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Methodenartikel

Mausmodell der epikutan induzierten Immunmodulation

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DOI:

10.3791/67578

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24. Juni 2025

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1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

Zusammenfassung

Die Haut als größtes Organ des menschlichen Körpers, das mit der äußeren Umgebung verbunden ist, spielt entscheidende physiologische Rollen, darunter (1) den Organismus vor Xenobiotika und Mikroorganismen zu schützen, (2) die Thermoregulation zu erleichtern, (3) das Wasser- und Elektrolytgleichgewicht aufrechtzuerhalten, (4) Vitamin D zu synthetisieren und (5) an der Immunität teilzunehmen. Diese Arbeit unterstreicht die zentrale Beteiligung der Haut an immunologischen Mechanismen und zeigt ihre Fähigkeit, durch Unterdrückung oder Potenzierung der Immunantwort immunmoduliert zu werden. Frühere Ergebnisse zeigen, dass bei Mäusen die epikutane Immunisierung (EC) mit einem Antigen, entweder allein oder in Verbindung mit pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs), die Immunantwort unterdrücken bzw. verstärken kann. Konkret wurde beobachtet, dass die EC-Immunisierung mit einem Antigen die Immunantwort in verschiedenen Mausmodellen von Autoimmunerkrankungen oder allergischer Kontaktdermatitis unterdrücken kann. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die EG-Immunisierung mit einem Antigen in Kombination mit PAMPs als wirksame Strategie dienen könnte, um die Immunität gegen Krankheitserreger zu stärken oder T-Helfer-Typ-2-Lymphozyten (Th2)-abhängige Allergien zu lindern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion einer Hautsuppression durch epikutane Applikation eines Antigens in einem Mausmodell der humanen allergischen Kontaktdermatitis (ACD)-Kontaktüberempfindlichkeit (CHS), die durch Th1-Zellen vermittelt wird. Es kann aber auch auf verschiedene Modelle der murinen Störung angewendet werden. Der Artikel stellt die EC-induzierte Immunmodulation als attraktives Mausmodell für die nadelfreie Immuntherapie bei verschiedenen Erkrankungen vor.

Einleitung

In diesem Artikel wird eine Methode zur Induktion von Toleranz (in diesem Text als "Suppression" bezeichnet) in einem Mausmodell der Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) und zur Umkehrung dieser Toleranz (in diesem Text als "Kontraindion" bezeichnet) durch epikutane (EC) Applikation eines Antigens allein oder in Kombination mit Liganden für Pathogen-Erkennungsrezeptoren (PRRs) vorgestellt 1. Im beschriebenen Protokoll (a) werden haptenisierte Maus-Immunglobuline (TNP-Ig) als Antigen zur Unterdrückung der Kontaktüberempfindlichkeit oder (b) Antigen mit pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs), Liganden für Toll-like-Rezeptoren (TLR) und Nukleotid-bindende Oligomerisierungsdomänen-enthaltende Protein (NOD)-ähnliche Rezeptoren (NLRs) verwendet, um die hautinduzierte Suppression umzukehren 2,3,4. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die EC-induzierte Immunmodulation durch antigen-unspezifische T-Suppressorzellen (Ts) und antigenspezifische T-Kontrasuppressorzellen (Tcs) vermittelt wird. Diese Zellen können in einem Mausmodell des adoptiven Zelltransfers untersucht werden, um den Mechanismus der getesteten Reaktionen zu bestimmen. Das derzeitige Protokoll beschreibt zwei Modelle des Zelltransfers, den "adoptiven Transfer IN" und den "adoptiven Transfer OUT". Der adoptive Transfer IN ist nützlich, um die Immunmodulation in der afferenten und efferenten Phase des CHS zu testen. Auf der anderen Seite spiegelt der "adoptive Transfer OUT" den Effekt der Immunmodulation nur in der efferenten Phase des CHS wider.

Der Artikel beschreibt eine Methode der hautinduzierten Suppression über die epikutane Applikation eines Antigens in einem Mausmodell der humanen allergischen Kontaktdermatitis (ACD) - Kontaktüberempfindlichkeit (CHS), vermittelt durch T-Helfer Typ 1 Lymphozyten (Th1)5. Dieser Ansatz wurde jedoch auch auf seine Wirksamkeit bei der Regulierung (Unterdrückung, Toleranz) experimenteller Modelle von T-zytotoxischen Lymphozyten Typ 1 (Tc1)-vermitteltem CHS 6,7, Autoimmunerkrankungen wie kollageninduzierter Arthritis (CIA)8,9 , experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE)10,11 und Colitis ulcerosa12 getestet. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Methode der hautinduzierten Kontraindierung (Reversed Suppression) durch EC-Applikation eines Antigens zusammen mit PRR-Liganden in einem murinen Modell von CHS 13,14,15,16. Die vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die EC-induzierte Antigen-unspezifische Suppression durch die Aufreinigung von TLR2-, TLR3-, TLR4-, TLR9- und NOD2-Liganden rückgängig gemacht werden kann. Die Methode der hautinduzierten Kontraindierung wurde auch in einem Tiermodell der atopischen Dermatitis (AD) eingesetzt, wobei gezeigt wurde, dass die EC-Behandlung mit einem Antigen in Gegenwart von synthetischen einzelsträngigen DNA-Molekülen, die unmethylierte Oligodeoxynukleotide (CpG) - Liganden für TLR9 enthalten, Th2-vermittelte Reaktionen antigenspezifisch unterdrücken kann (verschiebt die Immunantwort in Richtung eines Th1/Th17-Phänotyps)17. Die beschriebene Methode wurde auch bei Pneumokokken-Pneumonien getestet, wobei gezeigt wurde, dass eine EG-Immunisierung mit Pneumokokken-Polysaccharid, das an Rinderserumalbumin (PC-BSA) konjugiert ist, zusammen mit CpG möglicherweise die Immunität gegen Streptococcus pneumoniae erhöhen könnte 18.

