EN0521
Dullbecco' s modifizierte Adler' s medium DMEM und  F12	Gibco, USA	21041-025
Fetales Rinderserum	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (kollagenhaltige Hydrogene)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serumfreie Stammzellproliferierendes Medium )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
OCT-Compound (Optimal Schnitttemperatur-Compound)	Sakura, USA	4583
Olympus BX41 Mikroskop	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoid-Proteaseinhibitor-Lösung	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	Aktivierungslösung (1,1 mM EDTA, 0,067 mM Mercapptoethanol, 5,5 mM L-Cystein HCl)
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (Paraformaldehyd) 4 %	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Open-Source-Software für die Bildanalyse digitaler Pathologie. Wissenschaftliche Berichte  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software zur Bioimaging-Analyse
Zeitraffermikroskop
Gewebekulturkolben	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsin	Gibco, USA	A12859-01	0,25 % Trypsin und 0,1 % EDTA bei HBSS ohne Kalzium oder Magnesium – NBSP;
VECTASHIELD Antifade Montagemedium ergänzt mit DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL