Kultivierungs- und Verarbeitungstechniken dreidimensionaler Organoide zur Erzeugung von myometrialen und Gebärmuttermyomen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine manuell durchgeführte Technik zur Herstellung kollagenhaltiger Hydrogele, die mit 3D-Organoidkulturen von Stammzellen aus myometrialem und Gebärmuttermyomgewebe eingebettet sind.

Abstract

Gebärmuttermyome sind die häufigsten gutartigen, monoklonalen gynäkologischen Tumore in der Gebärmutter einer Frau. Um die häufigen Hindernisse im Zusammenhang mit den Methoden zur Untersuchung dieser Pathologien zu überwinden, wollten wir eine Strategie entwickeln, um dreidimensionale organoide Modelle von Myometrium- und Gebärmuttermyom-Stammzellen unter Verwendung kollagenhaltiger Hydrogele als Einbettungsgerüste zu erstellen. Konkret wurden kollagenhaltige Hydrogele in einer V-unteren 96-Well-Platten mit niedriger Bindung ausgewertet. Diese Methode ermöglichte die Entwicklung von 3D-Organoiden zweier Stammzelltypen aus normalem Myometrium und Gebärmuttermyom-haltigem Myometrium, indem sie in kollagenhaltige Hydrogele eingebettet und Organoide in einem geeigneten Stammzellproliferationsmedium gebildet wurden. Die Organoide differenzierten, vermehrten sich und organisierten sich erfolgreich zu komplexen Strukturen und entwickelten so ein nachhaltiges System. Die Bedeutung dieses Modells liegt im Verständnis der Pathophysiologie und Ätiopathogenese sowie im Testen neuer Medikamente zur Vorbeugung oder Behandlung von Gebärmuttermyomen.

Introduction

Gebärmuttermyome, oder Leiomyome, sind die häufigsten gutartigen Tumore der Gebärmutter¹. Sie betreffen einen erheblichen Teil der Frauen während ihrer reproduktiven Jahre, wobei Studien darauf hindeuten, dass etwa 77 % der Frauen sie irgendwann erleben. Während viele Frauen Myome ohne Symptome haben, erleben beträchtliche 25 % Symptome wie abnormale Gebärmutterblutungen, Beckenschmerzen oder Unfruchtbarkeit². Die Entwicklung und das Wachstum von Myomen werden von verschiedenen Faktoren beeinflusst, darunter Sexualhormone, Wachstumsfaktoren, genetische Veränderungen und andere^{biologische Mechanismen}.

Um die Pathogenese zu untersuchen und die Wirksamkeit von Medikamenten zu testen, wurden In-vitro - und Tiermodelle entwickelt. Zellen in 2D-Kulturen werden gezwungen, auf einer flachen Oberfläche zu wachsen, was ihre Form verzerrt und ihr Verhalten im Vergleich zu ihrem Verhalten in einer 3D-Gewebeumgebung verändert. Der größte Nachteil der 2D-Kultivierung im Vergleich zur 3D-Kultivierung besteht darin, dass sie die natürliche Zellumgebung innerhalb eines Gewebes schlecht repräsentiert und komplexe Zell-Zell- und Cell-Matrix-Interaktionen, die in einem lebenden Organismus auftreten, nicht genau nachahmt, was bei der Untersuchung von Zellverhalten und -reaktion auf Reize⁴ potenziell ungenaue Ergebnisse liefert. Außerdem verlieren UF- und myometriale Zellen in 2D-Kultur⁵ schnell die hormonelle Reaktionsfähigkeit. Insgesamt haben die verschiedenen Tiermodelle relevante Informationen zur UF-Pathophysiologie⁶ geliefert. Im Vergleich zu Tiermodellen bieten 3D-Organoide mehrere Vorteile: Sie vereinfachen Experimente, sind mit Echtzeitbildgebung kompatibel und ermöglichen die Untersuchung menschenspezifischer Entwicklungs- und Krankheitsaspekte, die in Tiermodellen⁷ nicht gut vertreten sind. Andererseits sind Experimente mit anspruchsvolleren Tieren, wie Primaten, ethisch schwer zu rechtfertigen, zusätzlich zu den hohen Kosten⁸. Das 3D-Organoidmodell ist den 2D-Zellkulturen im Allgemeinen überlegen, da es die In-vivo-Gewebearchitektur enger nachahmt, während es kontrollierter, effizienter und kostengünstiger ist als Tiermodelle. Daher ist es unerlässlich, effektivere alternative Modelle zu entwickeln, die das natürliche Zellwachstum und die Komplexität kranken Gewebes genau replizieren.

Wir wollten das Verfahren einrichten, um 3D-Kulturorganoide von myometrischen und Gebärmuttermyomen mit kollagenhaltigen Hydrogelen manuell durchzuführen, um die Hauptvorteile und Einschränkungen hervorzuheben.

Protocol

Das Protokoll wurde vom Ethnics Committee der University of Chicago mit der Genehmigungsnummer IRB#20-1414 genehmigt. Laut der Gewebebank der University of Chicago wurde von allen Probanden informierte Einwilligung eingeholt, von denen das Gewebe entnommen wurde.

1. 3D Kultur des Organoids

1. Kultivieren und pflegen Sie die isolierten und gereinigten Myometrial- und UF-Stammzellen (SC) wie zuvor beschrieben⁹.
2. Entnehmen Sie SCs aus flüssigem Stickstoff und lassen Sie sie auftauen. Ein Flussdiagramm des Kulturprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.
3. Fügen Sie 5 ml des Attachment Factor-Proteins hinzu, um die vorbeschichteten Kolben vorzubereiten. Mindestens 4 Stunden bei 37 °C inkubieren. Dann entsorge das überschüssige Attachment-Factor-Protein.
4. Kultivieren Sie die SCs in den vorbeschichteten 75 cm^2-Kolben mit 10 ml des Mediums, das sowohl Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) als auch F12 mit 12 % fetalem Rinderserum (FBS) umfasst. Inkubieren Sie den Kolben in einem 37 °C Hypoxie-Inkubator mit einer Sauerstoffkonzentration von 2 %, bis sie 90 % Konfluenz erreichen, wie in Abbildung 2A dargestellt.
   HINWEIS: Hypoxie kann eine bedeutende Rolle beim Wachstum von Stammzellen spielen, da sie die Proliferation und das Überleben von Stammzellen fördert.
5. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit einer 25%igen Trypsin-0,1%-EDTA-Lösung im HBSS ohne Kalzium oder Magnesium abgetrennt.
   1. Dazu entferne das Zellkulturmedium. Wasche die Zellen mit 1x PBS. Gib 1 ml Trypsin zu einer 25 cm² großen Zelle und inkubiere 2–3 Minuten.
   2. Sobald sich die Zellen ablösen, gib Medium mit Serum hinzu, um die Trypsinreaktion zu stoppen. Saugen Sie die Zelllösung in ein 15-mL-Rohr und zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 500 x g bei Raumtemperatur.
   3. Entsorge vorsichtig das Supernatant und lasse das Pellet intakt.
6. Anschließend wird das Zellpellet in 1 ml serumfreiem Stammzellproliferationsmedium wieder suspendiert. Stören Sie Klumpen durch sanftes Pipetteren.
7. Führen Sie eine Zellquantifizierung mit einem Hämozytometer durch.
   1. Mischen Sie 100 μL Zellsuspension mit 10 μL 0,4 % Trypan Blue-Lösung.
   2. Wirbel die Mischung kurzzeitig und pipette 10 μL Trypan Blue-cell suspension in die Hämozytometerkammer zwischen der Kammerkerbe und dem Glasdeckmantel ( Abbildung 2B).
   3. Zählen Sie die Zellen in den Feldern 1–4 und verwenden Sie die folgenden Gleichungen, um die Zellanzahl zu berechnen:
      Zellen/mL = (Gesamtzahl gezählter Zellen/Gesamtzahl gezählter Boxen) x Verdünnungsfaktor x 10.000
      Gesamtzellen in der Probe = Zellen/mL x gesamtes Probenvolumen
8. Man mischt etwa 10.000 Zellen mit 2 μL kollagenhaltigen Hydrogelen und 98 μL serumfreien, proliferierenden Stammzellen, was ein Endvolumen von 100 μL^{pro Well5}für eine V-untere 96-Well-Platte ergibt.
9. Pipettieren Sie 100 μL der Zellmischung in jede Mulde einer Platte mit niedriger Befestigung mit V-unteren 96 Bohrungen. Zentrifugiere bei Raumtemperatur für 5 Minuten bei 100 x g.
10. Stellen Sie den Teller für 30 Minuten in einen 37 °C Inkubator mit 5 %_CO2 .
11. Fügen Sie jedem Brunnen ein zusätzliches Volumen von 100 μL serumfreiem Stammzellproliferativmedium ohne kollagenhaltige Hydrogele hinzu, um die Nährstoffe für das Wachstum der Organien bereitzustellen.
12. Kompensieren Sie die Verdunstung des Mediums, indem Sie 10–20 μL serumfreie Stammzellen, die in jedem Bohrloch proliferieren, im Falle einer übermäßigen Verdunstung, was selten auftritt, hinzufügen.
13. Kultivieren Sie die Zellen 7 Tage lang für das vollständige Wachstum der Organoide. Abbildung 2C-H. Wechseln Sie das proliferierende Medium der serumfreien Stammzellen zweimal wöchentlich (aspirieren Sie das alte Medium sanft und fügen dann frisches Medium hinzu), um die Kultivierung von SCs-abgeleiteten Organoiden bis zu 21 Tage verlängern zu können.