Ein zentraler Aspekt der EC-induzierten Immunmodulation ist die Auswahl des Modells und der Art des Antigens. Der Artikel enthält eine Tabelle, in der die verwendeten Antigene, die Dauer der Antigenexposition und die T-Zell-Spezifität der getesteten Modelle aufgeführt sind (siehe Tabelle 1). Das beschriebene Verfahren zur Immunmodulation zielt auf Erkrankungen ab, an denen antigenspezifische T-Lymphozyten beteiligt sind. Die Wirksamkeit dieser Methode wurde durch die Verwendung eines kompatiblen EC-applizierten Antigens überprüft. Die Kompatibilität des Antigens ist entscheidend, um sicherzustellen, dass es effektiv mit den T-Lymphozyten interagiert, die am Krankheitsprozess beteiligt sind. Das Auftragen eines Protein- oder Peptidpflasters auf intakte Haut erleichtert die Antigenpenetration durch die Epidermis19,20. Diese erhöhte Antigenpenetration wird auf eine erhöhte Schweißbildung unter dem Verband zurückgeführt. Veränderungen der epidermalen Permeabilität treten innerhalb von 4-10 Stunden nach der Pflasterapplikation auf, während die EC-induzierte Immunmodulation bis zu zwei Wochen lang wirksam bleiben kann 5,14.

Obwohl die EG-Behandlung weit verbreitet ist, könnte das Vorhandensein vieler Variationen dieser Methode Fragen aufwerfen. Nach derzeitigem Kenntnisstand kann das Ausmaß der epidermalen Schädigung vor der Antigenverabreichung die Art der resultierenden Immunantwort beeinflussen21. Eine oberflächliche epidermale Schädigung löst die Freisetzung von entzündungshemmenden Zytokinen durch Langerhans-Zellen aus, was die Initiierung der Th2-Reaktion begünstigt22. Im Gegensatz dazu fördert eine umfangreichere epidermale Schädigung die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und erleichtert die Antigenabgabe an die dermalen dendritischen Zellen23. Das vorgestellte Protokoll unterstreicht (a) die Anerkennung von Herausforderungen bei der Anwendung dieser Methode bei kleinen und aktiven Tieren, insbesondere Mäusen; (b) Berücksichtigung von Faktoren wie dem Hautzustand nach der Rasur mit dem Rasierer, dem ordnungsgemäßen Kontakt der Substanzen mit der Haut, der Einwirkzeit und den hygienischen Bedingungen der Haut während der EC-Behandlung, die die Wirksamkeit der Behandlung bestimmen können. Es ist wichtig, die Methode der Hautenthaarung, ob physikalisch oder chemisch, vor der Antigenanwendung in Betracht zu ziehen, da verschiedene Hautpräparate den Hautzustand auf unterschiedliche Weise beeinflussen können. Es ist anerkannt, dass all diese Verfahren Immunzellen der Haut aktivieren können, was möglicherweise zu Hautinfektionen führen oder das Fortschreiten der Krankheit beeinflussen kann. Die möglichen Nebenwirkungen auf Hauterkrankungen nach der Enthaarung sollten bei der Auswahl der Enthaarungsmethode in erster Linie berücksichtigt werden. Die Forscher beschrieben eine Methode der T-Zell-vermittelten Immunsuppression, die durch die EC-Anwendung eines Antigens auf rasierter Rückenhaut induziert wird, und zeigten damit ihre Wirkung auf verschiedene Mausmodelle der Immunantwort. Die EC-Anwendung des Antigens induziert zusammen mit PAMPs antigenspezifische T-Kontrasuppressorzellen. Darüber hinaus verursacht das vorgestellte Verfahren der EG-Anwendung, insbesondere bei wiederholter Exposition gegenüber Antigenen oder PAMPs, keine besorgniserregenden Nebenwirkungen.

Das beschriebene Protokoll unterstreicht die Bedeutung verschiedener Faktoren, um mit dieser Methode zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen, insbesondere bei Kleintieren wie Mäusen. Der nicht-invasive Charakter dieses Ansatzes führt in der Regel zu einem geringeren Risiko von Nebenwirkungen (wie Schmerzen, Infektionen oder Narbenbildung) im Vergleich zu intradermalen oder injizierbaren Immunisierungstechniken. Die epikutane Immunisierung ist benutzerfreundlich und kann in nicht-klinischen Umgebungen leicht verabreicht werden, was die Zugänglichkeit und Compliance im Vergleich zu invasiveren Methoden verbessert.

Tabelle 1: EC-induzierte Modulation der Immunantwort in verschiedenen Krankheitsmodellen der Maus. Abkürzungen: ACD = allergische Kontaktdermatitis; AD = atopische Dermatitis; Ag = Antigen; CIA = Kollagen-induzierte Arthritis; CHS = Kontaktüberempfindlichkeit; CFA = vollständiges Freund-Adjuvans; COLL II = Kollagen Typ II; DNFB = 2,4-Dinitrofluorbenzol; DNP-BSA = Dinitrophenyl, konjugiert mit Rinderserumalbumin; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; EC = epikutan; LPS = Lipopolysaccharid; OVA = Ovalbumin; PAMP = pathogen-assoziiertes molekulares Muster; PC-BSA = Pneumokokken-Polysaccharid, das an Rinderserumalbumin konjugiert ist; Th1 = T-Helfer-Typ-1-Lymphozyten; Tc1 = T zytotoxischer Typ-1-Lymphozyt; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol; TNP-Ig = 2,4,6-Trinitrophenyl-konjugierte Maus-Immunglobuline; Ts = T-Suppressorzellen; Tcs = T Kontrasuppressorzellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Protokoll

Alle in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des 1. und 2. Lokalen Ethikkomitees für Tierversuche in Krakau, Polen, genehmigt und durchgeführt. Die Verfahren entsprachen den lokalen Empfehlungen, insbesondere in Bezug auf die Verabreichung von Ketamin/Xylazin oder Isofluran als Anästhetika, das Rasieren der Maushaut mit Rasierklingen, das Auftragen von Substanzen/Haptenen auf die rasierte Haut und beide Ohrseiten sowie die Entnahme peripherer Immunorgane. Die Studie verwendete männliche und weibliche CBA/J (H-2k) Mäuse im Alter von 6-12 Wochen mit einem Körpergewicht von 20-25 g. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Hausmäuse zusammen; Es ist wichtig, die negativen Auswirkungen der Isolation auf ihre Stimmung zu verhindern. Für die statistische Signifikanz verwenden Sie 10-12 Tiere pro Gruppe.

2. Vorbereitung des Operationsbereichs

  1. Reinigen Sie den Operationstisch vor und nach allen Eingriffen mit einer 70%igen Ethanollösung. Wenn die Verwendung von Mäusen sterile Bedingungen erfordert, führen Sie alle Vorgänge in einer Biosicherheitswerkbank durch.

3. Induktion von Suppressorzellen (Ts) für die Th1-vermittelte CHS-Reaktion

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 1A dargestellt.

  1. Am Tag "0" betäuben Sie die Mäuse mit 30% Isofluran in Propylenglykol. Halten Sie die Maus in der linken Hand und legen Sie die dorsale Seite ihres Körpers frei. Mit der rechten Hand die graue Seife mit reichlich Wasser aufschäumen und auf die Haut auftragen.
    1. Mit einer sterilen Rasierklinge eine 2 cm² große Hautpartie sanft rasieren. Vermeiden Sie Verletzungen der Haut. Jegliche Hautläsionen disqualifizieren die Mäuse von weiteren Eingriffen.
      HINWEIS: Die graue Seife ist ein natürliches und hypoallergenes Produkt, das auf einer sanften pflanzlichen Basis hergestellt wird. Es regeneriert effektiv und befeuchtet trockene und empfindliche Haut. Diese Seife enthält keine künstlichen Farbstoffe, synthetischen Duftstoffe oder Inhaltsstoffe tierischen Ursprungs. Zu den Inhaltsstoffen gehören Natriumpalmat, Natriumpalmkernelat, Aqua (Wasser), Glycerin, Taraxacum Officinale (Löwenzahn) Blüten-/Blatt-/Stängelextrakt, Palmsäure, Palmkernsäure, Natriumchlorid, Propylenglykol, Tetranatrium-EDTA und Etidronsäure. Die graue Seife ist für empfindliche und empfindliche Haut konzipiert, die zu Reizungen und Schuppenflechte neigt. Es reinigt effektiv problematische Haut und beugt gleichzeitig übermäßiger Trockenheit und einem Spannungsgefühl vor. Diese Seife lindert auch Irritationen, spendet Feuchtigkeit und fördert eine schnellere Hautregeneration. Wichtig ist, dass es die Schutzbarriere der Haut nicht beeinträchtigt.
  2. Setze die Mäuse in den Käfig. Warten Sie nach der Rasur mindestens sechs Stunden, bevor Sie das Antigen auftragen, damit die Haut trocknen und vom Tier gereinigt werden kann.
  3. Bereiten Sie am Tag "+1" eine 1 mg/ml-Lösung des Antigens 2,4,6-Trinitrophenyl-konjugiertes Maus-Immunglobulin (TNP-Ig) in steriler Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vor. Bereiten Sie das Volumen eines Antigens von 1200 μl für zehn Mäuse vor. Mischen Sie die Lösungen kurz vor Gebrauch in einem 2-ml-Fläschchen. Schützen Sie TNP-Ig vor Licht, indem Sie das Fläschchen mit Aluminiumfolie abdecken.
    HINWEIS: Eine CHS-Kontrollgruppe von Mäusen, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden (DPBS), ist zu verwenden, um unspezifische Entzündungsreaktionen zu beurteilen, die durch die Rasur und das Auftragen des Lösungsmittels auf die rasierte Stelle verursacht werden. Für die Ts-Induktion sollte ein anderer Antigentyp verwendet werden, um ihre Antigenspezifität zu testen. Maus-Immunglobuline (Ig) wurden aus Mausseren hergestellt und mit TNP-Hapten konjugiert (Ergänzungsdatei 1). Ein einzelnes Präparat mit einem Substitutionsgehalt von 40 TNP pro Ig-Molekül (TNP40-Ig) wurde über24,25 verwendet.
  4. Am selben Tag betäuben Sie Mäuse mit 30% Isofluran in Propylenglykol. Tragen Sie das Antigen auf die zuvor rasierte Stelle auf, indem Sie ein 1 cm2 großes Mullpflaster aufbringen, das mit 100 μl des Antigens getränkt ist (hergestellt in Schritt 3.3). Decken Sie diesen mit einem dünnen Kunststoffpflaster (2 cm²) ab und befestigen Sie es mit Gewebeklebeband. Wenden Sie in der CHS-Kontrollgruppe nur DPBS an.
    HINWEIS: Für den Kunststoff-Patch können 30 μm transparente Dokumentenhüllen verwendet werden. Das Gewebeklebeband sollte leicht ablösbar, flexibel sein, sich den Körperformen anpassen und Luft- und Wasserdampfdurchlässigkeit ermöglichen.
  5. Am Tag "+5" betäuben Sie die Mäuse mit 30% Isofluran in Propylenglykol. Schneiden Sie das Pflaster vorsichtig mit einer Sicherheitsschere mit abgerundeten Ecken ab und entfernen Sie dann vorsichtig das Klebeband. Lassen Sie die Mäuse sich frei bewegen und reinigen Sie ihre Haut mindestens 4 Stunden lang. Falls erforderlich, rasieren Sie nachgewachsene Haare an der Applikationsstelle, obwohl dies in der Regel nicht erforderlich ist.
    HINWEIS: Schneiden Sie das Klebeband nur im Bereich der Antigenverabreichung (Mull- und Kunststoffbereich) ab, wo es nur an den Rändern des Verbandes fest haftet. Warten Sie mindestens 4 Stunden, bevor Sie das Antigen auftragen, damit die Haut trocknen und vom Tier gereinigt werden kann.
  6. Wiederholen Sie am Tag "+5" Schritt 3.3 und Schritt 3.4.
  7. Wiederholen Sie am Tag "+8" Schritt 3.5. Dies markiert den Abschluss einer einwöchigen Exposition der Haut gegenüber dem Antigen. Nach Ablauf dieser Zeit testen Sie mit den Mäusen die Unterdrückung der CHS-Reaktion an aktiven Modellen in vivo (Schritt 6) oder euthanasieren sie, um als Spender von T-Zellen im "adoptiven Transfer IN" (Schritt 8) oder im "adoptiven Transfer OUT" (Schritt 9) zu dienen.

4. Induktion von Kontrasuppressor-T-Zellen (Tcs) für die Th1-vermittelte CHS-Reaktion

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 1B dargestellt.

  1. Führen Sie am Tag "0" die Schritte 3.1-3.2 aus.
  2. Bereiten Sie am Tag "+1" eine Mischung aus 100 μg Antigen TNP-Ig und 100 μg LPS (Beispiel PAMP) in 100 μl DPBS vor. Bereiten Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch in einem 2-ml-Fläschchen vor und schützen Sie es vor Licht, indem Sie das Fläschchen in Aluminiumfolie einwickeln, wenn das Antigen lichtempfindlich ist.
    HINWEIS: Zur Beurteilung der Kontraintierung (Umkehrung der hautinduzierten Suppression) muss eine Kontrolle zur Suppression (Ts-Kontrollgruppe) einbezogen werden, bei der Mäuse nur mit dem Antigen TNP-Ig behandelt werden. Darüber hinaus sollten Mäuse, die ausschließlich mit DPBS (CHS-Kontrolle) und LPS allein (PAMP-Kontrolle) behandelt wurden, einbezogen werden, um das Ausmaß der unspezifischen Modulation der Immunantworten zu bestimmen. LPS ist ein Beispiel für ein immunstimulierendes Partikel26. Die spezifischen Eigenschaften eines Immunstimulators hängen vom verwendeten Mausmodell, den Arten von Immunzellen, die an der untersuchten Immunantwort beteiligt sind, und der Pharmakokinetik der untersuchten Substanzen ab.
  3. Am selben Tag betäuben Sie Mäuse mit 30% Isofluran in Propylenglykol. Legen Sie ein 1 cm2 Mullpflaster auf die zuvor rasierte Haut, das mit einer Lösung getränkt ist, die 100 μl der Mischung enthält (hergestellt in Schritt 4.2). Befestigen Sie die Gaze mit einem dünnen Kunststoffpflaster (2 cm²) und befestigen Sie sie mit einem Gewebeheftpflaster. Wenden Sie in den Kontrollgruppen DPBS (CHS-Steuerung) oder LPS (PAMP-Steuerung) oder TNP-Ig allein (Ts-Kontrollgruppe) an.
    HINWEIS: Für den Kunststoff-Patch können 30 μm transparente Dokumentenhüllen verwendet werden. Das Gewebeklebeband sollte leicht ablösbar, flexibel sein, sich den Körperformen anpassen und Luft- und Wasserdampfdurchlässigkeit ermöglichen.
  4. Führen Sie am Tag "+5" Schritt 3.5 aus.
  5. Wiederholen Sie am Tag "+5" die Schritte 4.2 bis 4.3.
  6. Wiederholen Sie am Tag "+8" Schritt 3.5. Eine Woche der Exposition der Haut gegenüber dem mit LPS gemischten Antigen ist beendet. Nach diesem Zeitraum werden Mäuse in aktiven Modellen der CHS-Reaktion - in vivo (Schritt 6) getestet oder eingeschläfert, um als Spender von Tcs-Zellen im "adoptiven Transfer OUT" (Schritt 10) zu dienen.

