Methodenartikel

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

DOI:

10.3791/67584

⸱

10. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) ist eine fortschrittliche Technik, die eine detaillierte, ortsaufgelöste Analyse von Gewebeproben ermöglicht, indem mehrere Protein-Biomarker in einem einzigen Schnitt sichtbar gemacht werden. Die meisten mIF-Technologien sehen sich jedoch beim Multiplexing mit erheblichen Kompromissen zwischen Sensitivität und Durchsatz konfrontiert, was eine kritische Einschränkung für den robusten Nachweis von Biomarkern mit geringer Abundanz über mehrere Gewebeschnitte hinweg darstellt. Ein neuer Ansatz für mIF verwendet einzigartige DNA-Barcodes, die mit Antikörpern verknüpft sind, die durch einen parallelen Einzelmolekül-Amplifikationsmechanismus amplifiziert werden. Diese Methode erreicht eine Färbequalität, die mit der Immunhistochemie (IHC) in klinischer Qualität vergleichbar ist, und bietet gleichzeitig hohe Multiplexing-Fähigkeiten und eine Hochdurchsatz-Bildgebung des gesamten Objektträgers. Bei diesem Assay wird ein Cocktail von DNA-Barcoded-Antikörpern auf dem Gewebe amplifiziert, gefolgt von aufeinanderfolgenden Wiederholungsrunden von Nachweisschritten, um vier fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide pro Zyklus sichtbar zu machen. Dieses Verfahren ermöglicht somit den Nachweis von acht oder mehr Biomarkern pro Gewebeprobe. Zu den wichtigsten Schritten dieser Methode gehören die automatisierte Gewebepräparation, das Auftragen von Primärantikörpern, die mit DNA-Barcodes konjugiert sind, die Signalverstärkung und iterative Zyklen der Detektion, Bildgebung und Signalentfernung. Auf die Bilderfassung folgt die Bildregistrierung und die Einzelzellanalyse mit einer KI-gestützten Spatial Image Data Science-Plattform. Für diese Studie wurde das Protokoll auf formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Multigewebe-Microarrays (TMAs) angewendet, einschließlich Mandel-, Melanom-, Dickdarm- und Lymphknotenkerne in dreifacher Ausfertigung. Fortschrittliche mIF-Technologien bieten mehr Einblicke in die Tumorreaktion, die Tumormikroumgebung und die Immunlandschaft. Durch die Überwindung der inhärenten Kompromisse zwischen Empfindlichkeit, Multiplexing-Fähigkeiten und Bildgebungsdurchsatz können Forscher nun darauf abzielen, die Heterogenität anspruchsvoller molekularer Signaturen und Biomarker des therapeutischen Ansprechens zu verstehen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hochmultiplexierte Immunfluoreszenz (mIF) ist eine fortschrittliche Technik, die den Bereich der Gewebeanalytik revolutioniert, indem sie die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Protein-Biomarker innerhalb eines einzigen Gewebeabschnitts ermöglicht 1,2. Diese Fähigkeit bietet ein beispielloses Maß an Detailgenauigkeit und räumlicher Auflösung, was oft entscheidend für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zelltypen mit komplexen Morphologien innerhalb der Gewebemikroumgebung über mehrere räumliche Skalen hinweg ist3. Die Technik ist besonders wertvoll in der onkologischen Forschung, wo sie zur Co-Lokalisierung von Tumor-Biomarkern, Protein-Wirkstoffzielen, dem lokalen Immun- und Checkpoint-Status, den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und sogar den subzellulären Kolokalisationsmustern im Zusammenhang mit dem Arzneimittelstoffwechsel im Gewebe verwendet werdenkann 4,5,6.

Trotz ihres Potenzials stehen die meisten mIF-Technologien noch vor großen Herausforderungen, insbesondere wenn es darum geht, Empfindlichkeit und Durchsatz mit Multiplexing-Funktionen in Einklang zu bringen. Diese Einschränkung ist besonders wichtig für den Nachweis klinischer Biomarker, die eine sehr geringe Expression aufweisen können, wie z. B. HER2 und PD-L1 7,8,9. Um zu verstehen, warum das so ist, ist es wichtig, andere Modalitäten von mIF zu verstehen. Diese traditionellen Methoden haben den Weg für ausgefeiltere mIF-Plattformen geebnet, aber sie haben ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen.

Bei der direkten Immunfluoreszenz (DIF) werden Antikörper verwendet, die direkt an Fluorophore oder an ein Oligonukleotid konjugiert sind, das in der Lage ist, Fluorophore zu rekrutieren10. Diese Methode ist einfach zu multiplexen, leidet jedoch unter einer geringeren Empfindlichkeit und Schwierigkeiten bei der Auflösung von Signalen aus dem Gewebehintergrund oder Färbeartefakten.

Bei der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) wird ein Sekundärantikörper verwendet, der an den Primärantikörper bindet. Dies hat das Signal im Vergleich zu primärbasiertem DIF erhöht. In Kombination mit verbesserten Flusszellendesigns kann die sequentielle IIF bis zu 40 Biomarker in einem Assay nachweisen 2,11. Diese leiden jedoch immer noch unter einem relativen Mangel an Sensitivität im Vergleich zu enzymbasierten Strategien zur Signalamplifikation, wie sie in der Immunhistochemie (IHC) zu finden sind.

Enzymkatalyse-basierte Immunfluoreszenz wird am häufigsten bei IHC-Methoden beobachtet, bei denen Meerrettichperoxidase (HRP) für die chromogene (DAB) oder fluoreszierende Farbstoffabscheidung (z. B. Tyramid-Signalamplifikation (TSA)) verwendet wird. Da diese Assays auf demselben katalytischen Enzym basieren, ist ihre Nachweisempfindlichkeit ähnlich, so dass multispektrale TSA-basierte mIF-Assays für klinische Anwendungen geeignet sind 2,12. Der Vorteil der DNA-basierten Signalverstärkung ist der hohe Grad an Multiplexing, der bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hervorragenden Signalverstärkung und Modularität möglich ist. Im Gegensatz dazu sind HRP-basierte Methoden weniger modular und schwer zu optimieren, so dass zusätzliche Panelentwicklungs- und Testzyklen erforderlich sind.

