Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur mikrochirurgischen Transplantation einer magnetischen Perle in das sich entwickelnde Zebrafischherz, das die Manipulation mechanischer Kräfte in vivo ermöglicht und einen mechanisch stimulusabhängigen Kalziumeinstrom in Endokardzellen auslöst.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanische Kräfte geben kontinuierlich Rückmeldung an morphogenetische Programme der Herzklappe. Beim Zebrafisch beruht die Entwicklung der Herzklappe auf der Herzkontraktion und den physikalischen Reizen, die vom schlagenden Herzen erzeugt werden. Die intrakardiale Hämodynamik, die durch den Blutfluss angetrieben wird, ist eine grundlegende Information, die die Entwicklung des embryonalen Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine effektive Methode, um mechanische Kräfte in vivo zu manipulieren, indem eine magnetische Kugel mit einem Durchmesser von 30 μm bis 60 μm in das Herzlumen transplantiert wird. Das Einbringen der Perle erfolgt mikrochirurgisch in anästhesierte Larven, ohne die Herzfunktion zu stören und ermöglicht eine künstliche Veränderung der Randbedingungen, wodurch die Strömungskräfte im System verändert werden. Infolgedessen verstärkt das Vorhandensein der Kugel die mechanischen Kräfte, denen die Endokardzellen ausgesetzt sind, und kann direkt einen mechanisch reizabhängigen Kalziumeinstrom auslösen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Mechanotransduktionswegen, die die Herzentwicklung steuern, und kann Einblicke in die Rolle mechanischer Kräfte bei der Morphogenese der Herzklappe geben.
Einleitung
Seit seiner Einführung in den späten 1970er Jahren1 hat sich der Zebrafisch (Danio rerio) zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Untersuchung der Feinheiten der Herzentwicklung und angeborener Herzfehler entwickelt. Im Gegensatz zu den meisten Wirbeltieren, einschließlich Maus- und Kükenembryonen, die auf ein funktionierendes Herz-Kreislauf-System angewiesen sind und frühe Herzfehler nicht überleben können, bieten Zebrafische einen einzigartigen Vorteil, indem sie die Untersuchung schwerer Herzphänotypen ermöglichen. Dies ist auf ihre geringe Größe zurückzuführen, die durch passive Diffusion eine ausreichende Sauerstoffversorgung ermöglicht und ein Überleben auch ohne Herzkontraktion und aktive Durchblutung ermöglicht 2,3,4. Zu den vielen wichtigen Merkmalen des Zebrafisches gehört auch die optische Transparenz seiner Embryonen, die eine nicht-invasive Überwachung des sich entwickelnden Herzens ermöglicht 5,6,7,8.
Mechanische Kräfte geben kontinuierlich Rückmeldung an die morphogenetischen Programme der Herzklappe 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , und ein abweichender Blutfluss ist weithin als gemeinsamer Faktor bei verschiedenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen anerkannt23,24. Beim Zebrafisch beruht die Entwicklung der Herzklappe auf der Herzkontraktion und den mechanischen Kräften, die vom schlagenden Herzen erzeugt werden. Mehrere Zebrafisch-Mutanten haben die Bedeutung von herzerzeugten mechanischen Reizen für die Valvulogese gezeigt. Bemerkenswert ist, dass das völlige Fehlen einer Herzkontraktion und folglich eines Blutflusses aufgrund von Mutationen des kardialen Troponins T (tnnt2) in Mutanten des stillen Herzens (sih) in frühen morphogenetischen Stadien zum Fehlen von Gewebekonvergenz und endokardialer Zell-Clusterbildung (EdC) führt25.
Die intrakardiale Hämodynamik und die mechanischen Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, erweisen sich als grundlegende epigenetische Komponenten, die die Entwicklung des embryonalen Herzens des Zebrafisches prägen. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die richtige kardiale Morphogenese beim Zebrafisch ausgeprägte Strömungsreize erfordert, und Abweichungen von diesen physiologischen Mustern führen zu Herzklappenfehlern 10,13,14,22,26. Hier beschreiben wir eine effektive Methode, adaptiert von Fukui et al.13, um mechanische Kräfte in vivo zu manipulieren, indem eine magnetische Perle mit einem Durchmesser von 30 μm bis 60 μm in das sich entwickelnde schlagende Herz des Zebrafisches transplantiert wird. Bei der Technik wird mikrochirurgisch eine Perle in das Herzlumen von anästhesierten Larven eingeführt, ohne die Herzfunktion zu beeinträchtigen. Das Vorhandensein der Kügelchen führt zu einer Verstärkung der mechanischen Kräfte, die EdCs erfahren, und löst direkt einen mechanisch reizabhängigen Kalziumeinstrom aus13. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Mechanotransduktionswegen, die die Morphogenese des Herzens regulieren, und bietet die Möglichkeit, unser Verständnis der Rolle mechanischer Kräfte bei der Klappenbildung zu vertiefen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischembryonen entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und den Richtlinien des Innenministeriums im Rahmen der Projektlizenz PP6020928.
1. Gewinnung von Zebrafischembryonen für die Perlentransplantation
- Überqueren Sie die entsprechende Zebrafischlinie und züchten Sie die Embryonen in Danieaus Medium bei 28,5 °C. Nähere Hinweise zum Überqueren von Zebrafischlinien finden Sie in der JoVE Science Education Database27.
- Behandeln Sie die Embryonen ab 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU), um die Pigmentbildung zu hemmen, mit einer Konzentration von 0,003 % PTU in Danieaus Medium.
- Wenn Sie eine fluoreszenzmarkierte Linie verwenden, untersuchen Sie die Embryonen unter einem Fluoreszenzstereoskop, bevor Sie mit der Perltransplantation beginnen, und wählen Sie 10-20 gesunde Embryonen aus, die eine helle Fluoreszenz aufweisen. Dechorionieren Sie die vorselektierten Embryonen vorsichtig unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht beschädigt werden.
2. Einbettung von Zebrafischembryonen
- Bereiten Sie 20 ml Danieau-Medium mit 0,02 % Tricain vor.
- Bereiten Sie 2 ml-Aliquots von 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) mit 0,02 % Tricain in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Legen Sie die Rohre in einen 38 °C heißen Block, um die LMP-Agarose in einem flüssigen Zustand zu halten.
HINWEIS: Die 1% LMP Agarose kann im Voraus für die Verwendung am Tag der Montage und Raupentransplantation vorbereitet werden. - Übertragen Sie 3-6 dechorionierte Embryonen in eine Petrischale, die Danieau-Medium enthält, das mit 0,02 % Tricain ergänzt ist.
- Wenn die Embryonen betäubt sind, übertragen Sie sie in eine 35 mm x 15 mm große Glasbodenschale mit minimalem Medium. Fügen Sie schnell 300-400 μl 1 % LMP Agarose, die Tricain enthält, hinzu, um eine Kuppel zu erzeugen. Positionieren Sie die Embryonen mit einer Pinzette so, dass sie gerade liegen, in Kontakt mit dem Glas, mit der Bauchseite nach oben, wie in Abbildung 1 gezeigt. Warten Sie ~4 Minuten, bis sich die Agarose verfestigt hat.
HINWEIS: Die Menge an Agarose, die für die Aufzucht von Embryonen verwendet wird, ist sehr wichtig. Streben Sie eine Kuppel von etwa 350 μl an, die eine ausreichende Abdeckung bieten und gleichzeitig einige Millimeter Platz über den Embryonen lassen sollte. Für Anfänger kann es sicherer sein, eine kleinere Anzahl von Embryonen auf einmal zu montieren.
3. Bead-Transplantation
- Sobald die Agarose verfestigt ist, lagern Sie etwa 0,5 μl magnetische Kügelchen darauf ab.
HINWEIS: Verwenden Sie eine 10-μl-Pipettenspitze, um die magnetischen Kügelchen zu übertragen. Eine genaue Messung von 0,5 μl ist nicht erforderlich, da die Kügelchen in der Suspension hoch konzentriert sind. Es reicht aus, die Spitze nach dem Herunterdrehen einfach in das Fläschchen einzuführen, um eine ausreichende Menge an Kügelchen zu sammeln. - Geben Sie einen Tropfen Danieau's Medium mit 0,02 % Tricain auf die Agarose und die Kügelchen.
- Wählen Sie die entsprechende Sicke aus.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig. Die Größe der Kügelchen kann leicht variieren und reicht von 30 μm bis 60 μm Durchmesser, daher ist die Auswahl der geeigneten Perle mit dem Auge, basierend auf der Probe und der Herzgröße, unerlässlich. - Sobald die geeignete Perle ausgewählt ist, legen Sie sie mit einer Pinzette auf das Eigelb (Abbildung 2A und Video 1).
- Erzeugen Sie mit einem Arm der Pinzette eine Dotterläsion oder ein "Loch" in der Mitte des Dotters (Abbildung 2B und Video 2).