5. Induktion von T-Effektorzellen (Teff) für die Th1-vermittelte CHS-Reaktion (Sensibilisierungsphase des CHS)

  1. Rasieren Sie am Tag "0" die Brust und den Bauch der Mäuse (2 × 2 cm große Fläche) mit grauer Seife mit Wasser und anschließend mit einer Rasierklinge. Lassen Sie die Haut 6 Stunden ruhen, bevor Sie das Hapten auftragen, um sicherzustellen, dass es keine Reizungen gibt.
  2. Bereiten Sie am selben Tag, kurz vor dem Gebrauch, die Haptenlösung (5%) in einem Glasfläschchen vor und decken Sie sie zum Schutz vor Licht mit Aluminiumfolie ab: 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1:3).
  3. Am selben Tag die Mäuse sensibilisieren, indem Sie 150 μl Hapten auf die zuvor rasierte Stelle auftragen. Das Vehikel allein (Aceton-Ethanol-Gemisch) in die Negativkontrollgruppe auftragen, um die unspezifische Entzündungsreaktion zu beurteilen. Bevor Sie das Tier in den Käfig zurückbringen, warten Sie 30 Sekunden, bis die Haut getrocknet ist.
    ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe; TNCB verursacht bei den meisten Menschen schwere allergische Reaktionen.

6. Aktives Modell: Testung von Ts- oder Tcs-Zellen in Th1-vermitteltem CHS

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Induzieren Sie die Ts- oder Tcs-Zelle, indem Sie Schritt 3 und Schritt 4 befolgen. Dieser Vorgang dauert von Tag "0" bis Tag "+8".
  2. Beginnen Sie am Tag "+8" mit der Induktion von Teff-Zellen, indem Sie Schritt 5 befolgen.
  3. Bewerten Sie vier Tage später die CHS-Antwort, indem Sie die Erhebungsphase (Challenge) durchführen. Kurz gesagt, tragen Sie TNCB auf beide Seiten der Ohren auf. Quantifizieren Sie dann die Dicke der Ohren, indem Sie sie mit einem Mikrometer messen. Eine detaillierte Beschreibung dieses Tests und anderer möglicher Endpunkte wird an anderer Stelle berichtet (Zemelka-Wiacek, M. et al.27).