DNA-Barcoded-Antikörper-Immunfluoreszenz
Der hier gezeigte mIF-Assay verwendet eine DNA-Polymerase zur gleichzeitigen Amplifikation von DNA-barcodierten Antikörpern, gefolgt von Zyklen der Reportersondenfärbung und -entfärbung mit vier fluoreszierenden Oligonukleotiden pro Bildgebungsrunde (Abbildung 1).

figure-introduction-1
Abbildung 1: Grafische Darstellung des Multiplex-Immunfluoreszenz-Assay-Protokolls. Barcode-konjugierte Antikörper werden in einem einzigen Schritt hinzugefügt und die Barcodes gleichzeitig amplifiziert. In jedem Zyklus werden Gruppen von vier Fluoreszenzsonden hinzugefügt, so dass vier Marker gleichzeitig sichtbar gemacht werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese einstufige Antikörperzugabe und die einstufige Amplifikation vereinfachen das Assay-Protokoll erheblich. Der Prozess wird durch automatisierte Hochdurchsatz-Färbe- und Scansysteme erleichtert, die reproduzierbare Ergebnisse von Objektträger zu Objektträger und von Charge zu Charge für eine große Anzahl von Proben gewährleisten, die in klinischen Studien verwendet werden13.

Einer der Hauptvorteile dieser Technologie ist ihre Fähigkeit, eine hohe Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten und gleichzeitig ein umfangreiches Multiplexing zu ermöglichen2. Der Workflow stellt auch sicher, dass der Bildgebungsdurchsatz hoch bleibt, wodurch eine der größten Einschränkungen von hochgemultiplexten mIF-Technologien (z. B. > 8 Biomarkern) für klinische Studien behoben wird. Dies ist besonders wichtig in der klinischen Forschung, wo subtile Variationen in den Wirkstoffzielen mit geringer Abundanz (z. B. niedriger HER2) bei Patienten wichtige Einblicke in das therapeutische Ansprechen geben können.

Zusätzlich zu diesen Schlüsselattributen bietet dieser Assay auch die Konfigurierbarkeit des Panels, Hochdurchsatz-Bildgebungsfunktionen für ganze Objektträger und die optische Auflösung, die für die Untersuchung subzellulärer Prozesse und Kompartimente sowie zellulärer Vorsprünge im Zusammenhang mit Makrophagen und dendritischen Zellen erforderlich sind. Die Fähigkeit, komplexe zelluläre Phänotypen über mehrere räumliche Skalen hinweg zu untersuchen, ist ein entscheidender Vorteil der optischen Bildgebung gegenüber bildgebenden Massenzytometrie (IMC)-basierten Methoden2.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für einen 8-plex-mIF-Assay unter Verwendung eines Autostainers und eines Ganzobjektträger-Scanners vorgestellt. Dieser Assay enthält ein Panel mit acht primären Antikörpern: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 und pan-Cytokeratin14. Dieses Panel von Markern wird die Erstellung von Immunprofilen von Tumorgewebe und die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die in der Tumor- oder Stromaumgebung gefunden werden. Bei diesem Protokoll wird ein automatisierter Objektträgerfärbeer für die erste Färbung und Sondenwechselrunden verwendet, und die Färbung und Bildgebung kann innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen werden. Es werden auch Methoden zur Validierung eines mIF-Assays und zur Analyse der resultierenden Bilder gezeigt.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Experimente müssen den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung entsprechen. Alle Gewebeschnitte, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von einem externen Gewebeanbieter bezogen.

1. Vorbereitung der Gewebeprobe

  1. Wählen Sie den FFPE-Gewebeblock aus, der mit dem mIF-Assay gefärbt werden soll. Wenn Sie FFPE-Objektträger verwenden, stellen Sie sicher, dass die Proben zwischen 3 und 5 μm dick sind, auf positiv geladenen Glasobjektträgern montiert sind und frei von Falten oder anderen Rissen sind, die sich negativ auf das Endergebnis auswirken könnten.
    HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, vermeiden Sie das Färben von Gewebeproben, die vor mehr als 2 Monaten geschnitten wurden. Vermeiden Sie außerdem Blöcke, die länger als 10 Jahre gelagert wurden oder optisch trocken erscheinen.
  2. Wenn Sie mit FFPE-Gewebeblöcken arbeiten, verwenden Sie ein Mikrotom, um die erforderliche Anzahl von Gewebeobjektträgern mit einer Dicke von 4 μm zu schneiden, und montieren Sie die Objektträger auf einen positiv geladenen Objektträger. Um die konsistentesten Ergebnisse zu erzielen, montieren Sie alle Objektträger in der gleichen Ausrichtung. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe frei von Falten und Rissen ist.
  3. Wenn die Proben nicht sofort gefärbt werden sollen, lagern Sie sie in einer Objektträgerbox unter Stickstoff bis zu 2 Monate.

2. Registrierung der Zusatzreagenzien und des Primärantikörpers für die Ersteinrichtung

  1. Navigieren Sie in der Autostainer-Software zur Registerkarte Reagenzien-Einrichtung am oberen Bildschirmrand. Klicken Sie auf Hinzufügen , um neue Reagenzien hinzuzufügen.
  2. Für die Färbe- und Austauschassays werden neun Reagenzienbehälter verwendet, die den in Tabelle 1 enthaltenen Informationen entsprechen. Um sie z. B. für das erste Reagenz mit dem Namen Wash Buffer mit dem abgekürzten Namen ISPWsh1 zu verwenden, gehen Sie folgendermaßen vor. Wählen Sie den Typ als Ergänzend aus, und überprüfen Sie, ob sowohl *BWash als auch DI unter Kompatible Bulks aufgeführt sind. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bevorzugt, bevor Sie speichern.
  3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Zusatzreagenzien unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Namen und abgekürzten Bezeichnungen.
    1. Das Reagenz der Amplifikationslösung (ULTAmp1) ist nicht mit Bond Wash kompatibel. Wählen Sie dazu im Reagenzien-Setup-Fenster bitte *BWash aus und klicken Sie auf die Schaltfläche << , um dieses Reagenz aus der Liste der kompatiblen Reagenzien in den Abschnitt "Verfügbares Reagenz" zu verschieben. Wenn Bond Wash nicht als kompatibles Reagenz für das Reagenz der Amplifikationslösung entfernt wird, kann dies zu einer erheblich verringerten Färbeleistung des Assays führen.
  4. Sobald alle Reagenzienbehälter registriert sind, erstellen Sie ein Research Detection Kit, bevor Sie den ersten Lauf starten. Für das Detektionskit wird ein 30-ml-Titrationsbehälter benötigt.
  5. Geben Sie den 30-ml-Titrationsbehälter in das Detektionskit. Um zu verhindern, dass die beiden getrennt werden, kleben Sie den Titrationsbehälter an den Stab.
  6. Scannen Sie den Barcode auf der linken Seite des Erkennungskits. Benennen Sie im folgenden Popup-Fenster das Erkennungskit (z. B. InSituPlex Kit). Legen Sie das Ablaufdatum auf 10 Jahre ab dem Datum der Registrierung fest.
    HINWEIS: Das hier eingestellte Verfallsdatum ist nicht das auf dem Reagenz angegebene Datum, sondern das Verfallsdatum des Reagens im Titrationsbehälter. Wenn Sie das Verfallsdatum weit in der Zukunft festlegen, wird sichergestellt, dass das Kit nicht unnötig abläuft.
  7. Wählen Sie für die erste Reagenzposition des Kits Wash Buffer als Reagenz aus dem Dropdown-Menü aus.
  8. Klicken Sie auf das Barcode-Feld für diese Reagenzposition und scannen Sie den Barcode des getapten 30-ml-Titrationsbehälters, um diesen Behälter als Waschpuffer zu registrieren und den Reagenzbehälter mit dem Detektionsstab zu verknüpfen.
  9. Sobald der Titrationsbehälter mit dem Kit verknüpft ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen , um das Popup-Fenster zu speichern und zu schließen.
  10. Füllen Sie den Titrationsbehälter mit 30 mL 1x Bond Wash und lagern Sie ihn zwischen den Färbeläufen gekühlt bei 4 °C.

Tabelle 1: Zusatzreagenzien für die Einrichtung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Ersteinrichtung des Protokolls

  1. Navigieren Sie nach erfolgreicher Registrierung aller Reagenzienbehälter zur Registerkarte Protokolleinrichtung am oberen Rand des Autostainer-Softwarebildschirms.
  2. Bestätigen Sie, welche Softwareversion derzeit ausgeführt wird, indem Sie auf das Logo oben rechts auf dem Bildschirm klicken. Das daraufhin angezeigte Popup-Fenster zeigt die aktuell installierte Softwareversion unter der Überschrift Softwareinformationen an.
  3. Wenn es sich bei der Software um Version 7.0 oder höher handelt, gibt es eine vorinstallierte Vorlage des Färbeprotokolls. Überprüfen Sie am unteren Rand des Bildschirms, ob die Auswahl Bevorzugter Status auf Alle eingestellt ist. Nennen Sie das Vorlagenprotokoll *ISP Staining Assay. Für frühere Versionen von Software ist das Protokoll in Tabelle 2 zu finden.
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den *ISP Staining Assay und kopieren Sie das Protokoll. Benennen Sie das Protokoll im daraufhin angezeigten Popup-Fenster in Staining Assay 1 mit dem abgekürzten Namen (ISP_IHC1) um
  5. Wählen Sie unter dem bevorzugten Erkennungssystem das System aus, das während der Ersteinrichtung des Reagenzes in Schritt 2.6 erstellt wurde.

Tabelle 2: Protokoll für das Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll. *MARKER entspricht der Antikörperlösung und Wash Buffer entspricht der BOND Wash Lösung. Alle anderen Zusatzreagenzien haben entsprechend benannte Kit-Komponenten. Dieses Protokoll ist kompatibel mit der Softwareversion 7.0 und höher, BXD 39 und höher. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

