Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Reinigung, Erweiterung und Charakterisierung von hochhomogenen mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Mäusen. Dieser Ansatz ermöglicht die Gewinnung großer Mengen von BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial, unterstützt Mausmodelle und fördert die präklinische Forschung.

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine Population von Stammzellen, die sich selbst erneuern und sich in mehrere Zelllinien differenzieren können. Unter ihnen spielen MSCs, die im Knochenmark vorkommen und als mesenchymale Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks bekannt sind, eine entscheidende Rolle bei der Osteogenese, der hämatopoetischen Unterstützung, dem Homing/Migration und der Immunsuppression. BMSCs werden aufgrund ihres Potenzials für zelluläre therapeutische Strategien sowie ihrer leichten Verfügbarkeit, genetischen Stabilität und geringen Immunogenität häufig in der Zellbiologie und Tissue Engineering-Forschung eingesetzt. Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) und BMSCs existieren nebeneinander im Knochenmark, haben aber unterschiedliche Vorläuferzellen. Bei der Extraktion von Zellen aus dem Knochenmark werden in der Regel mehrere Zelltypen gewonnen, was zu einer Heterogenität in der Zellpopulation führen kann, was möglicherweise zu Verzerrungen führt und nicht den hohen experimentellen Standards entspricht. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, wirksame Techniken zu entwickeln, um die Homogenität und Ausbeute von BMSC in vitro zu verbessern. Diese Studie stellt ein detailliertes Protokoll für die Reinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von BMSCs vor, die aus BALB/c-Mäusen gewonnen wurden. Die Homogenität und der Stammzellphänotyp von BMSCs der dritten Passage wurden mittels Durchflusszytometrie charakterisiert, wobei eine Positivität für CD29, CD44 und Sca-1 und eine Negativität für CD45 und CD31 nachgewiesen und ihre osteogene und adipogene Differenzierungsfähigkeit bestätigt wurde. Dieses kostengünstige Protokoll bietet eine einfache und effiziente Methode, um eine ausreichende Anzahl homogener BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial zu erhalten, was für die voranschreitende Forschung in Mausmodellen und umfangreiche präklinische Studien unerlässlich ist.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks sind für ihre multipotenten Eigenschaften bekannt und werden aufgrund ihrer selbsterneuerbaren, differenzierenden und immunmodulatorischen Eigenschaften häufig bei der Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt ^1,2. BMSCs sind leicht erhältlich, können sich stark ausdehnen, weisen immunsuppressive Eigenschaften auf und lösen keine unmittelbaren Immunreaktionen^{aus 3}, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen und wirksame Träger für die Zelltherapie attraktiv macht.

Im Knochenmark sind zwei Hauptstammzellpopulationen und ihre Nachkommen, die hämatopoetischen Stammzellen und die BMSCs, die primären Bewohner⁴. Traditionell werden BMSCs durch gezielte Knochenmarkaspiration gewonnen und in vitro als plastisch adhärente Zellen identifiziert. Diese Methode ist jedoch nicht ausreichend, um BMSCs von anderen Knochenmark-Subpopulationen, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, Leukozyten und hämatopoetischen Stammzellen, zu unterscheiden⁵. Daher ist ein einfaches und effektives Protokoll für die Isolierung von BMSCs erforderlich.

Die aktuelle Arbeit befasst sich mit der Trennung und Reinigung von BMSCs durch ihre physikalische Adhärenz an Kunststoff-Zellkulturplatten. Durchflusszytometrische Experimente wurden an BMSCs der dritten Passage unter Verwendung der Oberflächenmarker CD29, CD44 und Sca-1 durchgeführt, wie^{vom Ausschuss der} International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT) für mesenchymale Stromazellen (MSC) 6 beschrieben. Gemäß den ISCT-Kriterien sind Maus-MSCs durch Positivität für CD29, CD44 und Stammzellantigen 1 (Sca-1) und Negativität für den hämatopoetischen Zellmarker CD45 und den Endothelzellmarker CD31 gekennzeichnet. Darüber hinaus sollten BMSCs multipotent sein und eine Trilineage-Differenzierung in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zeigen. In diesem Experiment wurde die Osteogenese in den extrahierten BMSCs induziert, wobei die ALP-Färbung an Tag 7 und ein Alizarinrot-S-Assay an Tag 21 durchgeführt wurde, um die Differenzierung zu beurteilen. Die adipogene Differenzierung von isolierten und gereinigten BMSCs wurde ebenfalls induziert, wobei an Tag 21 eine Ölrot-O-Färbung durchgeführt wurde, um die Adipogenese zu beurteilen.