7. Isolierung von Teff-, Ts- oder Tcs-Zellen aus Spendermäusen

  1. Sterilisieren Sie den Operationstisch vor und nach jedem Eingriff mit einer 70%igen Ethanollösung. Führen Sie alle Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durch, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und sterilisierte Instrumente zu verwenden. Um Ts-, Tcs- und Teff-Zellen am Tag "+8" zu isolieren, verwenden Sie EC-immunisierte Mäuse, die in den Schritten 3, 4 bzw. 5 beschrieben sind.
    HINWEIS: Halten Sie sich an ein Spender-Empfänger-Verhältnis von 1:1.
  2. Betäuben Sie die Spender mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
  3. Desinfizieren Sie den gesamten Bauchbereich der anästhesierten Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie dann die Bauchschicht (3-4 cm) ein, um die Bauchhöhle freizulegen. Isolieren Sie die Hilfs- und Leistenlymphknoten (ALNs) und die Milz (SPL) mit der sterilen Pinzette in Röhrchen, die mit sterilem DPBS gefüllt sind, das mit 1 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Fassen Sie die ALNs aller Spender in einem Fläschchen und die SPLs in einem anderen Fläschchen zusammen und halten Sie die Fläschchen auf Eis. Jede Achselhöhle enthält zwei axilläre Lymphknoten, während sich ein einzelner Leistenlymphknoten in der Hüftregion neben drei Blutgefäßen befindet. SPLs werden auf der linken Körperseite, hinter dem Darm und Magen positioniert.
    HINWEIS: Arbeiten Sie mit sterilen Werkzeugen unter der Biosicherheitswerkbank, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse nach institutionell anerkannten Protokollen eingeschläfert werden.
    1. Zerdrücken Sie das Gewebe zwischen den matten Enden von zwei Objektträgern. Die Zellsuspension wird durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 μm abgeseiht.
  4. Spülen Sie die Zellen mit 30 ml DPBS, ergänzt mit 1 % FBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1-5 ml DPBS.
  5. Zählen Sie die Lebensfähigkeit der Zelle mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Mischen Sie 10 μl Zellsuspension mit 90-990 μl Trypanblau und passen Sie das Volumen basierend auf der Zellzahl an. Beziehen Sie diesen Verdünnungsfaktor in die Rentabilitätsberechnung ein.
  6. Bereiten Sie eine Mischung aus ALNs und SPLs (Verhältnis 1:1) vor. Halten Sie sich an die Anzahl der Zellen: Verwenden Sie 1 bis zu 5 x 107 Ts- oder Tcs-Zellen pro Empfänger in 1 mL DPBS, ergänzt mit 1 % FBS und 7 x 107 Teff-Zellen/Empfänger in 1 mL DPBS. Halten Sie das Spender-Empfänger-Verhältnis für alle Zellpopulationen 1:1 und auch das Spender-DPBS-Verhältnis 1:1. Bewahren Sie die Fläschchen mit den Zellen auf dem Eis auf.
    HINWEIS: Die Durchführung weiterer in vitro Experimente erfordert eine proportionale Erhöhung der Anzahl der Zellspender.
    HINWEIS: Darüber hinaus können isolierte Teff-, Ts- und Tcs-Zellen einer zusätzlichen Reinigung oder Analyse mittels Durchflusszytometrie unterzogen werden, wie z. B. Phänotypisierung oder Beurteilung der Zytokinsekretion. Es ist auch möglich, Zellkulturen zu initiieren, um die Zellproliferationskapazität zu untersuchen oder die Zytokinspiegel in Kulturüberständen zu quantifizieren. Die Durchführung weiterer Experimente erfordert eine proportionale Erhöhung der Anzahl der Zellspender.

8. Adoptiver Transfer IN: Testung von Ts bei Th1-vermitteltem CHS

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 3 dargestellt. Arbeiten Sie steril und verwenden Sie sowohl vor als auch nach jedem Eingriff eine 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie sicher, dass alle Zellvorgänge in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten und sterilisierte Instrumente zu verwenden.

  1. Induzieren und isolieren Sie T-Zellen (Spender), indem Sie Schritt 3 und Schritt 7 befolgen. Spülen Sie die Zellen mit 30 mL DPBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl DPBS pro Empfänger (Donor-Empfänger-Verhältnis 1:1).
  2. Empfänger (naive syngene Mäuse): Betäuben Sie die Empfänger mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
  3. Eine intravenöse (i.v.) Injektion einer vorbereiteten Mischung aus 1-5 x 107 Ts-Zellen (Schritt 8.2) in 200 μl in den anästhesierten Empfänger verabreichen.
  4. Induzieren Sie am selben Tag eine Th1-vermittelte CHS-Reaktion. Kurz gesagt, induzieren Sie die Teff-Zelle (Sensibilisierungsphase), die in den Schritten 5.1-5.3 beschrieben ist. Vier Tage später bewerten Sie die CHS-Antwort, indem Sie die in Schritt 6.3 beschriebene Erhebungsphase (Challenge) durchführen.