4. Reagenz einrichten

  1. Tauen Sie alle Kit-Reagenzien mit Ausnahme der Antikörperkonjugate, des Amplifikationsenzyms, des Austauschinitiators und des Austauschneutralisators bei Raumtemperatur auf. Lagern Sie den Rest der Kit-Komponenten bis zur Verwendung bei -20 °C.
  2. Falls noch nicht geschehen, registrieren Sie einen neuen Titrationsbehälter für jedes der in Schritt 2.3 definierten Reagenzien. Setzen Sie jeweils einen neuen Titrationseinsatz ein.
  3. Nehmen Sie das in Schritt 2.6 registrierte Research Detection System und stellen Sie sicher, dass der zugehörige Waschpufferbehälter bis zu 30 mL mit 1x Bond-Waschlösung gefüllt ist. Setzen Sie die Titrationsbehälter für jedes Reagenz in das System ein.
  4. Bereiten Sie das Ab Verdünnungsmittel im entsprechenden Behälter vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (150 μl x Anzahl der Objektträger) und besteht aus dem mitgelieferten Antikörperverdünnungsmittel. Den Puffer nach dem Auftauen vermischen.
  5. Bereiten Sie die Antikörper-Färbelösung in der Antikörper-Färbelösung 1 Behälter vor. Geben Sie alle Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 in das mitgelieferte Antikörperverdünnungsmittel. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (150 μL x Anzahl der Objektträger). Die Antikörperstämme oder die vollständige Antikörperfärbelösung nicht verwirbeln, sondern nur durch Pipettieren mischen.
  6. Bereiten Sie die Voramplifikationsmischung im Behälter für die Voramplifikationsmischung vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (150 μl x Anzahl der Objektträger) und besteht aus der mitgelieferten Voramplifikationsmischung. Wirbeln Sie diese Lösung nach dem Auftauen ein.
  7. Bereiten Sie die Amplifikationslösung im Behälter für die Amplifikationslösung vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (150 μl x Anzahl der Objektträger) und besteht aus einem Amplifikationsenzym, das 1:10 in Amplifikationspuffer verdünnt ist. Das Amplifikationsenzym oder die fertige Amplifikationslösung nicht verwirbeln, sondern nur durch Pipettieren mischen.
  8. Bereiten Sie den nuklearen Gegenfleck in einem nuklearen Gegenfleckenbehälter vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (300 μL x Anzahl der Objektträger) und besteht aus der mitgelieferten nuklearen Gegenflecklösung, die 1:100 in Reinstwasser verdünnt ist. Durch Vortexen mischen.
  9. Bereiten Sie die Mischung der Fluoreszenzsonden entsprechend der ersten Bildgebungsrunde im Fluoreszenzsondenbehälter vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (450 μL x Anzahl der Objektträger), bestehend aus den Fluoreszenzsonden 1 Lösung, die 1:20 innerhalb eines Sondenpuffers verdünnt ist. Die Komponenten nach dem Auftauen sowie die fertige Mischung vortexen.
  10. Sobald alle Reagenzien vorbereitet und in die entsprechenden Behälter gegeben sind, legen Sie den vollständigen Reagenzstab in die Software, damit das Reagenzvolumen gemessen werden kann.

5. Setup ausführen

  1. Sobald alle Reagenzien vorbereitet sind, navigieren Sie zur Registerkarte "Objektträger einrichten" oben in der Software und wählen Sie die Schaltfläche "Neue Studie ". Fügen Sie die Studien-ID, den Studiennamen und die Studienkommentare wie gewünscht hinzu. Abbildung 2 ist ein Beispiel zu sehen.
  2. Wählen Sie unter Dosiervolumen 150 μl und *Entwachsung in 4 Schritten als Vorbereitungsprotokoll aus. Wenn *Dewax 4 steps nicht im Dropdown-Menü angezeigt wird, suchen Sie dieses Protokoll im Menü Protocol Setup und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bevorzugt . Drücken Sie OK.
  3. Nachdem die Studie erstellt wurde, wählen Sie die Schaltfläche Folie hinzufügen auf der rechten Seite des Bildschirms zum Einrichten der Folie aus. Geben Sie unter Folienkommentare einen eindeutigen Namen für die Folie ein.
  4. Legen Sie für die zusätzlichen Felder in diesem Bildschirm den Gewebetyp auf Testgewebe und das Dosiervolumen auf 150 μl fest, wobei der Färbemodus in der linken Dropdown-Liste Single und in der rechten Dropdown-Liste Routine ist. Wählen Sie unter Prozess die Option IHC aus, wobei der Marker Antikörper-Färbelösung ist.
  5. Wählen Sie im Protokollbereich des Fensters Folie hinzufügen die Option Färbeassay 1 für die Färbung, * Entwachsung in 4 Schritten als Vorbereitung und *HIER 20 min mit ER2 als HIER. Das Enzymprotokoll bleibt *----. Sobald dies abgeschlossen ist, klicken Sie auf Folie hinzufügen. Abbildung 2 ist ein Beispiel zu sehen.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf für die Anzahl der Folien, die in der Studie ausgeführt werden sollen, und stellen Sie sicher, dass das Feld "Folienkommentare" für jede hinzugefügte Folie aktualisiert wird, damit sie später eindeutig identifiziert werden kann. Nachdem Sie alle Objektträger hinzugefügt haben, schließen Sie das Fenster "Objektträger hinzufügen", drucken Sie alle Etiketten aus und kleben Sie sie an die entsprechenden Gewebeabschnitte.
  7. Legen Sie jede Folie auf das Fach und legen Sie die Abdeckkacheln auf jeden Abschnitt, bevor Sie das Fach in die Software einlegen. Nachdem Sie Reagenzien und Objektträger hinzugefügt haben, wählen Sie den entsprechenden Autostainer auf der rechten Seite der Software aus. Sobald diese Option ausgewählt ist, sind alle drei Objektträgerschalen und Informationen für alle Reagenzien in der Software sichtbar, einschließlich der Massenreagenzien und derjenigen, die während der Reagenzienvorbereitung hinzugefügt wurden.
  8. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzbehälter gefüllt sind und die Abfallbehälter noch über genügend Volumen verfügen, um den Lauf abzuschließen, und drücken Sie dann die Wiedergabetaste , um den Lauf zu starten.
  9. Der gesamte Durchlauf dauert ungefähr 5 Std. und 15 Min. Notieren Sie sich die Stoppzeit und stellen Sie sicher, dass die Objektträger sofort nach Abschluss des Protokolls aus dem Autostainer entfernt werden.

figure-protocol-1
Abbildung 2: Eingabeaufforderungen für die Software. (A) Neue Studienaufforderung in der Autostainer-Software, die die korrekten Einstellungen für das Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll (mIF) anzeigt. (B) Fügen Sie eine Eingabeaufforderung zum Hinzufügen eines Objektträgers in der Software hinzu, die die korrekten Einstellungen für das mIF-Färbeprotokoll anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Bildgebung

  1. Nachdem das Färbeprotokoll abgeschlossen ist, entfernen Sie die verschmutzten Objektträger und das Deckglas im Eindeckmedium. Lassen Sie das Eindeckmedium im Dunkeln aushärten, bis das Deckglas fest sitzt (in der Regel 1 h oder länger, Pausenpunkt).
  2. Bilde Objektträger auf einem Fluoreszenzmikroskop oder Ganzobjektträgerscanner mit entsprechenden Filtern für den Assay. Die in diesem Assay verwendeten Farbstoffe sind in der Regel mit Filtern für DAPI, FITC, TRITC, Cy5 und Cy7 kompatibel.
  3. Die Bilder werden ähnlich wie in Abbildung 3A angezeigt. Stellen Sie visuell sicher, dass alle Bereiche des Gewebes richtig scharf sind und dass Signale in einer angemessenen Intensität (nicht über-/unterbelichtet) erscheinen. Bilden Sie bei Bedarf Dias mit anderen Belichtungseinstellungen erneut ab.
  4. Wenn nach der Bildgebung eine zusätzliche Bildgebungsrunde erforderlich ist, weichen Sie die Objektträger in 1x PBS ein, bis die Deckgläser von selbst abfallen. (Pausenpunkt)

7. Ersteinrichtung des Exchange-Protokolls

  1. Wenn es sich bei der Software um Version 7.0 oder höher handelt, gibt es eine vorinstallierte Vorlage des Autostainer-Protokolls. Überprüfen Sie am unteren Rand des Bildschirms, ob die Auswahl Bevorzugter Status auf Alle eingestellt ist. Das Vorlagenprotokoll erhält den Namen *ISP Signal Exchg. Für frühere Versionen von Software ist das Protokoll in Tabelle 3 zu finden.
  2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf *ISP Signal Exchg und kopieren Sie das Protokoll. Benennen Sie im daraufhin angezeigten Popup-Fenster das Protokoll Exchange Protocol 1 mit dem abgekürzten Namen ISPEXCH1 um. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Bevorzugt aktiviert ist, bevor Sie fortfahren, und weisen Sie denselben Kit-Namen zu, den Sie in Schritt 2.6 festgelegt haben.

Tabelle 3: Protokoll für das Multiplex-Immunfluoreszenz-Signalaustauschprotokoll. Wash Buffer entspricht der BOND Wash Lösung. Alle anderen Zusatzreagenzien haben entsprechend benannte Kit-Komponenten. Dieses Protokoll ist kompatibel mit der Softwareversion 7.0 und höher, BXD 39 und höher. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

8. Einrichtung und Ausführung des Exchange-Protokolls

  1. Tauen Sie den Austauschpuffer bei Raumtemperatur auf. Bewahren Sie den Austauschneutralisator und den Austauschinitiator bis zur Verwendung bei -20 °C auf. Für die Durchführung des Austauschprotokolls werden zwei Reagenzientitrationsbehälter und das Detektionskit benötigt.
  2. Bereiten Sie die Austauschlösung im entsprechenden Behälter vor. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (450 μl x Anzahl der Objektträger) und besteht aus einem Austauschinitiator, der im Austauschpuffer 1:500 verdünnt ist. Das Austauschenzym oder die fertige Austauschlösung nicht verwirbeln, sondern nur durch Pipettieren mischen.
  3. Bereiten Sie die zweite Fluoreszenzsonde vor und mischen Sie sie in den Behälter der Fluoreszenzsonden 2. Das erforderliche Volumen beträgt 350 + (450 μL x Anzahl der Objektträger) und setzt sich aus den Fluoreszenzsonden 2 einer 1:20 verdünnten Lösung und dem 1:40 verdünnten Austauschneutralisator innerhalb des Sondenpuffers 2 zusammen. Die Fluoreszenzsondenmischung und der Sondenpuffer können vortexiert sein, aber der Austauschneutralisator und die endgültige kombinierte Lösung sollten nur per Pipette gemischt werden.
  4. Sobald alle Reagenzien vorbereitet sind, legen Sie den vollen Stab auf den Autostainer und lassen Sie die Reagenzien von der Maschine tauchen.
  5. Fügen Sie alle Folien nach Schritt 5 hinzu. Ändern Sie während des Hinzufügens der Folie die Markierung in *Negativ. Wählen Sie für Vorbereitung, HIER und Enzym die Option *---- aus, da für das Austauschprotokoll keine Entwachsung oder Antigenentnahme erforderlich ist. Sobald dies abgeschlossen ist, klicken Sie auf Folie hinzufügen.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf für die Anzahl der Folien, die in der Studie ausgeführt werden sollen, und stellen Sie sicher, dass das Feld "Folienkommentare" für jede hinzugefügte Folie aktualisiert wird, damit sie später eindeutig identifiziert werden kann.
  7. Nachdem Sie alle Objektträger hinzugefügt haben, schließen Sie das Fenster "Objektträger hinzufügen", drucken Sie alle Etiketten aus und kleben Sie sie an die entsprechenden Gewebeabschnitte.
  8. Legen Sie jede Folie auf das Fach und legen Sie die Abdeckkacheln auf jeden Abschnitt, bevor Sie das Fach in die Software einlegen.
  9. Sobald alle Reagenzien und Objektträger hinzugefügt wurden, wählen Sie den entsprechenden Autostainer in der Software aus. Dieser befindet sich auf der rechten Seite. Sobald diese Option ausgewählt ist, sind alle drei Objektträgerschalen und Informationen für alle Reagenzien in der Software sichtbar, einschließlich der Massenreagenzien und derjenigen, die während der Reagenzienvorbereitung hinzugefügt wurden.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Behälter für Schüttgutreagenzien gefüllt sind und die Abfallbehälter noch über genügend Volumen verfügen, um den Lauf abzuschließen.
  11. Nachdem Sie dies bestätigt haben, drücken Sie die Play-Taste, um den Lauf zu starten. Das Ausfüllen des Protokolls dauert ca. 90 Minuten. Notieren Sie sich die Stoppzeit und stellen Sie sicher, dass die Rutschen sofort nach Beendigung des Laufs entfernt werden.

9. Bildgebung

  1. Wiederholen Sie die Bildgebung für die neue Sondenrunde, wie in Schritt 5. Die Bilder werden wie in Abbildung 3B dargestellt.