Protocol

Der Umgang mit den Tieren wurde in Übereinstimmung mit den Laboratory Animal Ethics Guidelines (Ethical approval No.: PZSHUTCM2211070009) der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine zugelassen. In dieser Studie wurden acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (SPF-Grad, 20 ± 1 g Körpergewicht) verwendet. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung, das Passaging, die auf Durchflusszytometrie basierende Phänotypisierung sowie die osteogene und adipogene Differenzierung von aus Mäusen stammenden BMSCs. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Umgang mit Tieren

1. Haltung von Mäusen unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in individuell beatmeten Käfigen, mit fünf Mäusen pro Käfig. Stellen Sie Futter in SPF-Qualität und steriles Wasser bereit. Halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ein.
   HINWEIS: Diese Methode wurde sowohl bei den Mausstämmen BALB/c als auch C57BL/6 getestet und für praktikabel befunden. In dieser Arbeit wird hauptsächlich BALB/c als Beispiel verwendet.

2. Entnahme von Femuren und Tibias aus den Hintergliedmaßen der Maus

1. Euthanasieren Sie die Tiere durch CO₂ -Erstickung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation⁷ gemäß ethischen Richtlinien.
2. Weichen Sie die Mäuse 5 Minuten lang in 75%igem Ethanol ein (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Stammzellen wurden innerhalb von 30 Minuten² nach der Euthanasie geerntet, und der gesamte Prozess, einschließlich Knochenmarkspülung, Filtration und Aussaat in Kulturplatten, wurde innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen, um eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
   HINWEIS: Verwenden Sie erwachsene Mäuse (≥8 Wochen alt) für eine optimale BMSC-Ausbeute; 8–12 Wochen alte Mäuse sind ideal⁸.
3. Machen Sie mit einer sterilen Dissektionschere einen Schnitt von etwa 1 cm an der hinteren Extremität der Achillessehne (Abbildung 1B).
4. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen kreisförmigen Schnitt um die hintere Extremität der Achillessehne, um die distale Tibia freizulegen (Abbildung 1C).
5. Schälen Sie die Haut vom Schnitt in Richtung Hüfte, um sie von beiden Hintergliedmaßen zu entfernen (Abbildung 1D).
6. Schneiden Sie entlang des Beckenknochens, um den Hüftkopf vom Hüftknochen zu trennen (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die beidseitigen Gelenke des Oberschenkelknochens während der Dissektion zu beschädigen, um den Verlust von Knochenmark zu verhindern.
7. Legen Sie die gesammelten Femure und Tibias in eine 60-mm-Schale, die steriles PBS mit 2 % Penicillin/Streptomycin enthält (Abbildung 2B).
8. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell so viel Sehnen und Muskeln wie möglich von Tibia und Wadenbein ab, um die spätere Spülung zu erleichtern (Abbildung 2C).
9. Die verarbeiteten Knochen werden wieder in PBS mit 2 % Penicillin/Streptomycin überführt und für nachfolgende Isolierungsschritte in die sterile Haube überführt.

3. Reinigung und Kultivierung von Maus-BMSCs

1. Bereiten Sie das vollständige MEM-Alpha-Modifikationsmedium (αMEM) für die BMSC-Kultur vor, indem Sie αMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen.
   HINWEIS: Wählen Sie ein αMEM-Medium, da es 1000 mg/l Glukose enthält, was eine relativ niedrige Konzentration ist. Dies hilft, die Hemmung der Zellproliferation zu verhindern, die in Umgebungen mit hohem Glukosegehalt auftreten kann⁹
2. Nehmen Sie eine 50-ml-Spritze und befestigen Sie die Nadel, die mit der Spritze geliefert wird.
3. Ziehen Sie 20 ml αMEM-Medium in die 50-ml-Spritze und ersetzen Sie dann die Nadel durch die Nadel, die mit der 1-ml-Spritze geliefert wird.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine 1-ml-Spritzennadel, um die Knochengröße anzupassen und die Zellschäden zu minimieren. Eine 50-ml-Spritze ermöglicht eine effiziente Spülung des Knochenmarks mit geringerem Risiko einer Zellkontamination durch wiederholte Insertionen.
4. Schneiden Sie mit einer Schere beide Enden des abgetrennten Oberschenkelknochens oder des Schienbeins in einer sterilen Haube ab.
5. Führen Sie die Nadel entlang der Schnittkante in den Knochen ein und spülen Sie das Knochenmark in eine 100-mm-Kulturschale mit vollständigem αMEM-Medium (Abbildung 2D).
6. Spülen Sie die Knochenhöhlen wiederholt, bis die Knochenstücke blass erscheinen, um sicherzustellen, dass das meiste Knochenmark entnommen wurde (Abbildung 2E).
7. Pipettieren Sie 40 Mal vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf und ab, um die aggregierten Zellen so weit wie möglich zu dispergieren.
8. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, um Ablagerungen, Gewebefragmente und undispergierte Klumpen zu entfernen.
9. Die filtrierte Zellsuspension wird in eine 100-mm-Zellkulturschale überführt und das vollständige αMEM-Medium auf ein Endvolumen von 15 ml pro Schale gegeben.
   HINWEIS: Kultivieren Sie alle Knochenmarkzellen, die aus den Femuren und Tibias jeder Maus entnommen wurden, in einer 100-mm-Kulturschale, um das Zellwachstum zu erleichtern. Basierend auf früheren Experimenten können etwa 1 × 10⁷ BMC aus einer 8 Wochen alten Maus (aus zwei Femuren und zwei Tibias) isoliert werden. Diese Zellen werden für die Primärkultur in eine 100-mm-Kulturschale mit einer Dichte von 1,8 × 10⁵ Zellen/^cm2 ausgesät.
10. Halten Sie die Schale mit beiden Händen fest und schwenken Sie sie vorsichtig 15 Mal in einer Achterbewegung, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Schale zu gewährleisten.
11. Die Kulturschale bei 37 °C in einen 5 %_{CO 2} -Inkubator stellen und 5 Tage lang kultivieren (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Kulturschale während dieser Zeit zu bewegen, um ein gleichmäßiges Zellwachstum zu gewährleisten.

4. Ersatz des αMEM-Mediums für die BMSC-Kultur

1. Beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um festzustellen, ob sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Wenn nicht, fahren Sie mit dem Austausch des Mediums am 5^. Tag fort.
2. Ziehen Sie 3 mL PBS mit einer sterilen Pasteur-Pipette und geben Sie es aus einer Höhe von 1 cm über der Kulturschale an verschiedenen Positionen ab.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, Flüssigkeit an einer Seite der Schale abzugeben, da dies aufgrund übermäßiger Aufprallkraft anhaftende Zellen entfernen und eine effektive Entfernung unerwünschter Zellen verhindern kann.
3. Nachdem Sie 3 ml PBS hinzugefügt haben, schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig, um die Zellen gründlich zu waschen, und entfernen Sie PBS mit einer Pipette aus der Schale. Wiederholen Sie den Waschvorgang erneut, um sicherzustellen, dass die Zellen gründlich gewaschen werden.
4. Entnehmen Sie 15 mL vollständiges αMEM-Medium mit einer sterilen Pasteur-Pipette und geben Sie es aus 1 cm Höhe über der Kulturschale an verschiedenen Positionen ab.
5. Setzen Sie die Kulturschale wieder in den Inkubator ein und überwachen Sie, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, bevor sie subkultiviert werden (Abbildung 3B).

5. Verabschiedung der BMSC

1. Waschen Sie 80 % der konfluenten Zellen zweimal mit PBS (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Das Waschen der Zellen mit PBS vor dem Aufschluss hilft, Restmedium und Zellsekrete zu entfernen und die MSC-Adhäsion an der Kulturschale zu reduzieren.
2. Verdauen Sie die Zellen mit 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA, indem Sie sie 2–3 Minuten lang bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator inkubieren.
3. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie der Zellsuspension 4 ml vollständiges αMEM-Medium hinzufügen.
4. Aspirieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipettenspitze aus der Kulturschale und spülen Sie vorsichtig den Boden der Schale, um alle adhärenten Zellen zu lösen.
5. Die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 300 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
6. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 mL vollständigem αMEM-Medium.
   HINWEIS: Für die Subkultivierung erwies sich eine Aussaatdichte von ca. 4 × 10⁴ Zellen/^cm2 als optimal für das anhaltende Wachstum und die Proliferation.
7. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:1–1:2 in neue 100-mm-Zellkulturschalen auf (dies ist die 1^. Passage, P1) (Abbildung 3D).
8. Teilen Sie die Zellen etwa alle drei Tage im Verhältnis 1:1,5, wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreichen, um die zweite Passage (P2) (Abbildung 3E) und die dritte Passage (P3) (Abbildung 3F) von BMSCs zu erzeugen.