HINWEIS: Die Tiefe der Läsion sollte nicht zu tief in das Eigelb eindringen; Sie sollte sich in etwa auf Höhe der Kardinalvene befinden. Der Durchmesser des erzeugten Lochs entspricht der Spitze des Pinzettenarms. Stellen Sie sicher, dass die Läsion im Eigelb gebildet wird, und vermeiden Sie den Kontakt mit den Kardinalvenen, indem Sie unter sie zielen. Eine kleine Menge Eigelb tritt normalerweise aus, wenn das Loch entsteht. - Setzen Sie die Perle in die in Schritt 3.5 entstandene Läsion ein und schieben Sie sie vorsichtig nach vorne, bis sie den Venenpol erreicht. Dort erzeugen die Herzkontraktionen einen Sog, der die Perle in das Herzlumen zieht (Abbildung 2 und Video 2).
HINWEIS: Die Venenwand wird während des Einführens der Perle durchbrochen, und die hohe Dichte des Eigelbs hilft, ausgedehnte Blutungen zu minimieren. Die Dotterläsion heilt in der Regel innerhalb weniger Minuten nach dem Einsetzen der Beads ab. Einige Embryonen können 20-24 Stunden nach der Perlentransplantation ein Perikardödem aufweisen.
4. Entnahme von Zebrafischembryonen
- Nachdem Sie magnetische Kügelchen in alle montierten Embryonen transplantiert haben, geben Sie 1-2 ml Danieau's Medium, das PTU enthält, in die Glasbodenschale.
- Brechen Sie die LMP-Agarose vorsichtig mit einer Pinzette und entfernen Sie den Fisch vorsichtig, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Agarose auf ihm zurückbleibt.
- Übertragen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette in eine neue Petrischale, die Danieaus Medium mit PTU enthält, und lassen Sie sie sich bei 28,5 °C erholen und entwickeln.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Beispiele für eine erfolgreiche Bead-Transplantation sind in Abbildung 3, Video 3 und Video 4 dargestellt. Die magnetische Perle war korrekt im Vorhof des Zebrafischherzens positioniert, was einen ungehinderten Blutfluss und keine beobachtete Blutung ermöglichte. Darüber hinaus behielten die Herzwände ihre strukturelle Integrität bei, ohne einzustürzen (Abbildung 3 und Video 3). Nach 24 Stunden zeigte der Embryo...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Kritische Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung
Einbettung von Zebrafischembryonen
Die Menge an Agarose, die für die Montage der Embryonen verwendet wird, ist wichtig. Die gebildete Kuppel sollte nicht zu groß sein, da dies die Manipulation der Perle von der Oberfläche zu den Embryonen behindern kann. Umgekehrt sollte es nicht zu klein sein; Mehrere Kügelchen auf der Agarose, die nahe an...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des Vermot-Labors für die Diskussionen und Kommentare zum Protokoll. Wir danken allen Mitarbeitern der Fischanlage des Imperial College London. Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert: GA N°682939, Additional Ventures (Fördernummer 1019496), das MRC (MR/X019837/1) und das BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P wurde durch ein Stipendium des Bioengineering Department (Imperial College London) unterstützt. HF wurde unterstützt von der JSPS KAKENHI (23H04726 und 24K02207), dem JST FOREST-Programm (23719210), der Uehara Memorial Foundation, der Cell Science Research Foundation, der Takeda Medical Research Foundation und der Novartis Research Foundation.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Unverzichtbare Ausrüstung für die Aufzucht, Zucht und Entnahme | |||
| Glasbodenschale (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Heizblock | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Juwelier Pinzette | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont Nr. 5, L 4 1/4 Zoll, |
| Mikrozentrifugenröhrchen aus | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteurpipette | |||
| Petrischale | |||
| Stereomikroskop | |||
| Reagenzien | |||
| 4 mg/ml Tricain-Stammlösung | |||
| Danieau's Medium (60x Stammlösung) | |||
| PureCube Glutathion MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-Phenyl-2-thioharnstoff) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau's Medium (60x Stammlösung)34,8 | |||
| g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2 & Middot; 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9,78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Die Inhaltsstoffe in H2O auf ein Endvolumen von 2 l auflösen. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 einstellen und dann autoklavieren. | |||
| 4 mg/ml Tricain-Stammlösung | |||
| (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat-Salz) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL doppelt destilliertes H2O | |||
| 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein, aliquotieren Sie ihn und lagern Sie ihn bei -20 μC. |
Referenzen
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
- Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
- Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
- Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
- Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
- Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
- Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
- Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
- Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
- Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
- Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
- Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
- da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
- Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
- Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
- Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
