Kochsalzspülung zur Probenahme der nasalen Immunmikroumgebung des Hundes

Hunde entwickeln im Laufe ihres Lebens routinemäßig entzündliche Nasenerkrankungen. Die zugrunde liegende Ursache für akute oder chronische Rhinitis bei Hunden kann von infektiös (viral: z. B. Influenza, Parainfluenza, Herpesviren; bakteriell [z. B. Bordetella, Mykoplasmen], pilzlich [z. B. Aspergillose, Kryptokokkose]; parasitär [z. B. Nasenmilben]) bis neoplastisch (z. B. sinonasale Malignome, am häufigsten Karzinome oder Sarkom-Histotypen) über Fremdmaterial (z. B. Fremdkörper, intranasale Wanderung von verschobenen Zähnen) bis hin zu Parodontitis reichen. sowie bei der idiopathischen entzündlichen Rhinitis^bei Hunden 1,2,3,4,5,6,7.

Neben einer körperlichen Untersuchung werden verschiedene Ansätze verwendet, um den Zustand der Nasenhöhle bei Hunden mit Nasenentzündung zu beurteilen. Bildgebende Verfahren können Röntgenaufnahmen (Zahn, Schädel), Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) umfassen. Ein weiterer Ansatz zur Bildgebung der Nasenhöhle ist die Rhinoskopie. Die Gewebeprobenahme kann die Entnahme von Nasenabstrichen, Bürstenproben oder Gewebebiopsien umfassen, von denen aus eine zytologische und/oder histopathologische Bewertung durchgeführt werden kann, sowie die Einreichung von Proben für Pilz- oder Bakterienkulturen. Diese Proben können auf verschiedene Weise gewonnen werden, von der "blinden" Probenahme bis hin zur bildgesteuerten Probenahme mit Rhinoskopie oder fortschrittlicher Bildgebung und durch die Nasenlöcher, aus dem Nasopharynx oder mit einem chirurgischen Ansatz der Trepanation, Rhinotomie oder Sinusotomie.

Die Nasenspülung, bei der sterile Kochsalzlösung in die Nasenhöhle verabreicht wird, wurde auch zur Probenahme der Nasenhöhle des Hundes zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken eingesetzt. Eine alternative Version der Nasenspültechnik, die bei Nasentumoren eingesetzt wurde, wird als nasale Hydropulsion bezeichnet, die als kräftige Nasenspülung beschrieben wird und große Tumorproben für die diagnostische Bewertung entfernen und eine therapeutische Linderung zur Verbesserung der klinischen Symptome im Zusammenhang mit Nasenkrebs bieten kann⁸.

Wir stellen hier eine andere Version der Nasenspültechnik vor, die für den beabsichtigten Zweck der Sammlung und Analyse von Zellen und Proteinen der nasalen Immunmikroumgebung verwendet wird. Durch einen schonenden, relativ nicht-invasiven Ansatz haben wir diese Nasenspültechnik für die serielle Probenahme von nasalen Immunmikroumgebungen optimiert. In Studien mit Hunden mit unentzündeten Nasenhöhlen, aktiver Herpesvirusinfektion und sinonasalen Tumoren haben wir den Nutzen der Nasenspülung für die Entnahme und Verarbeitung von Proben für nachgelagerte Anwendungen nachgewiesen ^9,10.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Technik der salzhaltigen Nasenspülung für die serielle Probenahme der nasalen Immunmikroumgebung des Hundes. Wir stellen Protokolldetails zur Verfügung, um die Nasenspülprobe effektiv und mit minimaler Störung des Gewebes zu entnehmen und die Proben dann für eine Vielzahl von Analysen zu verarbeiten.

Dieses Nasenspülverfahren wurde vom Colorado State University Institutional Animal Care and Use Committee und Clinical Review Board (IACUC #2425) zugelassen. Ein Schema der Nasenspülungsmethode ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung auf die Nasenspülung

1. Füllen Sie am Tag vor der Nasenspülung fünf 20-ml-Spritzen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9%ige Natriumchloridlösung) und verschließen Sie sie mit einer Kappe. Legen Sie die Spritzen in einen auf 37 ^°C eingestellten Inkubator, damit sie über Nacht erwärmen können.

2. Positionierung des Hundes für die Nasenspülung

1. Betäuben Sie den Hund für den Eingriff (z. B. mit intravenöser (IV) Injektion von Dexmedetomidin (1-4 μg/kg) und Butorphanol (0,2-0,5 mg/kg) über einen IV-Katheter), gefolgt von der Verabreichung von Propofol IV (2-5 mg/kg), titriert für die Intubation; Halten Sie die Anästhesie mit 1-2% Inhalationsmittel Isofluran aufrecht, um zu wirken.) Bestätigen Sie die geeignete Anästhesietiefe, indem Sie das Ansprechen des Lids und den Kiefertonus überprüfen.
2. Schmieren Sie die Augen, um ein Austrocknen während des Eingriffs zu verhindern.
3. Überwachen Sie die kardiologischen Telemetrie-, Blutdruck-, Kapnographie- und Pulsoximetriewerte während des gesamten Eingriffs.
4. Positionieren Sie den narkotisierten Hund in sternaler Liege. Platzieren Sie den Kopf des Hundes so, dass er natürlich und bequem in einem Abwärtswinkel von der Kante des Behandlungstisches abgewinkelt ist, um eine optimale Probenentnahme für die Nasenspülung zu gewährleisten.
5. Blasen Sie die Manschette des Endotrachealtubus auf, um eine dichte Abdichtung der Atemwege zu gewährleisten.

3. Durchführung der Nasenspülung

1. Schneiden Sie einen sterilen, roten Gummikatheter mit 8 FR an der Basis so ab, dass er genau auf eine der vorgefüllten 20-ml-Spritzen mit der warmen Kochsalzlösung passt. Messen Sie einen sterilen roten Gummikatheter so, dass die distale Spitze des Katheters beim Einführen durch das Nasenloch etwa bis zur Mitte der Nasenhöhle reicht. Wenn Sie einen Nasentumor entnehmen, verwenden Sie eine bildgebende oder nasenmikroskopische Anleitung, um die Lage des rostralen Aspekts des Nasentumors zu schätzen, um die Länge des roten Gummikatheters so zu messen, dass sich die Spitze bis zum rostralen Aspekt des Tumors erstreckt.
2. Schneiden Sie dann den Katheter an der Spitze für die definierte intranasale Katheterlänge ab, so dass die Spitze beim Einführen in die Nasenhöhle an der richtigen Stelle landet. Lassen Sie jedoch eine zusätzliche Länge für die Basis des Katheters zu, die über das Nasenloch hinausragt (Katheterlänge vom Befestigungspunkt der Spritze bis zum Nasenlocheingang, ca. 3-5 cm). Bringen Sie eine Markierung mit einem Permanentmarker am unteren Ende des Katheters an, um den Startpunkt anzuzeigen, der dem Nasenlocheingang entspricht. Die vorgegebene Katheterlänge erstreckt sich intranasal, wobei die Katheterspitze an der gewünschten Stelle in der Nasenhöhle positioniert wird.
3. Die Durchführung der Nasenspülung erfordert die Teilnahme von zwei Personen. Eine Person (Person A) ist für die Einführung des Katheters in die Nasenhöhle und die Verabreichung der Spülung verantwortlich, und die andere Person (Person B) für die Entnahme der Probe, wenn sie die Nase verlässt.
4. Lassen Sie Person A sich vor und unter dem Kopf des Hundes positionieren. Lassen Sie Person A mit behandschuhten Händen die Spitze des roten Gummikatheters sanft in den medialen Aspekt der Nasenhöhle führen und schieben Sie ihn vor, bis die Markierung auf dem Katheter mit dem äußeren Aspekt des Nasenlochs übereinstimmt. Stellen Sie während dieses Vorgangs sicher, dass der Katheter mit der Spritze verbunden ist, die die erwärmte sterile Kochsalzlösung enthält. Lassen Sie Person B einen konischen 50-ml-Schlauch unter dem Nasenloch halten, wobei der Katheter an Ort und Stelle ist.
5. Person A verschließt sanft das kontralaterale Nasenloch und beginnt, die Kochsalzlösung mit langsamem, gleichmäßigem Druck oder mit einer gepulsten Infusion in die Nasenhöhle zu infundieren. Da der Kopf des Hundes in einem Winkel nach unten positioniert ist, sammelt Person B die Flüssigkeit, die durch die Schwerkraft aus der Nasenhöhle in den konischen 50-ml-Schlauch abfließt.
6. Wiederholen Sie diese Nasenspültechnik für bis zu insgesamt fünf 20-ml-Kochsalzspülungen und wechseln Sie bei Bedarf die konischen Röhrchen aus, um die gepoolten Proben zu sammeln. Notieren Sie das Gesamtvolumen der gesammelten Nasenspülflüssigkeit im Verhältnis zur Menge der nach Abschluss des Eingriffs infundierten Kochsalzlösung.
7. Verabreichen Sie nach Abschluss der Behandlung, wenn Sie mit Dexmedetomidin betäubt werden, intramuskulär die gleiche Menge Atipamezol wie bei Dexmedetomidin und lassen Sie den Hund sich von der Narkose erholen. Um vorsichtig zu sein, halten Sie den Hund in sternaler Liege mit dem Kopf nach unten, um eine zusätzliche Drainage von Kochsalzresten aus der Nasenspülung zu erleichtern.

4. Aufbereitung der Nasenspülprobe

1. Behandeln und/oder pipettieren Sie die Nasenspülproben in den konischen Röhrchen vorsichtig, um Klumpen von Ablagerungen und Zellen aufzubrechen. Führen Sie die gepoolten Nasenspülproben durch einen 70-μm-Zellsiebfilter, um große Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 5-10 min, um ein Zellpellet zu bilden.
2. Der Überstand wird durch Aspiration mit einer Pipette entnommen und in ein sauberes Röhrchen zur Analyse der gewünschten Proteine gegeben.
3. Resuspendieren Sie Zellpellets in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder bevorzugter Lösung für Zellassays von Interesse.
4. Um rote Blutkörperchen aus den Proben zu entfernen, wird eine Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lyse durchgeführt, um kernhaltige Zellen aus der Nasenspülung zu entnehmen^11,12.

Bei dieser Nasenspülmethode erscheint die entnommene Probe leicht trüb, möglicherweise mit sichtbaren Stücken von Zelltrümmern und Schleim, wenn der Schlauch verwirbelt wird. Eine Probe gilt als mit peripherem Blut kontaminiert, wenn das Spülverfahren versehentlich Blutungen hervorruft und die Probe rot gefärbt ist. Während ein Teil der infundierten Kochsalzlösung während des Eingriffs verloren geht, wird eine negative Spülung in Betracht gezogen, wenn die infundierte Kochsalzlösung nicht aus dem Nasenloch in den Schlauch zurückfließt. Mögliche Ursachen können sein, dass der Kopf nicht ausreichend nach unten geneigt ist, um einen effektiven Rückfluss zu ermöglichen, dass die Probe kaudal oder lateral durch das kontralaterale Nasenloch abfließt oder dass der rote Gummikatheter nicht fest an der Spritze befestigt ist und die Kochsalzlösung von der Verbindungsstelle nach außen ausgetreten ist.

Wenn Nasenspülproben von Hunden mit Nasenkrebs erfolgreich entnommen wurden, wird mit einer Keimzahl von 1 × 106 × 10600 10 6 gerechnet, wobei 75 bis 96 % lebende Zellen vorliegen. Wenn Nasenspülproben von Hunden mit ansonsten gesunden, nicht entzündeten Nasenhöhlen entnommen wurden, lagen die Zellzahlen im Bereich von 7 × 105-2 × 106, mit 6-16 % lebenden Zellen. Ein repräsentatives Bild von zytologischen Proben, die aus Nasenspülproben von tumortragenden Hunden gewonnen wurden, ist in Abbildung 2 dargestellt. Darüber hinaus ist in Abbildung 3 die durchflusszytometrische Auswertung von Zellpopulationen dargestellt, die aus Nasenspülproben gesunder und tumortragender Hunde analysiert wurden. Es wäre zu erwarten, dass Zellzahlen und prozentuale Lebensfähigkeit, die unter diesen Bereichen liegen, darauf hindeuten, dass das Nasenspülverfahren und die Probenentnahme nicht erfolgreich waren. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse der von den Autoren durchgeführten Nasenspültechnik in Bezug auf die Anzahl der durchgeführten Eingriffe, die Anzahl der Hunde, den Zustand der Nasenhöhle (gesund oder tumortragend), die Ausbeute an kernhaltigen Zellzahlen, die Lebensfähigkeit der für das Verfahren erhaltenen Zellen und die Frage, ob die Spülprobe für die nachgelagerte Analyse als Erfolg oder Misserfolg angesehen wurde, zusammen. Für die Zwecke der Experimente, die mit den in Tabelle 1 enthaltenen Nasenspülproben durchgeführt wurden, wurde eine Mindestzellzahlausbeute von 150.000 als erfolgreiche Probenentnahme für die Nasenspülung angesehen.

Bei dieser Nasenspültechnik wird sterile 0,9%ige Kochsalzlösung verwendet, um die Zellen zu sammeln. Alternativ könnte die Hartmann-Lösung (laktierte Ringer-Lösung) in Betracht gezogen werden; Proben, die entweder mit Kochsalzlösung oder Hartmann-Lösung entnommen wurden, müssten jedoch getestet werden, um eine vergleichbare Lebensfähigkeit und Ergebnisse für die interessierenden Zellen zu gewährleisten. Darüber hinaus könnte eine Alternative zur Verwendung eines roten Gummikatheters bei Hunden ohne Tumor darin bestehen, die Nasenspülung mit einem Foley-Katheter durchzuführen. Obwohl sie bei der hier vorgestellten Nasenspültechnik nicht verwendet wird, würde die Verwendung eines Foley-Katheters das Aufblasen des Ballons an der Spitze des Katheters ermöglichen, wodurch die Nasenhöhle verschlossen und ein Flüssigkeitsverlust nach kaudal verhindert wird. Auch wenn die Zugabe von Hyaluronidase zur Nasenspülprobe nicht in der hier vorgestellten Nasenspülungsprobe getestet wurde, könnte sie in Betracht gezogen werden, um den in der Nasenspülprobe gesammelten Schleim aufzubrechen und mehr Zellen für die Analyse freizusetzen. Dies müsste auch optimiert werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse nicht durch die Zugabe von Hyaluronidase zum Verarbeitungsverfahren der Nasenspülung verändert werden.

Veröffentlichte Ergebnisse aus erfolgreichen Nasenspülungen, die an Hunden durchgeführt wurden, die an einer klinischen Studie zu Hundekrebs teilgenommen haben, sind in Abbildung 310 dargestellt. Die in Abbildung 3 dargestellten Ergebnisse stammen aus einer Studie, in der der Einfluss einer elektiven Knotenbestrahlung auf die lokale Immunmikroumgebung von Hunden mit sinonasalen Tumoren untersucht wurde, deren Tumoren entweder allein oder in Kombination mit einer regionalen zervikalen Lymphknotenbestrahlung bestrahlt wurden. Durch serielle Probenahme der Nasenhöhle von Hunden in der klinischen Studie mit Nasenspülung ergab die durchflusszytometrische Analyse der entnommenen Zellen eine signifikante Abnahme der Populationen von Effektor-T-Zellen am letzten Tag der Strahlentherapie, wenn regionale Lymphknoten gleichzeitig mit dem sinonasalen Tumor bestrahlt wurden, im Vergleich zu Hunden, die eine auf den Tumor abzielende Strahlentherapie erhielten und die regionalen Lymphknoten verschont blieben. Dies zeigt, wie nützlich es ist, die Nasenhöhle seriell mit Spülung zu beproben, um Verschiebungen in den Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu untersuchen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Nasenspülungsmethode. Erwärmte, sterile Kochsalzlösung wird mit einem roten Gummikatheter in die Nasenhöhle von anästhesierten Hunden infundiert. Die Nasenspülflüssigkeit wird in einem Schlauch gesammelt, während sie aus der Nase abfließt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zelluläre Zusammensetzung einer Nasenspülprobe, die von einem Hund mit einem Nasentumor entnommen wurde. Repräsentatives Bild von zytologischen Proben, die aus Nasenspülproben gewonnen wurden (500-fache Vergrößerung, modifizierte Wright-Giemsa-Färbung). Neutrophile Zellen (Pfeile) sind die vorherrschenden Zellen, aber auch einige Plattenepithelzellen (Pfeilspitze) und kleine reife Lymphozyten (im quadratischen Kasten hervorgehoben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Durchflusszytometrische Analyse von Nasenspülproben, die von gesunden und tumortragenden Hunden entnommen wurden. Vergleich der Abundanz von lebenden Zellen, Immunzellen und Neutrophilen zwischen gesunden Hunden (blau, n = 3) und tumortragenden Hunden mit sinonasales Karzinom (rot, n = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die aus der Nasenspülung von Hunden entnommen wurden, die an einer klinischen Studie teilnahmen, in der der Einfluss der elektiven Knotenbestrahlung (ENI) auf die lokale Immunmikroumgebung untersucht wurde. Quantifizierung von CD4 (CD5+CD4+) und CD8 (CD5+CD8+) T-Zellen aus Nasenspülproben. Hunde, die gleichzeitig mit einer Tumorbestrahlung (n = 3) mit ENI behandelt wurden, hatten am letzten Tag der Bestrahlung (Tag 3) signifikant reduzierte Effektor-CD4- und CD8-T-Zellen im Vergleich zu Hunden, die mit einer Bestrahlung behandelt wurden, die nur auf den Tumor gerichtet war (n = 3). Diese Abbildung wurde von Darragh et al.10 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der durchgeführten Nasenspülungen und der zellulären Eigenschaften der entnommenen Proben.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.