2. Gefrorene Sektionierung

1. Sammeln Sie Zellen von der 96-Well-Platte in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr.
2. Für die Kryosektion werden Organoide zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 1x) gewaschen. Fügen Sie den Organoiden 500 μL PBS hinzu, zentrifugieren Sie dann und entsorgen Sie das Supernatant.
3. Fixiere die Organoide mit 500 μL 4%-Paraformaldehyd (PFA) für 60 Minuten bei 4 °C und wasche erneut mit 1x PBS.
4. Die Organoide in 100 μL 2 % Methylenblau neu suspendieren, um sie 20 Minuten lang zu färben. Waschen Sie mit 1x PBS und Cryoprotect über Nacht in 500 μL mit 30 % Saccharose.
5. Am nächsten Tag wird die Saccharoselösung durch Zentrifugation entfernt. Integrieren Sie die Organoide in eine optimale Schneidetemperaturverbindung (OCT) und frieren Sie bei −80 °C schnell ein.
6. Schneiden Sie die in OCT eingebetteten Organoide mit einem Kryostat, die optimale Schnitttiefe beträgt 10 μm, und legen Sie die Schnitte sofort auf die Objektträger, jeweils einen Abschnitt pro Objektträger.
7. Bewahren Sie die Objektträger bei 4 °C auf, bis die Immunfluoreszenzfärbung nach folgender Methode durchgeführt wird.
8. Waschen Sie den Slide dreimal mit 100 μL 1x PBS. Dann 100 μL 0,1 % Triton in PBS (1x) für 15 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen.
9. Blockieren Sie die Organoide mit 5 % BSA in 1x PBS für 60 Minuten und inkubieren Sie über Nacht mit primären Antikörpern für Sox-2 mit Verdünnung (1:500) und α-glattem Muskelaktin (α-SMA) mit einer Endkonzentration von 1 μg/mL.
10. Waschen Sie die Organoide mit 100 μL 1x PBS 3x und inkubieren Sie dann 1 Stunde im Dunkeln mit Alexa Fluor-markierten fluoreszierenden Farbstoff-Sekundärantikörpern (1:1000).
11. Waschen Sie mit 100 μL 1x PBS 2x und montieren Sie dann in Antifade Mounting Medium ergänzt mit DAPI (1 ng/mL).
12. Bilder mit einem Leuchtstoffröhrenmikroskop mit 20-facher Vergrößerung aufnehmen. Siehe Abbildung 3A und analysieren Sie die Bilder mit Software zur Bioimaging-Analyse.

3. Immunfluoreszenzfärbung der ganzmontierten Organoide

1. Nehmen Sie die Organoide aus dem Medium (Schritt 1.11) in ein Mikrozentrifugenrohr und waschen Sie zweimal mit 500 μL 1x PBS.
2. Fixiere die Organoide mit 500 μL 4 % PFA für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Dann entferne ich das PFA und wasche es dreimal mit 500 μL PBS.
3. Permeabilisieren Sie die fixierten Organoide mit 0,5 ml Blockpuffer über Nacht bei 4 °C.
4. Am nächsten Tag den Blockpuffer entfernen, primäre Antikörper (300-500 μL) von Kollagen III (COL3A1) mit Verdünnung (1:500) und AHR mit Verdünnung (1:1000) hinzufügen und die Proben über Nacht bei 4 °C inkubieren.
5. Waschen Sie die Organoide dreimal mit 500 μL 1x PBS und inkubieren Sie dann über Nacht mit sekundären Antikörpern (594 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG) bei 4 °C im Dunkeln.
6. Waschen Sie die Organoide dreimal mit 500 μL 1x PBS und inkubieren Sie dann mit 5 μg/mL 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) in 1x PBS (300-500 μL pro Probe) bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
7. Waschen Sie die Organoide dreimal mit 500 μL 1x PBS und bilden Sie sie mit einem konfokalen Mikroskop ab (Abbildung 3B).