10. Stacking (für >4-Plex-Protein-Imaging)

  1. Es sind nun mehrere Bilder für dieselbe Folie vorhanden. Kombinieren Sie die Bilder in der Bild-Co-Registrierungssoftware, um ein gestapeltes 8-Plex-Bild zu generieren.
  2. Registrieren Sie die Bilder jeder Runde wie folgt mit.
    1. Jedes runde Bild wird wie folgt benannt: _ wobei der eindeutige Name der Folie (Barcode) und eine Zeichenfolge ist, die, wenn sie alphabetisch sortiert wird, das Bild der Runde 1 an die erste Stelle und das Bild der Runde 2 an die zweite Stelle setzt. Z.B. können Dateien für = 1234ABC 1234ABC_Round1 und 1234ABC_Round2 benannt werden, wobei alle Dateien die entsprechende Erweiterung (z.B. .czi) des Scanners haben. Legen Sie alle runden Bilder in einem einzigen Ordner ab, der z.B. Quellbilder heißt.
    2. Klicken Sie in der Co-Registrierungssoftware auf die Schaltfläche Festlegen im Abschnitt Quellbildverzeichnis der Benutzeroberfläche und wählen Sie bei Aufforderung den oben erstellten Ordner aus.
    3. Legen Sie den Dateityp im Abschnitt Quellbilder auf die Erweiterung der Quellbilder fest (z. B. .czi, .qptiff usw.). Die Software zeigt nun die beiden runden Bilder zusammen in einer Tabelle an, die zeigt, dass Folie 1234ABC 2 runde Bilder enthält.
    4. Legen Sie bei Bedarf den Speicherort der gestapelten Ausgabebilder auf ein anderes Verzeichnis als den Quellbildordner fest, indem Sie auf der Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Festlegen im Abschnitt "Verzeichnis der gestapelten Bilder" klicken, und wählen Sie bei Aufforderung den Ordner "Gewünschte Ausgabe" aus. Andernfalls wird standardmäßig der Ordner mit den Quellbildern verwendet.
    5. Standardmäßig wird nur eine .afi-Dateidarstellung des Stacks erstellt. Aktivieren Sie die Option zum Speichern einer OME.tif Datei des gesamten Stacks im Abschnitt "Verarbeitungsoptionen" der Benutzeroberfläche.
    6. Um die Genauigkeit der Co-Registrierung für die gesamte Stichprobe zu validieren, aktivieren Sie die Option Validierung im Ausgabebereich der Schnittstelle.
    7. Drücken Sie die START-Taste , um die Mitregistrierung des Bildes zu starten.

11. Bildanalyse

  1. Nachdem die Folien abgebildet wurden, können Sie die Folien mit einer beliebigen Analysemethode Ihrer Wahl visualisieren und analysieren, z. B. mit der STARVUE-Bildverarbeitungssuite von Ultivue oder QuPath15.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemäß dem obigen Protokoll wird FFPE-Gewebe mit mehreren Zielen gefärbt, und es wurden qualitativ hochwertige Bilder aller Marker in Vierergruppen erhalten (Abbildung 3A, B). Die Bild-Co-Registrierungssoftware ermöglicht es, Bilder von derselben Folie zu kombinieren und co-zu registrieren, wie in Abbildung 3C zu sehen ist. Ähnliche Ergebnisse sind in Abbildung 4 für einen Gewebeschnitt bei Darmkrebs (CRC) dargestellt.

Der Erfolg des Protokolls sollte durch die Beurteilung des erwarteten Färbemusters bestimmt werden. Im gezeigten SFB-Beispiel wird jedes der gefärbten Ziele im erwarteten subzellulären Kompartiment exprimiert, z. B. nukleäres FoxP3, membranöses CD3, zytoplasmatisches CD68 (Abbildung 4B-D). Jedes der funktionellen Ziele wird auf dem entsprechenden Zelltyp exprimiert, wie das Beispiel der Co-Lokalisation von PD1 und CD3 oder von PDL-1 und CD68 zeigt, die erschöpfte T-Zellen bzw. immunsuppressive Makrophagen zeigen. Die Beurteilung eines guten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses, das eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen richtig positivem Signal und potenziellem Hintergrundrauschen ermöglicht, wird in der Regel qualitativ von Pathologen oder Bildanalyseexperten durchgeführt, die die Qualität der Färbung bestätigen, was eine erfolgreiche Bildanalyse ermöglicht. Um die Qualität und Leistung der Färbung weiter zu bestätigen, kann ein Vergleich mit dem Goldstandard IHC (chromogenes DAB) auf seriellen Schnitten hinzugefügt werden (siehe Beispiel in Abbildung 5) sowie eine Positivkontrollgewebeprobe wie z. B. eine menschliche Mandel, die für die meisten Immunziele nützlich sein kann, um den Erfolg des Färbelaufs zu bestätigen. Es ist zu beachten, dass Krebserkrankungen eine geringere Expression von Zielen aufweisen können als menschliche Mandeln16.

Nachdem die Ergebnisse qualitativ bestätigt wurden, kann eine quantitative Analyse durchgeführt werden. In dieser Arbeit besteht dies hauptsächlich aus der Berechnung der Zelldichte verschiedener Phänotypen (Anzahl der Zellen/mm2), die ein bestimmtes Ziel oder Ziele exprimieren, sowie aus der Berechnung der durchschnittlichen Intensitätsniveaus von funktionellen Zielen, die einen breiten dynamischen Expressionsbereich aufweisen können. Bei der Beurteilung der Genauigkeit von mIF-Assays sollten serielle Schnitte, die mit denselben Markern gefärbt wurden, vergleichbare Signale zwischen den Objektträgern zeigen, was qualitativ in Abbildung 6 zu sehen ist. Beispiele für quantitative Ergebnisse von Einzelmarkerdichten in verschiedenen Gewebetypen sind in Abbildung 7 dargestellt. Die Bildanalyse auf diesen Bildern ermöglicht die Identifizierung positiver Zellen und die Berechnung einer entsprechenden positiven Zelldichte für jeden Marker sowie die durchschnittliche Signalintensität pro positiver Zelle. Auf diese Weise kann für jeden Marker ein Variabilitätskoeffizient (CV) berechnet werden, um die Genauigkeit des Multiplexing-Assays zu beurteilen (Tabelle 4).