6. Vorbereitung von P3-BMSCs für die phänotypische Identifizierung und osteogene Differenzierung

1. Entsorgen Sie das Zellkulturmedium.
2. Waschen Sie die P3 BMSCs zweimal mit 3 mL PBS.
3. Verdauen Sie die P3-BMSCs mit 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA, indem Sie sie 2–3 Minuten lang bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator inkubieren, wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreichen.
4. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie der Zellsuspension 4 ml vollständiges αMEM-Medium hinzufügen.
5. Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   HINWEIS: Die hier hergestellten P3 BMSC-Pellets werden zur phänotypischen Identifizierung mittels Durchflusszytometrie und zur Beurteilung der osteogenen oder adipogenen Differenzierung verwendet.

7. Phänotypische Identifizierung von BMSCs mittels Durchflusszytometer

1. Resuspendieren Sie die Zellpellets von P3-BMSCs mit 1,5 ml PBS-Lösung, die 2 % FBS enthält, und stellen Sie die Konzentration auf 5 × 10⁶ Zellen/ml ein.
2. Aliquotieren Sie 100 μl der Zellsuspension in jedes von 11 Röhrchen, um 5 × 10⁵ Zellen pro Röhrchen zu erreichen. Bereiten Sie die folgenden Gruppen vor: Etikettenleerer, CD29-Isotypkontrolle, CD29, CD44-Isotypkontrolle, CD44, Sca-1-Isotypkontrolle, Sca-1, CD31-Isotypkontrolle, CD31, CD45-Isotypkontrolle und CD45.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden die folgenden Fluorochrome verwendet: CD29-FITC, CD29-Isotyp-FITC, CD44-APC, CD44-Isotyp-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1-Isotyp-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45-Isotyp-PerCPcy5.5, CD31-PE und CD31-Isotyp-PE (wie in der Materialtabelle gezeigt). Diese Fluorochrome können basierend auf den Konfigurationen verschiedener Durchflusszytometer modifiziert werden.
3. Für jede Gruppe werden die folgenden Reagenzien hinzugefügt: 2 μl PBS in die Blanko-Gruppe, 2 μl CD29-Isotyp in die Kontrollgruppe des CD29-Isotyps (1:50 Verdünnung), 2 μl CD29 in die CD29-Gruppe (1:50 Verdünnung), 0,5 μl CD44-Isotyp in die CD44-Isotyp-Kontrollgruppe (1:200 Verdünnung), 0,5 μl CD44 in die CD44-Gruppe (1:200 Verdünnung), 0,5 μl Sca-1-Isotyp für die Sca-1-Isotyp-Kontrollgruppe (1:200 Verdünnung), 0,5 μl Sca-1 für die Sca-1-Gruppe (1:200 Verdünnung), 2 μl CD31-Isotyp für die CD31-Isotyp-Kontrollgruppe (1:50 Verdünnung), 2 μl CD31 für die CD31-Gruppe (1:50 Verdünnung), 2 μl CD45-Isotyp für die CD45-Isotyp-Kontrollgruppe (1:50 Verdünnung), und 2 μl CD45 in die CD45-Gruppe (1:50 Verdünnung).
   HINWEIS: Die Antikörper wurden gemäß den optimierten Empfehlungen des Herstellers für die Durchflusszytometrie verwendet. Vorversuche bestätigten eine optimale Färbung und Spezifität für die Zielzellen. Beziehen Sie sich auf die Dosierungsrichtlinien des Herstellers und führen Sie bei Bedarf Titer-Vortests durch.
4. Vorsichtig mischen, mit einer Handballenzentrifuge zentrifugieren und 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
5. 900 μl PBS in jedes Röhrchen geben, durch Invertieren mischen und 5 min bei 4 °C bei 300 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in jedem Röhrchen mit 300 μl PBS und analysieren Sie es mit einem Durchflusszytometer.
   HINWEIS: Die Zellen müssen nicht mit 2,5 % neutralem Formaldehyd fixiert werden, wenn der Durchflusszytometer-Assay innerhalb von 1–2 Stunden abgeschlossen werden kann. Wenn die Analyse nicht innerhalb von 1–2 Stunden durchgeführt werden kann, fixieren Sie die Zellen mit 2,5 % neutralem gepuffertem Formalin (hergestellt durch Mischen von 10 % neutralem gepuffertem Formalin mit PBS im Verhältnis 1:3) und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C im Dunkeln für einen späteren Durchflusszytometer-Assay.
7. Passen Sie die Spannung des Durchflusszytometers mithilfe der Markierungsrohlingsgruppe an, um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenz der Zellen innerhalb von etwa 1/4 bis 1/3 der Koordinatenachse liegt. Laden Sie nacheinander die Zellen aus den Gruppen CD29, CD29, CD44, CD44, Sca-1, Sca-1, Sca-1, CD31, CD31, CD31, CD45 und CD45. Stellen Sie das P1-Gate (wie im FSC/SSC-Diagramm definiert) so ein, dass 10.000 Zellen bei mittlerer Geschwindigkeit erfasst werden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Durchflusszytometer mit den entsprechenden Kanälen ausgestattet ist, wie z. B. den in den Experimenten üblicherweise verwendeten Kanälen: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 und APC, oder mit anderen Kanälen, die antikörpergekoppelten Fluoreszinen entsprechen.