9. Adoptionstransfer OUT: Testung von Ts bei Th1-vermitteltem CHS

  1. Induzieren und isolieren Sie T- und Teff-Zellen (Spender), indem Sie die Schritte 3, 5 und 7 befolgen. Bewahren Sie die isolierten Ts und Teff in zwei getrennten Durchstechflaschen auf. Teilen Sie die Teff-Zellen in zwei Fläschchen auf: eines für die "Ts-Testgruppe" und eines für die "CHS-Kontrolle".
    HINWEIS: Arbeiten Sie steril und verwenden Sie sowohl vor als auch nach jedem Eingriff eine 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie sicher, dass alle Zellvorgänge in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten und sterilisierte Instrumente zu verwenden. Schließen Sie eine Kontrollgruppe von Empfängern ein, denen nur Teff-Zellen verabreicht werden ("CHS-Kontrolle"). Für diese Gruppe sollten zusätzliche Spender eingesetzt werden, um das Spender-Empfänger-Verhältnis von 1:1 einzuhalten. Um die Qualität der Ergebnisse zu verbessern, sollten Empfänger, die Kontrollzellen von Spendern erhalten, die mit einer Lösungsmittellösung in der EU behandelt wurden, hinzugefügt werden. Die Entscheidung, eine zusätzliche Gruppe von Empfängern und Spendern hinzuzufügen, muss sorgfältig geplant werden, da dieser Ansatz viele Mäuse erfordert, was nicht dem 3R-Prinzip (Reduce, Refine, Replace) entspricht.
  2. Fügen Sie Ts-Zellen zu Teff-Zellen für die "Ts-Testgruppe" hinzu. Geben Sie ausreichend DPBS zu den Teff-Zellen in der Durchstechflasche "CHS-Kontrolle".
    HINWEIS: Bewahren Sie die Anzahl der 1-5 x 107 T-Zellen und 7 x 107 Teff-Zellen pro Empfänger auf.
  3. Mischen Sie alle Fläschchen vorsichtig. Lassen Sie die Fläschchen 30 Minuten lang im Wasserbad (37 °C) und mischen Sie sie alle 5 Minuten vorsichtig.
  4. Spülen Sie jede Durchstechflasche mit Zellen mit 30 ml DPBS, ergänzt mit 1 % FBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl DPBS/Empfänger.
  5. Jede Zellsuspension wird durch ein Zellsieb mit 70 μm Poren geleitet. Gegebenenfalls das Volumen von 200 μl DPBS/Empfänger anpassen.
  6. Empfänger (naive syngene Mäuse): Betäuben Sie die Empfänger mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
  7. Verabreichen Sie eine intravenöse (i.v.) Injektion von vorbereiteten Zellen.
  8. Induzieren Sie am selben Tag die in Schritt 6.3 beschriebene Erhebungsphase von CHS (Challenge). Schließen Sie "Negativkontrolle" ein, bei der das Verhalten nur CHS-Herausforderungen darstellt.

10. Adoptionstransfer OUT: Testung von Tcs bei Th1-vermitteltem CHS

  1. Induzieren und isolieren Sie Ts-, Tc- und Teff-Zellen (Spender), indem Sie die Schritte 3-5 und Schritt 7 befolgen.
    HINWEIS: Arbeiten Sie steril und verwenden Sie sowohl vor als auch nach jedem Eingriff eine 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie sicher, dass alle Zellvorgänge in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten und sterilisierte Instrumente zu verwenden. Es werden zwei Kontrollgruppen von Empfängern eingeschlossen: eine "CHS-Kontrolle", bei der nur Teff-Zellen verabreicht werden, und eine "Ts-Kontrolle", bei der Teff-Zellen ausschließlich mit Ts-Zellen inkubiert werden. Verwenden Sie für diese Gruppen zusätzliche Spender, um das Spender-Empfänger-Verhältnis von 1:1 einzuhalten.
  2. Bewahren Sie die isolierten Ts- und Tcs-Zellen in getrennten Durchstechflaschen auf. Teilen Sie die Teff-Zellen in drei Fläschchen auf: eines für die "Tcs-Testgruppe", eines für die "Ts-Kontrolle" und eines für die "CHS-Kontrolle".
  3. Erste Inkubation: Für die (a) "Tcs-Testgruppe" werden Tcs-Zellen zu Teff-Zellen hinzugefügt. Für die b) "Ts-Kontrolle" und c) "CHS-Kontrolle" wird eine ausreichende Menge DPBS in die Teff-Zellen gegeben (siehe Tabelle 2).
    HINWEIS: Bewahren Sie die Anzahl von 1-5 x 107 Tcs-Zellen und 7 x 107 Teff-Zellen pro Empfänger auf.
  4. Mischen Sie alle Fläschchen vorsichtig. 30 min im Wasserbad (37 °C) ziehen und alle 5 min vorsichtig mischen.
  5. Spülen Sie jede Durchstechflasche mit Zellen mit 30 ml DPBS, ergänzt mit 1 % FBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DPBS, ergänzt mit 1 % FBS pro Empfänger. Halten Sie ein Zellmischung-DPBS-Verhältnis von 1:1 ein.
  6. Zweite Inkubation: Für die (a) "Tcs-Testgruppe" werden Ts-Zellen zu der Mischung aus vorinkubierten Teff- und Tcs-Zellen hinzugefügt. Für die b) "Ts-Kontrolle" werden Ts-Zellen zu der Mischung aus vorinkubierten Teff-Zellen mit DPBS hinzugefügt. Für die c) "CHS-Kontrolle" wird den vorinkubierten Teff-Zellen ausreichend DPBS zugesetzt.
    HINWEIS: Behalten Sie die Anzahl von 1-5 x 107 Ts-Zellen pro Empfänger bei. Führen Sie Inkubationen in allen Versuchsgruppen (a, b und c) durch, um eine Gleichmäßigkeit des Zellverlusts während der Wasch- und Zentrifugationsverfahren zu gewährleisten.
  7. Mischen Sie alle Fläschchen vorsichtig. 30 min im Wasserbad (37 °C) ziehen und alle 5 min vorsichtig mischen.
  8. Spülen Sie jede Durchstechflasche mit den Zellen mit 30 ml DPBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl DPBS/Empfänger.
  9. Jede Zellsuspension wird durch ein Zellsieb mit 70 μm Poren geleitet. Gegebenenfalls das Volumen von 200 μl DPBS/Empfänger anpassen.
  10. Empfänger (naive syngene Mäuse): Betäuben Sie die Empfänger mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
  11. Verabreichen Sie eine intravenöse (i.v.) Injektion von vorbereiteten Zellen.
  12. Induzieren Sie am selben Tag die in Schritt 6.3 beschriebene Erhebungsphase von CHS (Challenge). Schließen Sie "Negativkontrolle" ein, bei der das Verhalten nur CHS-Herausforderungen darstellt.

Tabelle 2: Zeitplan der Zellinkubationen während des Tcs "Transfer OUT". Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Ergebnisse

In dieser Studie wird untersucht, ob Antigene, die allein oder in Kombination mit PAMP über die Haut appliziert werden, Ts- bzw. Tcs-Zellen induzieren können, die die CHS-Reaktion modulieren. Die Immunisierung von CBA/J-Mäusen über EC mit 100 μg TNP-Ig oder TNP-Ig plus 100 μg LPS induziert Ts- bzw. Tcs-Zellen. Die Mäuse wurden dann mit 5% TNCB sensibilisiert und 4 Tage später mit dem gleichen Hapten herausgefordert. Die Reaktion wurde bewertet, indem die Ohrschwellung v...

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Diskussion

Die Untersuchungen wurden an vielen verschiedenen Tiermodellen durchgeführt und unter Verwendung vieler Mausstämme wie BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 und B10.PL und SJL zeigen, dass die EC-Immunisierung mit einem zugewiesenen Antigen ein vielseitiges und potenziell unbegrenztes Mittel sein kann, um Toleranz zu erzeugen und unerwünschte Immunantworten zu kontrollieren. Das aktuelle Protokoll skizziert zwei Zelltransfermodelle: (1) den "adoptiven Transfer IN", der nützlich ist, um die I...

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Offenlegungen

Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Polnischen Komitees für wissenschaftliche Forschungsstipendien 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 und des Nationalen Wissenschaftszentrums N N401 3554 33 an M.S. unterstützt. Die Diagramme wurden mit der GraphPad Prism Software 10.2.3 gezeichnet und die Abbildungen 1-3 wurden in BioRender erstellt. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Die Autoren danken Dorota Woźniak für die Pflege der Mäusekolonien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
2,4,6-trinitrophenyl-konjugiertes Maus-Immunglobulin (TNP-Ig)Lehrstuhl für Biomedizinische Wissenschaften, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Medizinische Fakultät der Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen
Aceton (ACS-Reagenz, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland179124
AlufolieMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandZ185140   
analytisches Gleichgewicht Sartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, DeutschlandPRACTUM224-1s, 29105177
Rinderserumalbumin (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, DeutschlandA9418
CBA/J (H-2k) Zuchteinheit des Lehrstuhls für Biomedizinische Wissenschaften, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Medizinische Fakultät der Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen
Zellsieb, Porengröße 70 & mu; mBIOLOGIX, China15-1070
Einweg-Pipetten-Kapazität: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco′ s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144
Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen 1,5 mlEppenforf, Deutschland30120086
Eppendorf Safe-Lock-Schläuche, 2,0 mlEppenforf, Deutschland30120094
Ethanol 100 % (absoluter Alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland1.07017
Ethanol 96 %Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland1.59010
Fetales Rinderserum (FBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Glasmikroskop-Objektträger (sandstrahlend einmalmattiert)ThermoScientific, Portsmouth, NH, USA421-004T
Graph Pad-PrismaGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
graue Seife (Bialy Jelen Seifenstück)Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polen163057
HämozytometerVWR, Avantor, USA612-5719
Inkubator Heracell 150iThermo Electron  LED GmbH, Deutschland41071068
Isofluran (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, USA8AGG9623
Ketamin 100 mg/mL, Lösung zur InjektionBiowet Puławy Sp. z o.o., Puławy, PolenKatze.# Nicht verfügbar
Laborzentrifuge (Heraeus Fresco 21)Thermowissenschaftlich, Deutschland75002425
Laborzentrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermowissenschaftlich, DeutschlandB00013899
Lipopolysaccharid (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, DeutschlandL-8274
Maske (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Vereinigte Staaten111-0917
MikrometerMitutoyo, Tokio, Japan193-111
Mikroskop mit ZielenLeica Microsystems CMS GmbH, DeutschlandDM1000, 294011-082007
Propylenglykol Chempur, Piekary figure-materials-1 Polen114489005
RasierklingeVWR, Radnor, Pennsylvania, Vereinigte StaatenPERS94-0462
transparente Dokumentenhüllen 30 & Micro; mSCHEMAT5906961126542
Trypan-BlauMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandT8154
15 mL sterile RöhrenMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandCLS430055 (Corninig)
Röhren 50 mL, sterilMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandCLS430290 (Corning)
Fläschchen, Schraubverschluss, klares Glas (nur Fläschchen) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Deutschland27173
Viscoplast Polovis, Seidenkleber, 5x0,0125 m3M Polen, Nadarzyn, Polen7100231620
Wasserbad AJL Electronic, PolenLW102
Xylazin (Xylapan 20 mg/mL) Lösung zur InjektionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, PolenKatze.# Nicht verfügbar

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