figure-results-1
Abbildung 3: Bilder eines Gewebe-Microarrays (TMA)-Kerns, die aus aufeinanderfolgenden Färberunden im 8-Plex-Immunfluoreszenzprotokoll gewonnen wurden. (A) Bild aus der ersten Bildgebungsrunde mit den Markern CD8, PD1, PD-L1 und CD68. Nach dem Austauschprotokoll zeigt (B) die zweite Bildgebungsrunde auf demselben Objektträger für die zweite Runde der Marker CD3, CD4, FoxP3 und CK/SOX10, und (C) zeigt ein co-registriertes Bild, das die Bilder (A) und (B) kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 4: Repräsentative Färbung von Darmkrebsgewebe mit 8-Plex-Immunfluoreszenzfärbung. Die Abbildung zeigt zelluläre Phänotypen, die durch die Co-Lokalisierung mehrerer Ziele in derselben Zelle identifiziert werden können. (nach oben) Bild des gesamten Objektträgers von Darmkrebsgewebe. (unten) Detaillierte Ansichten von Regionen des Gewebes, die (A) T-reg-Zellen (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) PD-1- und PD-L1-exprimierende Zellen in Tumoren und Stroma, (C) erschöpfte zytotoxische T-Zellen (CD3+/CD8+/PD-1), (D) immunevagnierende Tumorzellen (PD-L1+/CK+) und immunsuppressive Makrophagen (CD68+/PDL1+) hervorheben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 5: Qualitativer Vergleich der Immunhistochemie (IHC) mit der Immunfluoreszenz (IF)-Färbung. Serielle Schnitte, die mit einer immunhistochemischen Einzelmarker-Färbung (DAB, obere Reihe), einer Einzelmarker-Immunfluoreszenz (ISP-Monoplex) und einer Einkanalansicht der Multiplex-Immunfluoreszenz (ISP-Multiplex) gefärbt wurden, zeigen die qualitative Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Färbemethoden. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 6: Färbung des seriellen Schnitts. (A) Diagramm, das das Layout einer Multigewebe-TMA zeigt. (B) Repräsentative 8-Plex-Bilder von Gewebekernen jedes Gewebetyps in der TMA. (C) Repräsentative Bilder von CD8 in einem Mandelkern über sechs serielle TMA-Schnitte, die in einem einzigen Lauf gefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 7: Quantifizierung der Einzelmarkerdichte pro Gewebetyp, der in der TMA enthalten ist. Die Dichten pro Gewebe sind die durchschnittlichen Dichten über drei repräsentative Kerne jedes Gewebetyps auf dem TMA-Objektträger. Die y-Achse stellt die einzelnen Markerdichten in verschiedenen Gewebetypen auf der x-Achse dar, in Einheiten von positiven Zellen/mm2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 8: Region of Interest (ROI)-Analyse des relativen Fluoreszenzsignals im Vergleich des in diesem Protokoll beschriebenen verstärkten ISP mIF mit dem indirekten ZF. (A) Repräsentativer Objektträger, gefärbt für CK (links) oder PD-L1 (rechts) mit fünf angezeigten ROIs. (B) Repräsentative ROI-Bilder für CK (oben) und PD-L1 (unten). Mittlere Signalintensität, die mit amplifiziertem mIF (violett) und indirektem IF (blau) für (C) CK und (D) PD-L1 über fünf ROIs mit den Maßen 100 μm x 100 μm und ca. 200 Zellen erreicht wird. Die Werte der Y-Achse zeigen beliebige fluoreszierende Einheiten und Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen (n=3) an. (E) Die relative Signalintensität, die mit verstärktem ISP-mIF (violett) und indirektem IF (blau) erreicht wurde, wurde berechnet, indem das Verhältnis des mittleren verstärkten mIF-Signals zum mittleren indirekten IF-Signal über alle ROIs hinweg genommen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 4: Berechneter Varianzkoeffizient (CV). Die CV der positiven Zelldichte und die mittlere Signalintensität für die Tonsillenbilder sind in Abbildung 6 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Bericht wird ein Protokoll für die hochempfindliche Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung mit hohem Durchsatz und einem Autostainer beschrieben. Bei der Durchführung dieses Protokolls sind die Schritte zur Vorbereitung der Reagenzien von entscheidender Bedeutung und verdienen Aufmerksamkeit. Es muss sichergestellt werden, dass die Reagenzien richtig gemischt und korrekt dosiert werden, um die Variabilität der Färbung zwischen verschiedenen Objektträgern im selben Lauf oder zwischen verschiedenen Läufen mit denselben Komponenten zu minimieren.

Häufige Probleme bei der Durchführung dieses Protokolls sind das nicht richtige Mischen der Reagenzien vor dem Laden und das Potenzial für Gewebeverlust aufgrund eines unsachgemäßen Decoverslipping-Verfahrens. Während dieses Färbeprotokoll auf alle FFPE-Gewebetypen anwendbar ist, einschließlich Krebsarten, können einige Gewebetypen eine sorgfältigere Handhabung erfordern (z. B. Gewebe mit hohem Fettgehalt). Um Gewebeverlust zu vermeiden, lassen Sie die eingedeckten Objektträger so lange einweichen, dass sich der Deckglas von selbst löst. Hebeln Sie das Deckglas nicht mit Gewalt ab und hebeln Sie es nicht ab.

Eine Einschränkung besteht darin, dass viele der am häufigsten verwendeten Targets in der Immunonkologie zwar validiert und einsatzbereit sind, einige Targets jedoch möglicherweise eine Assay-Entwicklung erfordern, bevor sie in ein Multiplex-Panel aufgenommen werden. Obwohl dieser Prozess relativ schnell ist, kann dies einige zusätzliche Wochen erfordern, bevor ein benutzerdefiniertes Multiplex-Panel verwendet werden kann.

Es gibt mehrere Unterschiede zwischen diesem Assay und anderen Multiplex-Immunfluoreszenztechnologien. Im Vergleich zu direkten und indirekten Immunfluoreszenz-basierten Technologien weist der hier gezeigte Assay ein signifikant höheres Amplifikationsniveau auf, was ein deutlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht, insbesondere in Kanälen, die tendenziell Gewebe-Autofluoreszenz zeigen, wie z. B. dem FITC-Kanal. Dies führt zu einem ~30x stärkeren Signal als direkte Immunfluoreszenz und ~10x stärkerem Signal als indirekte Immunfluoreszenz, wie durch die Intensitätsanalyse des gesamten Objektträgers und die manuelle ROI-basierte Analyse quantifiziert wurde (Abbildung 8). Diese Methode ermöglicht eine viel empfindlichere Detektion von Zielproteinen bei wesentlich kürzeren Belichtungszeiten und macht Bildmanipulationen überflüssig, einschließlich Hintergrundsubtraktion, die das Risiko birgt, Signale mit geringer Intensität zu entfernen.

Im Vergleich zu mIF-Assays, die auf enzymkatalysierter Amplifikation basieren, hat der hier gezeigte Assay eine deutlich verbesserte Fähigkeit zur Durchführung von Multiplexing, einen einfacheren Arbeitsablauf und eine allgemein kürzere Assay-Laufzeit (Abbildung 1). Bei diesem Assay werden die Antikörper in einem einzigen Schritt addiert und gleichzeitig amplifiziert, was das Assay-Protokoll erheblich vereinfacht. Darüber hinaus können einige enzymbasierte Technologien, wie z. B. die Tyramid-Signalamplifikation (TSA), Interferenzen zwischen verschiedenen Antikörpern aufweisen, was als Umbrella-Effekt bezeichnet wird 12,17,18. Die hier verwendete Amplifikationstechnologie vermeidet dieses Problem und ermöglicht den Nachweis mehrerer kolokalisierter und co-exprimierter Marker auf derselben Zelle, wie in Abbildung 4 zu sehen ist.

Etwa 90 % der Krebserkrankungen beim Menschen gehen aus Epithelzellen hervor19. Dies liegt daran, dass sie oft die erste Verteidigungslinie gegen die äußere Umgebung bilden und sich schneller vermehren, was zu einer schnelleren Anhäufung potenziell onkogener Mutationen führt. Hier spielt die Entzündung eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung, -progression und -verbreitung. In den letzten zehn Jahren haben sich viele Therapien, die auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren und Immunzellen abzielen, als leistungsstarkes Arsenal gegen viele Tumorarten erwiesen 5,20,21. Ein erheblicher Teil der Patienten spricht jedoch immer noch nicht auf das Ansprechen an. Es ist wahrscheinlich, dass die Tumormikroumgebung (TME) und die lokale Immunlandschaft eine entscheidende Rolle spielen. Durch die Profilierung der molekularen TME-Signaturen, die mit einem unterschiedlichen Ansprechen auf Medikamente bei vielen Patienten verbunden sind, könnte es möglich sein, therapeutische Biomarker besser zu definieren. Dieser Bericht zeigt, dass die mIF-Technologie verwendet werden kann, um mehrere Protein-Biomarker parallel zu profilieren, einschließlich Marker mit geringer Expression, über Hunderte von ganzen Probenobjektträgern oder Tumor-Microarrays.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. und A. Vasaturo sind Mitarbeiter von Ultivue, das die in dieser Arbeit verwendeten Multiplex-Immunfluoreszenz-Kits herstellt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von Ultivue unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-CD3UltivueKlon BC33 (BioCare). Teil von ULT50801
Anti-CD4UltivueClone SP35 (Abcam). Teil ULT50801
Anti-CD68UltivueKlon KP1 (BioCare). Teil ULT50801
Anti-CD8UltivueKlon C8/144B (BioCare). Teil der ULT50801
Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10Ultivue-KloneAE1/AE3 (Bethyl Labs) und BC34 (BioCare). Teil ULT50801, wird als Mischung
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo) geliefert. Teil ULT50801
Anti-PD1UltivueKlon CAL20 (Abcam). Teil von ULT50801
Anti-PDL1UltivueClone 73-10 (Abcam). Teil ULT50801
Axioscan.Z1 MikroskopsZeissgenanntes Fluoreszenzmikroskop im Text
Bond Dewax SolutionLeicaAR9222
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700
Bond Research Detection KitLeicaDS9455
Bond Titration InsertsLeicaOPT9049
Bond Titration KitLeicaOPT9719
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Bond Wash Solution 10x KonzentratLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicaim Text "Autostainer" genannt
BondRX SoftwareLeicaVersion 6.0 oder höher
Deckgläser, #1,5 DickeCorning2980-244
Ethanol, 200 proofVWR89370-084
FFPE-GewebeblöckeBioIVT-Gewebetypenvariieren
OmniVUE 8-Plex-Assay (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801enthält alle anderen Ultivue-Komponenten
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Boston BioProductsC-9911FpH 7,4 mit 2,7 mM KCl und 137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermoP10144
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Amplification BufferUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Antikörper-VerdünnungsmittelUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Exchange BufferUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Exchange InitiatorUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Fluoreszenzsonden 1UltivueTeil von ULT50801
Ultivue Fluoreszenzsonden 2UltivueTeil von ULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueTeil von ULT50801
Ultivue Sonde PufferUltivueTeil von ULT50801
ReinstwasserSigma-AldrichW4502
( im Text UltiAnalyzer.AI Ultivue als "Eindeckmedium" bezeichnet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Automatisierte ImmunfluoreszenzDNA barcodierte Antik rperSignalverst rkungWhole Slide Imagingr umliche ProteomikGewebe MicroarrayEinzelzellanalyseImmunph notypisierungformalinfixiertes Gewebe

Verwandte Artikel