8. Osteogene Differenzierung von BMSCs

1. Resuspendieren Sie P3 BMSC-Pellets in vollständigem αMEM-Medium und stellen Sie die Konzentration auf 1 × 10⁵ Zellen/ml ein.
2. P3-BMSCs werden in eine 24-Well-Zellkulturplatte eingepflanzt, indem 1 ml vollständiges αMEM-Medium mit 1 × 10⁵ Zellen in jede Vertiefung gegeben wird.
3. Kultivieren Sie die P3-BMSCs bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator für 3–5 Tage, bis sie eine Konfluenz von über 90 % erreichen. Ersetzen Sie das komplette αMEM-Medium alle 2 Tage durch frisches Medium.
4. Teilen Sie die verschiedenen Vertiefungen zu gleichen Teilen in zwei Gruppen auf: die negative Kontrollgruppe (ohne osteogene Differenzierungsinduktion) und die osteogene Differenzierungsgruppe
5. Bereiten Sie das osteogene Differenzierungsinduktionsmedium vor, indem Sie das vollständige αMEM-Medium mit 10 mmol/l β-Glycerophosphat, 50 mg/l L-Ascorbinsäure und ^10-8 mol/l Dexamethason ergänzen.
6. Verwerfen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die P3-BMSCs mit 1 ml PBS.
7. Geben Sie das osteogene Differenzierungsinduktionsmedium in die Vertiefungen der osteogenen Differenzierungsgruppe für die osteogene Differenzierungsinduktion (1 ml/Well).
8. Geben Sie das vollständige αMEM-Medium in die Vertiefungen der Kontrollgruppe (1 ml/Vertiefung).
9. Die P3-BMSCs werden 7 oder 21 Tage lang bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator kultiviert und alle 3 Tage das osteogene Differenzierungsinduktionsmedium oder das vollständige αMEM-Medium durch dasselbe frische Medium ersetzt.
   HINWEIS: Zellen mit einer 7-tägigen Induktion werden für die Färbung der alkalischen Phosphatase (ALP) verwendet. Zellen mit einer 21-tägigen Induktion werden für den Alizarinrot-S-Assay verwendet.

9. Identifizierung differenzierter osteogener Zellen mit ALP-Färbung

1. Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte einmal mit 1 ml PBS.
2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml 10%ige gepufferte Formalinlösung hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung erneut einmal mit 1 mL PBS.
4. Geben Sie 0,5 ml alkalisches Phosphatase-Färbereagenz 1-Step NBT/BCIP in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C mit Aluminiumfolie zum Schutz vor Licht.
5. Entsorgen Sie die Lösung, waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung einmal mit 1 ml destilliertem Wasser und lassen Sie die Platte trocknen.
6. Beobachten und erfassen Sie Bilder von gefärbten Kolonien mit einer Kamera, um ALP-positive Zellen mit schwarz-violettem Niederschlag zu identifizieren.
   HINWEIS: Das Färbereagenz für alkalische Phosphatase (ALP) 1-Step NBT/BCIP erzeugt bei Reaktion mit ALP einen starken, unlöslichen schwarz-violetten Niederschlag, der leicht sichtbar gemacht werden kann.

10. Identifizierung differenzierter osteogener Zellen mittels Alizarinrot-S-Assay

1. Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte einmal mit 1 ml PBS.
2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml 10%ige gepufferte Formalinlösung hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte einmal mit 1 ml PBS.
4. Geben Sie 0,5 mL 0,1 % Alizarinrot S in 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 8,3) in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 °C für 30–60 min.
5. Entsorgen Sie die Lösung, waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung einmal mit 1 ml destilliertem Wasser und lassen Sie die Platte trocknen.
6. Beobachten und erfassen Sie Bilder von gefärbten Kolonien mit einer Kamera, um Alizarinrot-S-positive Zellen zu identifizieren.
   HINWEIS: Der Alizarinrot-S-Assay für die MSC-Differenzierung in reife mineralisierte Knochenzellen führt zur Bildung eines Alizarinrot-S-Calcium-Komplexes, der einen hellroten Fleck erzeugt, der visuell beobachtet werden kann.

11. Herstellung des adipogenen Induktionsdifferenzierungsmediums A für BMSCs

HINWEIS: Für die Adipozytendifferenzierung von BMSCs wird gemäß den Richtlinien häufig ein Adipogenes Differenzierungskit für mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus (siehe Materialtabelle) verwendet.

1. Legen Sie das fötale Rinderserum (ein Bestandteil des Kits, das als Serum bezeichnet wird) mindestens 6 Stunden lang in den 4 °C-Kühlschrank, bevor Sie es vollständig auftauen.
2. Legen Sie die Ergänzung A-I (Bestandteil des Kits) mindestens 30 Minuten vor der Zubereitung in den 4° C Kühlschrank; Ergänzen Sie A-II (Bestandteil des Kits) bei Raumtemperatur, bis es vollständig aufgetaut ist.
3. Drehen Sie das Reagenzröhrchen um oder klopfen Sie es vorsichtig ab, um den Inhalt zu mischen.
4. Das Reagenzröhrchen der Ergänzung A-II bei 300 × g für 30 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich das Reagenz am Boden sammelt und leicht entnommen werden kann.
5. Reinigen Sie die Außenverpackung aller Komponenten gründlich mit 75%igem medizinischem Alkohol und öffnen Sie diese in einer Biosicherheitswerkbank.
6. Serum , Supplement A-I und Supplement A-II in das Medium geben.
   HINWEIS: Um eine ordnungsgemäße Auflösung zu gewährleisten, erhitzen Sie das Basalmedium (eine Komponente des Kits) auf 37 °C, da sonst das Supplement A-II aufgrund der Kälteeinwirkung ausfallen kann.
7. Verwenden Sie eine kleine Menge Basalmedium, um jede Flasche und jedes Röhrchen zu spülen, und achten Sie darauf, dass alle Komponenten in das Basalmedium übertragen werden.
8. Befestigen Sie den Verschluss auf der Basal Medium-Flasche und schütteln Sie sie vorsichtig, um sie gründlich zu mischen.
9. Verschließen Sie die Flasche mit Paraffinfolie, wickeln Sie sie in Alufolie ein und beschriften Sie sie mit dem Namen, dem Zubereitungsdatum und anderen Details.

12. Herstellung von adipogenen Induktionsdifferenzierungsmedien B für BMSCs

1. Legen Sie das fötale Rinderserum mindestens 6 h in den 4 °C Kühlschrank, bevor Sie es vollständig auftauen.
2. Legen Sie Supplement B (eine Komponente des Kits) in einen 4 °C Kühlschrank, bis es mindestens 30 Minuten lang vollständig aufgetaut ist, bevor Sie es zubereiten.
3. Drehen Sie das Reagenzröhrchen um oder klopfen Sie es vorsichtig ab, um den Inhalt zu mischen.
4. Zentrifugieren Sie das Supplement B-Röhrchen, um das Reagenz am Boden zu konzentrieren und die Entnahme zu erleichtern.
5. Reinigen Sie die Außenverpackung aller Komponenten gründlich mit 75%igem medizinischem Alkohol und öffnen Sie diese in einer Biosicherheitswerkbank.
6. Serum und Supplement B in das Basalmedium geben.
7. Verwenden Sie eine kleine Portion des Basalmediums, um jede Flasche und jedes Röhrchen zu waschen, und stellen Sie sicher, dass alle Komponenten vollständig auf das Medium übertragen werden.
8. Befestigen Sie den Verschluss auf der Basal Medium-Flasche und schütteln Sie sie vorsichtig, um sie gründlich zu mischen.
9. Verschließen Sie die Flasche mit Parafilm, wickeln Sie sie in Alufolie ein und beschriften Sie sie mit dem Namen, dem Zubereitungsdatum und anderen Details.

13. Adipozytendifferenzierung von BMSCs

1. Geben Sie 1 ml 0,1 % Gelatine in eine Platte mit sechs Vertiefungen und schütteln Sie sie, um den Boden jeder Vertiefung gleichmäßig zu beschichten.
2. Legen Sie die mit 0,1 % Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platte für mindestens 30 Minuten in eine sterile Haube oder einen CO₂ -Inkubator.
3. Aspirieren Sie die Gelatine, und die Platte ist bereit für die Zellaussaat, oder warten Sie, bis die Vertiefungen getrocknet sind, bevor Sie nach 30 Minuten säen.
4. Die P3-BMSCs werden mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/^cm2 in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte ausgesät und 2 ml vollständiges Medium in jede Vertiefung gegeben.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem CO₂ -Inkubator mit 5 % CO₂ und gesättigter Luftfeuchtigkeit.
6. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig und fügen Sie 2 ml adipogenes Differenzierungsinduktionsmedium A in jede Vertiefung hinzu, wenn die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen.
7. Nach 3 Tagen Induktion wird Medium A aus den Vertiefungen aspiriert und 2 ml adipogenes Differenzierungsmedium B hinzugefügt.
8. Aspirieren Sie Medium B nach 1 Tag und schalten Sie für die weitere Induktion wieder auf Medium A um.
9. Wechseln Sie zwischen Medium A und B und beobachten Sie die Zellen täglich. Wenn es während der Induktion mit Medium A zu einer Zellkontraktion oder zum Zelltod kommt, wechseln Sie sofort zu Medium B.
10. Wiederholen Sie den Induktions- und Erhaltungsvorgang, bis eine ausreichende Anzahl von Lipidtröpfchen geeigneter Größe erscheint, und bereiten Sie dann die Färbung vor.

14. Färbung von Oil Red O (ORO)

HINWEIS: Führen Sie alle Eingriffe so schonend wie möglich durch, um ein Ablösen der Lipidtröpfchen zu vermeiden.

1. Aspirieren Sie das adipogene Induktionsdifferenzierungsmedium von der 6-Well-Platte, nachdem die adipogene Induktionsdifferenzierung abgeschlossen ist, und waschen Sie es vorsichtig 2–3 Mal mit 1×PBS.
2. Fügen Sie 2 ml 10% neutrales gepuffertes Formalin pro Vertiefung hinzu und fixieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie die Arbeitslösung Oil Red O vor, indem Sie die Brühe von Oil Red O mit destilliertem Wasser im Verhältnis 3:2 mischen. Nach dem Mischen bei 250 × g 4 min zentrifugieren und den Überstand verwenden.
4. Aspirieren Sie das Fixativ und waschen Sie es vorsichtig 2–3 Mal mit PBS, um das Fixiermittel gründlich zu entfernen.
5. 0,8 ml rote O-Fleckenlösung in jede Vertiefung geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
6. Aspirieren Sie die Fleckenlösung, waschen Sie sie zweimal mit 1 mL 75%igem Ethanol.
7. Geben Sie 1 ml Hämatoxylin-Gegenfärbung für 2 Minuten in jede Vertiefung und aspirieren Sie dann.
8. Geben Sie 2 ml PBS in jede Vertiefung und beobachten Sie die Ergebnisse der adipogenen Färbung unter einem Mikroskop.
9. Versiegeln Sie die gebeizte Six-Well-Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei 4 °C.
   HINWEIS: Nicht länger als 1 Woche lagern. Die Lipidtröpfchen können verschmelzen und den Färbezustand verlieren.

Results

Maus-abgeleitete BMSCs wurden isoliert und für etwa 2 Wochen kultiviert, um die BMSCs der dritten Passage (P3) zu erzeugen (Abbildung 3). Wie in Abbildung 3A gezeigt, blieben frisch aus dem Knochenmark extrahierte Zellen mononukleär mit sichtbaren Fetttröpfchen. Spindelförmige Zellen erschienen in der Kulturschale und erreichten am 5^. Kulturtag eine Konfluenz von 60 % bis 80 % (Abbildung 3B

Discussion

Die Stammzelltherapie hat aufgrund ihres Potenzials, die regenerative Medizin zu revolutionieren, großes Interesse geweckt. Präklinische Studien haben substanzielle Belege für die klinische Anwendung von Stammzellen, insbesondere von BMSCs, erbracht¹³. Herausforderungen wie geringe Zellausbeute, Kontamination und langsames Wachstum haben jedoch ihre klinische Anwendung behindert. Daher besteht ein dringender Forschungsbedarf, der sich auf die Standardisierung von ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Spritze (22G Spritzennadel)	FREUNDLICHE GRUPPE(KDL)	60017031
1-stufiges NBT/BCIP	Pierce Biotechnologie, Inc.	34042	Färbung der alkalischen Phosphatase
10% neutrales gepuffertes Formalin	Wexis	5200250	Fixierung von Zellen
6-Well-Platte	Labselect	11110	Zellkultur
24-Well-Platte	Labselect	11310	Zellkultur
40 μ m Cell Sieb	Cornig	352340	Filtration zur Entfernung von Agglomeraten
50 mL Spritze	FREUNDLICHE GRUPPE(KDL)	60017040
75% Ethanol	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	31009001	Desinfizieren Sie die Haut von Mäusen
Alizarin Rot S	Sigma-Aldrich	Nr. A5533	Detektion von Kalkablagerungen und verkalkten Knötchen
APC CD44 Monoklonaler Antikörper (Klon: IM7)	eBiowissenschaften	17-0441-82	Durchflusszytometrie
APC Ratte IgG2b Kappa-Isotyp-Kontrolle (Klon: eB149/10H5)	eBiowissenschaften	17-4031-82	Durchflusszytometrie
Autoklav	Japan Hiryama Unternehmen	HVE-50	Sterilisation chirurgische Instrumente
CO2 Inkubator	Verifizierter Lieferant - Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	300583057	Zellkultur
Cytoflex-Durchflussmessung	Beckman Coulter	Nr. A00-1-1102	Durchflusszytometrie
Dexamethason	Sigma-Aldrich	Nr. D4902	BMSCs osteogene Differenzierung
Schüssel (100mm)	Corning	430167	Zellkultur
Schüssel (60mm)	Corning	430166	Probenplatzierung während der Transplantation
Desinfektionsmittel Wattebällchen	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Desinfizieren Sie die Haut von Mäusen
Sterile Einweghandschuhe	Verifizierter Lieferant - Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd	YT21131	Steriler Betrieb
Doppellöwe Bestrahlte Nagetierdiät	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Tierfutter
Fötales Rinderserum	Shanghai Biosun Sci& Verifizierter Lieferant - Tech Co., Ltd.	Artikel-Nr.: BS-0002-500	Zellkultur
FITC Hamster Anti-Ratte CD29 (Klon: Ha2/5)	BD Biowissenschaften	555003	Durchflusszytometrie
FITC Hamster IgM, λ 1 Isotyp-Kontrolle (Klon:G235-1)	BD Biowissenschaften	553960	Durchflusszytometrie
Gelatine (0,1%)	OriCell	GLT-11301	verbessern die Adhäsionsfähigkeit der Zellen
IVCs Käfig für Mäuse	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Barriere für Tiere
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	Nr. A8960	BMSCs osteogene Differenzierung
Stift markieren	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Markieren Sie die Mobilfunkinformationen auf der Petrischale
MEM Alpha Modifikation (1X)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	SH30265	Zellkultur
Mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus Kit zur adidogenen Differenzierung	Cyagen	MUXMX-90031	BMSCs adipogene Differenzierung
Nikon Eclipse Ti2 Inverses Mikroskop Synstem	Japan Nikon Corporatin	Ti2-U	Beobachten Sie die Zellen und machen Sie Fotos
Ophthalmologische Schere	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Schneiden Sie die Haut
Augenpinzette	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Bioscharf	Gewinnung von Knochengewebe von Mäusen.
PASTEUR-PIPETTE	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-XG-03M	Aspirieren Sie das Kulturmedium
PE Ratte Anti-Maus CD31 (Klon: Ha2/5)	BD Biowissenschaften	553373	Durchflusszytometrie
PE Ratte IgG2a, κ Isotyp-Kontrolle (Klon: R35-95)	BD Biowissenschaften	553930	Durchflusszytometrie
PE-Cyanin7 Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonaler Antikörper (Klon: D7)	eBiowissenschaften	25-5981-82	Durchflusszytometrie
PE-Cyanin7 Ratte IgG2a kappa Isotyp-Kontrolle (Klon: eBR2a)	eBiowissenschaften	25-4321-82	Durchflusszytometrie
Penicillin-Streptomycin	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	2585636	Zellkultur
PerCP-Cy5.5 Ratte Anti-Maus CD45 (Klon: Ha2/5)	BD Biowissenschaften	561869	Durchflusszytometrie
PerCP-Cy5.5 Ratten-IgG2b und Kappa; Isotyp-Kontrolle (Klon:A95-1)	BD Biowissenschaften	550764	Durchflusszytometrie
Skalpelle	Fabrik für chirurgische Instrumente oShanghai Medical Devices? Gruppe?Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Isolieren Sie die hinteren Gliedmaßen und den Rumpf der Maus und entfernen Sie Fremdgewebe aus dem Knochen
Sterile Haube	Verifizierter Lieferant - Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0,9	Chirurgischer Operationstisch
sterile OP-Abdecktücher	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160900	Stellen Sie einen sterilen Operationsbereich zur Verfügung
Röhrchen (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Lagern Sie die gefilterte Zelllösung
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	adhärente Zellen zu verdauen
β-Glycerophosphat	Sigma-Aldrich	Nr. G5422	BMSCs osteogene Differenzierung