4. Organoide Dissoziation

1. Rekonstituieren Sie 100 mg Papain in filtersterilisierter Aktivierungslösung auf eine Vorratskonzentration von 250 U/mL, inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C für 30 Minuten, um das Enzym zu aktivieren
   HINWEIS: Es kann bei 2 bis 8 °C bis zu 2 Wochen gelagert werden.
2. Bereiten Sie eine Dissoziationslösung (unmittelbar vor der Anwendung) mit 30 U/mL Papain und 125 U/mL DNase I in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) vor.
3. Übertragen Sie die Organoide (Schritt 1.11) auf 24-Well-Platten und fügen Sie 500 μL Dissoziationslösung hinzu.
4. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 30–60 Minuten auf einem auf 90 U/min eingestellten Orbitalshaker.
5. Triturieren Sie intermittierend 5x-6x mit einem 1-mL-Pipettor bei Raumtemperatur, um eine Suspension zu erhalten, die hauptsächlich aus Einzelzellen besteht.
6. Gib die Zellsuspension in ein 15-mL Zentrifugenrohr mit einer Proteaseinhibitorlösung (1 mL 10 mg/mL) und zentrifugiere bei 300 x g für 5 Minuten die Pelletzellen und entsorge das Supernatant.
7. Setzen Sie die Zellen im entsprechenden Puffer wieder auf, und die resultierende Einzelzellensuspension ist in Abbildung 2I dargestellt.

Results

Bereits am ersten Tag nach der Aussaat begannen SCs, sich selbst zu aggregieren und bildeten Organoide, wie dargestellt. Wir haben die optimale Aussaatdichte auf 10.000 SCs bestimmt, die bei Kultivierung in einem definierten Kultursystem konsequent Organoide bilden. Dieses System verwendete kollagenhaltige Hydrogele als ECM-Gerüst für die eingebetteten Stammzellen und das Stammzellproliferationsmedium für 7 Tage in einer ultraniedrigen 96-Well-Platte,

Discussion

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die miniaturisierten Organen ähneln und aus selbstorganisierten Zellen bestehen, die aus Stammzellen oder^Gewebeproben abgeleitet sind. Die gewebebasierten Stammzellorganoide der Patienten haben das Potenzial, die biomedizinische Forschung und klinische Anwendungen zu revolutionieren, da sie aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, UF-Physiologie und Krankheit¹² genau nachzubilden. Hier versucht d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Photon-Konfokal  Mikroskop	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 Sphäroid-Mikroplatten	InSphero	CS-09-004-03	V-Bodenplatten mit niedriger Befestigung
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-Alpha-Aktin-Antikörper gegen glatte Muskulatur	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & Mikro; g/mL
Anti-Kollagen-III-Antikörper	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anti-SOX1-Antikörper	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Bindungsfaktor	Gibco, USA	S-006-100
Blocking buffer	Dako	X0909	5%  Pferdeserum + 0,5%  Triton X-100  in 1X  PBS
Kryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol)	Thermowissenschaftlich, Deutschland	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Litauen	EN0521
Dullbecco' s modifizierte Adler' s medium DMEM und  F12	Gibco, USA	21041-025
Fetales Rinderserum	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (kollagenhaltige Hydrogene)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serumfreie Stammzellproliferierendes Medium )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
OCT-Compound (Optimal Schnitttemperatur-Compound)	Sakura, USA	4583
Olympus BX41 Mikroskop	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoid-Proteaseinhibitor-Lösung	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	Aktivierungslösung (1,1 mM EDTA, 0,067 mM Mercapptoethanol, 5,5 mM L-Cystein HCl)
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (Paraformaldehyd) 4 %	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Open-Source-Software für die Bildanalyse digitaler Pathologie. Wissenschaftliche Berichte  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software zur Bioimaging-Analyse
Zeitraffermikroskop
Gewebekulturkolben	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsin	Gibco, USA	A12859-01	0,25 % Trypsin und 0,1 % EDTA bei HBSS ohne Kalzium oder Magnesium – NBSP;
VECTASHIELD Antifade Montagemedium ergänzt mit DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL