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Strukturbiologie und analytische Chemie: Ansätze zur Charakterisierung von C-Glykosid-Stoffwechselenzymen in der menschlichen Darmmikrobiota

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DOI:

10.3791/67629

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23. Mai 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Jüngste Studien unterstreichen die Rolle der Enzyme der menschlichen Darmmikrobiota bei der Verstoffwechselung von C-Glykosiden. In dieser Arbeit stellen wir eine umfassende Methodik vor, die Techniken der analytischen Chemie (LC-MS/MS und NMR) mit strukturbiologischen Ansätzen integriert, um die strukturellen und enzymatischen Reaktionsketten dieser C-Glykosid-metabolisierenden Enzyme systematisch zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Darmmikrobiota hat sich zu einem wichtigen Modulator für die Gesundheit des Wirts entwickelt, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit, Glykoside aus der Nahrung zu metabolisieren. Während C-Glykoside im Vergleich zu O-Glykoside eine überlegene chemische Stabilität und Resistenz gegen enzymatische Spaltung aufweisen, können spezialisierte Darmbakterien sie selektiv metabolisieren und so ihre Bioverfügbarkeit verbessern. Seit der Identifizierung mikrobieller C-Glykosidase-Enzyme sind die genauen Reaktionsmechanismen noch unvollständig verstanden, und standardisierte Methoden zur Untersuchung dieser Prozesse sind noch nicht gut etabliert. Um diese Lücke zu schließen, haben wir einen integrierten multidisziplinären Ansatz eingeführt, der Strukturbiologie, Enzymologie und analytische Techniken, einschließlich Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und Kernspinresonanz (NMR), kombiniert, um diese enzymatischen Aktivitäten systematisch zu charakterisieren. Dieser umfassende Ansatz ermöglicht eine präzise Charakterisierung des C-Glykosid-Metabolismus auf molekularer, enzymatischer und metabolischer Ebene.

Einleitung

In jüngster Zeit hat die menschliche Darmmikrobiota aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Unterstützung der Gesundheit des Wirts erhebliche Aufmerksamkeit erregt 1,2. Diese mikrobiellen Gemeinschaften metabolisieren vom Wirt stammende Verbindungen und produzieren biologisch aktive Metaboliten 1,2,3. Zum Beispiel existieren Flavonoide, die zu den am häufigsten vorkommenden natürlichen Verbindungen in unserer täglichen Ernährung gehören, hauptsächlich als O- oder C-Glykoside, die selbst im menschlichen Darm schlecht aufgenommen werden4. Die Darmmikrobiota kann diese Glykoside jedoch in bioaktivere Derivate wie sekundäre Glykoside oder Aglykone umwandeln, wodurch ihre Löslichkeit verringert und ihre Absorption verbessert wird, wodurch ihre Bioaktivität im Vergleich zu ihren nativen Formen verbessertwird 5,6.

In der Vergangenheit wurden die Hydrolysemechanismen von O-Glykoside ausführlich untersucht 7,8. Die C-Glykoside, die sich durch ihre C-C-glykosidischen Bindungen auszeichnen, weisen eine höhere chemische Stabilität und Spaltungsbeständigkeitauf 9,10. Trotzdem haben bestimmte Darmbakterien die Fähigkeit entwickelt, C-Glykoside zu deglykosylieren11,12. Im Jahr 1988 zeigten Hattori et al. erstmals, dass einige Darmbakterien Glykosylgruppen aus C-Glykosiden entfernen können13. Nachfolgende Studien isolierten den ersten Bakterienstamm, der zu dieser Aktivität fähig war, was eine weitere Erforschung der C-Glykosid-Spaltmechanismen ermöglichte14. Bisher wurde jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Darmbakterienstämmen und C-Glykosid-metabolisierenden Enzymen identifiziert und charakterisiert 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Deglykosylierungsenzyme Puerarin (Daidzein-8-C-Glucosid) (DgpA/B/C) im PUE-Stamm in der Lage sind, Puerarin durch einen zweistufigen Prozess in Daidzein und Glukose zu spalten: DgpA, eine Oxidoreduktase der Gfo/Idh/MocA-Familie, oxidiert Puerarin zu 3''-Oxo-Puerarin, das dann eine β-Eliminationsreaktion durchläuft, die durch den DgpB/C-Komplex vermittelt wird, um das Aglykon und die Glukose10 zu erhalten. 26. Urheberrecht Dennoch sind die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von C-Glykosid-metabolisierenden Enzymen, insbesondere des DGPA/B/C-Systems, nach wie vor unvollständig verstanden, und es besteht ein Bedarf an fortschrittlicheren Methoden, insbesondere der Integration biologischer und chemischer Strategien, um die Forschung auf diesem Gebiet voranzutreiben24.

Um diese Lücke zu schließen, verwenden wir integrierte multidisziplinäre Ansätze, um die DgpA/B/C-katalysierte Stoffwechselreaktion der menschlichen Darmmikrobiota zu untersuchen. Bei dieser Reaktion katalysiert DgpA die Glykosyloxidation von C-Glykosiden, woraufhin DgpB und DgpC einen DgpB/C-Komplex bilden, der die oxidierten C-Glykosidprodukte spezifisch spaltet 10,26,27. Wir führten zunächst die rekombinante Expression und Reinigung von DgpA und DgpB/C getrennt durch. Anschließend wurden die gereinigten DgpA- und DgpB/C-Proteine kristallisiert und ihre dreidimensionalen Strukturen mittels Röntgenkristallographie bestimmt. Schließlich rekonstituierten wir die C-Glykosid-Spaltungsfunktion unter Verwendung des vollständigen DgpA/B/C-Enzymsystems mit einer umfassenden Stoffwechselproduktanalyse, die mittels gekoppelter LC-MS/MS und NMR-Spektroskopiedurchgeführt wurde 27. Basierend auf diesen Ansätzen haben wir den C-Glykosid-Metabolismus untersucht, der durch das DgpA/B/C-Enzymsystem katalysiert wird.

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Protokoll

1. Proteinproduktion und -reinigung

  1. Konstruktion eines Expressionsvektors
    HINWEIS: In dieser Studie dienen die Gene DgpA, DgpB und DgpC aus der menschlichen Darmmikrobiota, dem PUE-Stamm , als Modellsystem. Im ersten Schritt werden mit Hilfe von Expressionsplasmiden die entsprechenden rekombinanten Proteine hergestellt.
    1. Beziehen Sie die DGPA/B/C-Gencluster-Sequenz (GenBank: LC422372.1) vom NCBI. Anschließend wird die DgpA/B/C-DNA kommerziell synthetisiert und die DgpA-, DgpB- und DgpC-Gene einzeln in einen modifizierten pET-28a-Vektor kloniert, der das Zielprotein mit dem N-terminalen SUMO und dem 6×His-Tag (His-SUMO-Tag)28 produziert.
    2. Transformieren Sie jedes der DgpA-, DgpB- oder DgpC-Plasmide in E . coli BL21 (DE3) kompetente Zellen. Anschließend werden Bakterien in LB-Medium mit 50 μg/mL Kanamycin bei 37 °C kultiviert.
    3. Geben Sie 0,2 mM IPTG in das Medium, wenn die Bakteriendichte (OD600) 0,6 erreicht. Kultivieren Sie die Bakterien 16 h lang bei 16 °C.
    4. Zentrifugieren Sie jeweils die exprimierende Bakterienkultur DgpA, DgpB und DgpC bei 4.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml Puffer A (Tabelle 1) pro 1 l Bakterienkultur.
  2. Reinigung von Protein
    HINWEIS: Hochreine, ausreichende Mengen an rekombinanten Enzymen sind für die funktionelle Charakterisierung und strukturbiologische Studien unerlässlich. DgpB und DgpC bilden einen stabilen Proteinkomplex (bilden während des Lysevorgangs spontan einen DgpB/C-Komplex) für die Funktionalität 10,26. Anschließend wird die Aufreinigung des DgpA-Proteins und des DgpB/C-Komplexes durchgeführt.
    1. Fügen Sie 1 mM PMSF zur bakteriellen Resuspension hinzu. Mischen Sie die DgpB- und DgpC-Bakteriensuspension aus Schritt 1.1.4 miteinander und lysieren Sie dann die DgpA-Bakteriensuspension oder das DgpB- und DgpC-Gemisch (um einen funktionellen DgpB/C-Komplex zu bilden) mit einem Ultraschall-Zelldisruptor.
    2. Das Bakterienlysat bei 48.000 x g für 40 min bei 4 °C zentrifugieren. Behalten Sie den Überstand mit dem Protein zurück und entsorgen Sie das Bakterienpellet.
    3. Reinigen Sie den DgpA- oder DgpB/C-Komplex aus dem Überstand mit einer Säule für die Nickel-Affinitätschromatographie (Ni-NTA). Eluieren Sie die gebundenen Proteine durch Anlegen eines Imidazol-Konzentrationsgradienten von 0 - 50 % mit Puffer A und Puffer B (Tabelle 1) im ÄKTA-Reiniger.
    4. Nehmen Sie 10 μl eluierte Proben und mischen Sie sie mit 2 μl 5 × Proteinfarbstoff, führen Sie dann eine SDS-PAGE-Elektrophorese bei 220 V für 45 Minuten mit einem vertikalen Elektrophoresesystem durch, gefolgt von einer Coomassie Blue-Färbung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Sammeln Sie Fraktionen, die DgpA oder den DgpB/C-Komplex enthalten, basierend auf der SDS-PAGE-Analyse für die zukünftige Verwendung.
      HINWEIS: Der DgpA (44 kDa) mit einem His-SUMO-Tag-Band (17 kDa) migriert mit etwa 61 kDa (Abbildung 2D), während DgpC (33 kDa) mit einem His-SUMO-Tag (17 kDa) um etwa 50 kDa und DgpB (15 kDa) mit einem His-SUMO-Tag (17 kDa) um etwa 33 kDa migriert (Abbildung 2J).
    5. Dialysieren Sie die Proben des DgpA- oder DgpB/C-Komplexes aus Schritt 1.2.3 unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff-Gehalt von 10 kDa gegen Puffer C, um Imidazol zu entfernen, und mit der Ubiquitin-ähnlichen Protease 1 (ULP1; Tabelle der Materialien) Enzym zur Entfernung des His-SUMO-Tags29.
    6. Laden Sie die dialysierte Proteinprobe in Puffer C (Tabelle 1) durch die Ionenaustauschchromatographie-Säule (Q-Säule). Dann eluiert das gebundene Protein aus der Säule unter Verwendung eines Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten im Bereich von 100 mM bis 600 mM, hergestellt mit Puffer C und Puffer D (Tabelle 1) im ÄKTA-Reiniger.
    7. Die SDS-PAGE-Analyse des DgpA- und DgpB/C-Komplexes, der wie Schritt 1.2.3 aus der Q-Spalte eluiert wurde, wird unter Angabe der Molekulargewichte durchgeführt: His-SUMO-Tag (17 kDa), DgpA (44 kDa), oligomere Banden von DgpA (über 95 kDa) (Abbildung 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), oligomere Banden von DgpB und DgpC (zwischen 53 kDa und 95 kDa) (Abbildung 2K).
    8. Aufreinigung des Proteins mit einer Größenausschlusssäule (SEC) mit Puffer E (Tabelle 1). Führen Sie eine SDS-PAGE-Analyse mit Proteinen aus der Elutionsfraktion durch, gefolgt von einer Coomassie Blue-Färbung, um Proteinbanden sichtbar zu machen. Sammeln Sie die Fraktionen, die das Zielprotein DgpA oder DgpB/C-Komplex nach der Analyse mit SDS-PAGE enthalten.
      HINWEIS: Die DgpA-Bande liegt bei etwa 44 kDa mit oligomerisierter DgpA-Bande über 95 kDa (Abbildung 2F), während DgpC bei etwa 33 kDa und DgpB bei etwa 15 kDa mit oligomerisiertem DgpB und DgpC (zwischen 53 kDa und 95 kDa) liegt (Abbildung 2L).
    9. Messen Sie die Proteinkonzentration von DgpA oder DgpB/C-Komplex mit einem Nanotropfen bei 280 nm. Konzentrieren Sie dann den DgpA- oder DgpB/C-Komplex mit Ultrafiltrationsröhrchen auf etwa 20 mg/ml, aliquotieren Sie sie und frieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff schockein. Lagern Sie DgpA oder DgpB/C-Komplex bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
  3. Datenerfassung des Zirkulardichroismus (CD)-Spektrums
    HINWEIS: Da die durch DgpA katalysierte Glykosyloxidation als entscheidender Initiationsschritt im Stoffwechselweg dient, wurde die CD-Spektroskopie speziell eingesetzt, um sowohl den korrekten Faltungszustand als auch die sekundäre strukturelle Integrität von DgpA zu überprüfen. Diese strukturellen Parameter sind sowohl für die enzymatische Aktivität als auch für die erfolgreiche Proteinkristallisation von entscheidender Bedeutung.
    1. Verdünnen Sie das DgpA-Protein auf 0,2 mg/ml mit 1 x PBS-Puffer (pH 7,4) (Tabelle 1).
    2. Laden Sie 1x PBS-Puffer (pH 7,4) in eine Quarzküvette und zeichnen Sie das CD-Basisspektrum über 200 - 260 nm mit einem CD-Spektrometer auf, um Unterschiede in der Sekundärstruktur und im Faltungszustand empfindlich zu detektieren27.
    3. Ersetzen Sie die Pufferküvette durch Proteinproben aus 1.3.1, zeichnen Sie das CD-Spektrum über 200 - 260 nm auf und subtrahieren Sie die Pufferbasislinie, um das CD-Spektrum für die Proteinprobe zu erhalten.
    4. Sammeln Sie drei Scans für die Genauigkeit und analysieren Sie die Daten auf Sekundärstrukturmerkmale und den Faltungszustand des Proteins (Abbildung 3G, 3H).

2. Proteinkristallographie und Strukturbestimmung

ANMERKUNG: Nach der Bestätigung, dass DgpA eine korrekte Faltung und strukturelle Integrität beibehält, wurden strukturbiologische Ansätze verwendet, um die dreidimensionalen Strukturen beider DgpA zu bestimmen. Da die katalytische Kompetenz des DgpB/C-Komplexes durch frühere funktionelle Assays 10,26,27 biochemisch bestätigt worden war, entfiel der Schritt der spektralen CD-Verifizierung.

  1. Wachstum und Optimierung von Proteinkristallen
    1. Mischen Sie 0,5 μl gereinigtes DgpA (20 mg/ml) oder DgpB/C-Komplex (20 mg/ml) mit einem gleichen Volumen (0,5 μl) Reservoirlösung aus Kristallisationskits auf 48-Well-Kristallplatten in einer Sitz-Tropfen-Methode30. Übertragen Sie die Kristallplatten auf 16 °C für das Kristallwachstum.
      HINWEIS: Beobachten Sie diese sitzenden Tropfen mit einem Mikroskop, um die Bedingungen (einschließlich Proteinkonzentration und Fällungsmittel wie PEG 3350, Magnesiumformiat usw.) für das Wachstum von DgpA- oder DgpB/C-Komplexkristallen zu identifizieren.
    2. Durchführung einer Kristallisationsoptimierung sowohl für DgpA als auch für den DgpB/C-Komplex unter Verwendung des Hanging-Drop-Dampfdiffusionsverfahrens30.
    3. Beginnen Sie für DgpA mit der in Schritt 2.1.1 identifizierten Bedingung (20 mM Magnesiumformiat, 20 % PEG3350) und wenden Sie einen orthogonalen Optimierungsansatz an, indem Sie sechs PEG3350 Konzentrationsgradienten (17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 % und 22 %) gegen vier Magnesiumformiat-Konzentrationsgradienten (16 mM, 18 mM, 20 mM und 22 mM) testen30.
    4. Bereiten Sie Kristallisationstropfen vor, indem Sie 0,8 μl DgpA-Proteinlösung (10 oder 20 mg/ml) mit 0,8 μl Reservoirlösung auf silanisierten Glasdeckgläsern mischen. Dann werden die Deckgläser über 24-Well-Kristallisationsplatten invertiert und bei 16 °C für das Kristallwachstum inkubiert.
    5. Für die Optimierung des DgpB/C-Komplexes verfolgen Sie den gleichen Ansatz: Mischen Sie 0,8 μl Proteinkomplex (10 oder 20 mg/ml) mit 0,8 μl Reservoirlösung, die Magnesiumacetat (16, 18, 20 oder 22 mM) und PEG 8000 (8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 % oder 13 %) enthält. Platzieren Sie auf ähnliche Weise hängende Tropfen auf silanisierten Deckgläsern über 24-Well-Platten und inkubieren Sie bei 16 °C.
    6. Lassen Sie die Proteinkristalle des DgpA- und DgpB/C-Komplexes bis zur vollen Größe wachsen, bis sie aufhören zu wachsen, und überführen Sie die Kristalle dann für 30 Minuten in eine Einweichlösung, die Reservoirpuffer und 5 mM der Substratverbindungen (Glukose und Puerarin) des DgpA- und DgpB/C-Komplexes bei 16 °C enthält.
    7. Übertragen Sie die Kristalle, einschließlich DgpA (mit Glukose oder substratfrei) und DgpB/C-Komplex (substratfrei), in eine Kryoprotektivlösung, die den Einweichpufferzustand enthält, ergänzt mit 25 % Glycerin, und lagern Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff zur Datenerfassung.
      HINWEIS: Obwohl sowohl DgpA- als auch die DgpB/C-Komplexkristalle mit Substraten (Glukose und Puerarin) getränkt wurden, wurde nur Glukose erfolgreich in das katalytische Zentrum von DgpA eingebaut. Folglich wurden drei verschiedene Kristallformen für die Strukturanalyse erhalten: DgpA mit Glukose (Abbildung 3E); substratfreies DgpA (Abbildung 3B-C); und substratfreier DgpB/C-Komplex (Abbildung 3D). Die Kryoprotektivlösung schützt Proteinkristalle, indem sie die Eisbildung während der Kurzkühlung in flüssigem Stickstoff verhindert, wodurch ihre strukturelle Integrität erhalten bleibt und strahleninduzierte Schäden minimiert werden. Die Lösung, die typischerweise unter Verwendung der Mutterlauge als Basis formuliert wird, wird mit optimierten Konzentrationen von Kryoprotektiva (z. B. Glycerin oder Ethylenglykol) ergänzt.
  2. Datenerhebung und Strukturbestimmung
    1. Sammeln Sie die Röntgenbeugungsdaten des Kristalls für DgpA mit Glukose oder in substratfreier Form und den DgpB/C-Komplex in substratfreier Form an der Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) der Shanghai National Protein Science Facility (NFPS) mit einer einfallenden Wellenlänge von 0,978 Å.
    2. Verarbeiten Sie die drei Sätze von Röntgenbeugungsdaten, einschließlich DgpA und DgpB/C-Komplex, unter Verwendung einer kristallographischen Datenverarbeitungssoftware31. Laden Sie zunächst die Rohdaten und führen Sie dann nacheinander die Index-, Integrations- und Skalierungsfunktionen aus, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der Software klicken. Erzeugen Sie eine verarbeitete Ausgabedatei (output.sca), die für die spätere Strukturbestimmung geeignet ist.
    3. Bestimmen Sie die Strukturen von DgpA mit Glukose oder in substratfreier Form (Abbildung 3B-C, 3E) und des DgpB/C-Komplexes in substratfreier Form (Abbildung 3D) unter Verwendung der molekularen Substitutionsmethode (Tabelle der Materialien). Und dann verfeinern Sie die Strukturen und Elektronenkarten, indem Sie relevante Liganden (wie Glukose, Mn2+, H2O usw.) einbeziehen.31. Urheberrecht

3. Überwachung der Reaktionsaktivität und Bestimmung der kinetischen Parameter

HINWEIS: Das DGPA/B/C-System vermittelt C-Glykosid-Umwandlungen durch eine definierte zweistufige Kaskade: DgpA initiiert die Katalyse durch Oxidation der Zuckereinheit, wodurch ein Zwischenprodukt erzeugt wird, das der DgpB/C-Komplex anschließend spaltet oder isomerisiert 10,26,27. In dieser Studie bezieht sich DgpA/B/C auf die Enzyme, die für diese Reaktionskaskade verantwortlich sind, wobei zu beachten ist, dass keine direkte Wechselwirkung zwischen DgpA und dem DgpB/C-Komplex stattfindet. Diese gekoppelte Aktivität kann mit drei komplementären Ansätzen rigoros quantifiziert werden: HPLC-Produktanalyse, DCPIP-gekoppelte spektrophotometrische Assays zur Überwachung des Elektronentransfers oder detaillierte kinetische Charakterisierung der Reaktionsparameter27,32. Konkret wurden die durch DgpA/B/C-Katalyse erzeugten C-Glykosid-Spaltprodukte (Daidzein) mittels HPLC analysiert (UV-Detektion bei 265 nm). Die Produktbildung wurde unter Verwendung einer Standardkalibrierkurve quantifiziert (das Verfahren zur Ermittlung der Standardkurve ist in der Anmerkung unter Schritt 3.3.2 ausführlich beschrieben), und die kinetischen Parameter wurden durch Anpassung der Produktbildungsraten an das Michaelis-Menten-Modell durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt27,32. Der Inhibitionsassay, der die Wirkung von Glukose auf die Spaltung der puerarin C-glykosidischen Bindung misst, lieferte einen bestätigenden Beweis dafür, dass Saccharide als Substrate für DgpA dienen können. Anschließend überwacht der DCPIP-Assay die Zuckeroxidationsreaktionen, indem er die Reduktion von blauem 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP) zu farblosem Leuko-DCPIP misst, da es Elektronen von oxidierten Zuckern33 aufnimmt und dadurch die katalytische Aktivität von DgpA widerspiegelt.

  1. Überwachung der DGPA/B/C-Aktivität mittels HPLC
    1. Die DgpA/B/C-katalysierte C-Glykosid-Spaltungs- oder Isomerisierungsreaktion wird in 500 μl Puffer F (Tabelle 1) durchgeführt, der 20 μM DgpA und DgpB/C-Komplex (aus Schritt 1.2.7) und 0,1 mM entweder Puerarin oder Genistein-8-C-Glucosid für Spaltungsreaktionen oder Daidzin oder Genistin für Isomerisierungsreaktionenenthält 27. Die Reaktionen werden 8 h lang bei 37 °C durchgeführt und durch Zugabe von 1,5 mL Methanol zum Reaktionsgemisch beendet.
    2. Die Reaktionslösung wird bei 16.000 × g für 15 min zentrifugiert, um den Proteinniederschlag zu entfernen, der durch die Methanol-induzierte Enzymdenaturierung gebildet wurde. Filtrieren Sie den Überstand mit einer 0,22 μm Filtermembran.
    3. Führen Sie eine HPLC-Analyse mit Gradientenelution bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einem Injektionsvolumen von 10 μl und einer Detektionswellenlänge von UV 265 nm durch.
      HINWEIS: Bei den mobilen Phasen handelte es sich um Acetonitril (Mobile Phase A) und 0,1 % wässrige Essigsäure (Mobile Phase B) mit Gradientenelution. Der Gradient der Elution der mobilen Phase ist wie folgt: 5%-20% A bei 0-5 min, 20%-45% A bei 5-15 min, 45%-52% A bei 15-18 min, 52%-55% A bei 18-19 min, 55%-5% A bei 19-21 min und 5% A bei 21-23 min. Das DGPA/B/C-Enzymsystem weist gegenüber Substraten wie Daidzin und Genistin deutlich unterschiedliche katalytische Wirkungsgrade auf, was zu erheblichen Schwankungen in ihren jeweiligen Produktbildungsraten führt. Um die Kinetik der Substratumwandlung und die Dynamik der Produktakkumulation quantitativ zu beurteilen, wurde eine umfassende Zeitverlaufsanalyse mittels HPLC in Intervallen von 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 und 48 h durchgeführt.
  2. Überwachung der DgpA-Aktivität mit einem 2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DCPIP)-Assay
    HINWEIS: Der DCPIP-Assay überwacht die Zuckeroxidation, indem er die Reduktion von blauem DCPIP zu farblosem Leuko-DCPIP misst, da er Elektronen von oxidierten Zuckern33 aufnimmt. Hier wurde der DCIPIP-Reporter-Assay verwendet, um die DgpA-Oxidationsaktivität gegenüber verschiedenen glykosylierten Verbindungen, Monosacchariden, Disacchariden oder Polysacchariden aufzuzeichnen. Der Wildtyp DgpA und seine zuckerbindenden defekten Mutanten einschließlich D182A, Δ(308-316) und Δ(311-316) wurden verwendet27.
    1. Inkubieren Sie 0,8 mM DCPIP, 50 μM Protein einschließlich Wildtyp-DgpA und seinen drei zuckerbindenden defekten Mutanten (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) oder DgpA Δ(311-316)), mit 10 mM-Substraten wie Puerarin, Vitexin, Genistin, löslicher Stärke, Maltotriose, Laktose, Saccharose, Glukose oder Maltose in 1x PBS-Puffer (pH 7,4).
    2. Nach 20 Stunden Reaktion ist die Absorptionsänderung von DCPIP bei 600 nm mit einem Mikroplatten-Reader33 aufzuzeichnen.
  3. Bestimmung der Hemmrate von Glukose auf die C-glykosidische Bindungsspaltungsreaktion von Puerarin
    HINWEIS: DgpA gehört zur Familie der Zuckeroxidoreduktase-Enzyme, die in der Lage sind, den Zuckeranteil der C-Glykoside zu oxidieren. Abbildung 3E zeigt, dass Glukose an das katalytische Zentrum DgpA gebunden ist, und das Protokoll zur Bestimmung der DgpA-Struktur ist in Schritt 2.2.3 detailliert beschrieben. Um die kompetitive Bindung von DgpA zwischen Glukose und dem C-Glykosid Puerarin zu untersuchen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
    1. Führen Sie die Reaktion in 1 × PBS-Puffer (pH 7,4) durch. Geben Sie verschiedene Konzentrationen von Glukose (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM und 100 mM) zum C-Glykosid (Puerarin)-Spaltreaktionssystem, wie in Schritt 3.1 beschrieben. Die Reaktion wird 12 h lang bei 37 °C durchgeführt.
    2. Führen Sie eine quantitative Analyse des Produkts (Daidzein) unter Verwendung der HPLC-Kalibrierkurve für die Referenzverbindung (Standard-Daidzein) durch. Berechnen Sie die Hemmrate, indem Sie zunächst die Differenz in der Produktausbeute zwischen Reaktionen mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen und ungehemmten C-Glykosid-Spaltreaktionen (ohne Glukose) bestimmen und dann diese Differenz durch die Produktausbeute aus der ungehemmten Reaktion dividieren.
      HINWEIS: Um eine Kalibrierungskurve für die quantitative HPLC-Analyse zu erstellen, bereiten Sie eine serielle Verdünnung eines Referenzstandards (z. B. Puerarin oder Daidzein) über einen Konzentrationsbereich (z. B. 0,1-1 mM, in Schritten von 0,1 mM) vor. Analysieren Sie jede Konzentration mittels HPLC, zeichnen Sie die Peakbereiche auf und vergleichen Sie sie mit den entsprechenden Standardkonzentrationen. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch (y = mx + b, wobei y = Peakfläche, x = Konzentration) durchgeführt wird, um die Standardkurve zu ermitteln. Die Regressionsgleichung kann dann verwendet werden, um unbekannte Probenkonzentrationen aus ihren gemessenen Peakbereichen zu interpolieren.
  4. Bestimmung kinetischer Parameter
    HINWEIS: Die kinetischen Parameter gelten weithin als kritische Goldstandards für die quantitative Bewertung der enzymatischen katalytischen Effizienz. Zur quantitativen Beurteilung von DgpA/B/C-katalysierten Reaktionen wurden die kinetischen Parameter für die durch DgpA/B/C katalysierten C-Glykosid-Puerarin-Spaltreaktionen bestimmt.
    1. Bereiten Sie Substrat-C-Glykosid-Konzentrationsgradienten (Puerarin) (im Bereich von 0,01 bis 4 mM in 2-fachen Schritten) für die DgpA/B/C-katalysierte C-Glykosid-Spaltungsreaktion vor.
    2. Die Reaktion wird 8 h lang bei 37 °C nach der in Schritt 3.1 beschriebenen Methode durchgeführt. Führen Sie eine quantitative Analyse des Produkts (Daidzein) unter Verwendung der HPLC-Kalibrierkurve des Standard-Daidzein durch. Berechnen Sie dann die Reaktionsgeschwindigkeit (Produktbildungsrate), indem Sie die quantifizierte Menge durch die Reaktionszeit dividieren.
    3. Bestimmen Sie die kinetischen Parameter Km und kCat , indem Sie die berechnete Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration mit Hilfe einer statistischen Software (Table of Materials) an das Michaelis-Menten-Modell anpassen.

4. Vorbereitung und Nachweis des Reaktionszwischenprodukts

HINWEIS: Neben der C-Glykosid-Spaltaktivität katalysiert DgpA/B/C auch die Isomerisierung von O-Glykosiden zu C-Glykosiden. Wenn daher O-Glykoside als Substrate für DgpA/B/C verwendet werden, werden die Zwischenprodukte als isomerisierte C-Glykoside hergestellt. Zur Charakterisierung des Zwischenprodukts (Puerarin) wurde die Zwischenverbindung gereinigt und anschließend mit analytischen chemischen Werkzeugen, einschließlich LC-MS/MS und NMR-Spektroskopie, analysiert.

  1. Herstellung des Reaktionszwischenprodukts in der DgpA/B/C-katalysierten C-Glykosid-Isomerisierungsreaktion 27
    1. Bereiten Sie die DgpA/B/C-katalysierte O- zu C-Glykosid-Isomerisierungsreaktion unter Verwendung von 0,2 mM O-Glykosid (Daidzin) als Substrat und 20 μM DgpA- und DgpB/C-Komplex in einem Reaktionsvolumen von 90 mL vor, gemäß dem im obigen Schritt 3.1 beschriebenen Protokoll.
    2. Das Zwischenprodukt C-Glykosid (Puerarin) wird mit einer präparativen HPLC bei der Gradienten-Elutionsstrategie aufgereinigt (HINWEIS).
      HINWEIS: Bei den mobilen Phasen handelte es sich um Acetonitril (Mobile Phase A) und 0,1 % wässrige Essigsäure (Mobile Phase B) mit Gradientenelution. Der Gradient der Elution der mobilen Phase ist wie folgt: 5%-20% A bei 0-5 min, 20%-45% A bei 5-15 min, 45%-52% A bei 15-18 min, 52%-55% A bei 18-19 min, 55%-5% A bei 19-21 min und 5% A bei 21-23 min.
    3. Berechnen Sie die Konzentration des gereinigten Zwischenprodukts unter Verwendung der HPLC-Standardkalibrierungskurve in Schritt 3.3.2, erhalten Sie etwa 6 mg Puerarin aus dem 90-ml-Reaktionssystem in Schritt 4.1.1 und trocknen Sie dann die gereinigten Zwischenprodukte mit einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator für die zukünftige Verwendung.
  2. Charakterisierung von Reaktionszwischenprodukten mit LC-MS/MS
    1. Die getrockneten Zwischenerzeugnisse aus Schritt 4.1.3 werden aufgefangen. 100 μg der aus Daidzin abgeleiteten Zwischenprodukte werden gewogen und dann in 2 ml Methanol aufgelöst, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erreichen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 13.500 x g und sammeln Sie den Überstand für die LC-MS/MS-Analyse.
    2. Verwenden Sie das gleiche HPLC-Gradienten-Elutionsprogramm aus Schritt 4.1.2 für die LC-MS/MS-Analyse mit einem Injektionsvolumen von 5 μl.
  3. Charakterisierung von Reaktionszwischenprodukten mit NMR
    1. 4 mg der gereinigten Zwischenprodukte aus der Daidzin-Reaktion werden in 340 μl Dimethylsulfoxid-d 6 für 1H und 13C NMR-Spektroskopie gelöst. Stellen Sie die Geräteparameter wie folgt ein: Temperatur bei 298 K, 3-mal shim, Pulsbreite 18 μs, Relaxationsverzögerung 1,5 s, 48 Scans, mit anderen Parametern auf Standardeinstellung27.
    2. Erfassen Sie die NMR 1H- und 13C-Spektren mit einem 600 MHz NMR-Instrument.

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Ergebnisse

Nach den in Abbildung 1exprimierten wir zuerst die Gene DgpA, DgpB und DgpC in E. coli BL21(DE3) Zellen. Da DgpB und DgpC einen stabilen Enzymkomplex (DgpB/C-Komplex) bilden,10,26,27,34wurden Zellen, die diese beiden Proteine exprimieren, zur Co-Reinigung kombiniert. Nach der Zelllyse wurde der Überstand durch Zentrifugatio...

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Diskussion

Derzeit sind die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Enzymen des C-Glykosid-Stoffwechsels auf diesem Gebiet unklar, und es fehlen geeignete Forschungsmethoden 10,24,26. Durch die Nutzung der signifikanten Vorteile der kombinierten Chemie und Biotechnologie 40,41,42,43,44,45 schlägt die Studie eine Forschungsmethodik vor, die Strukturbiologie, Enzymologie und ande...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wird finanziert mit dem Startup-Fund-Programm an der Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) an W.M., dem Notfallfonds gegen COVID-19-Programm an der BUCM (1000061223476) an W.M., dem Innovationsteam und dem Talentförderungsprogramm der nationalen Verwaltung für traditionelle chinesische Medizin (ZYYCXTD-C-202006) an W.M. und dem unabhängigen Forschungsprojekt für Doktoranden an der BUCM (ZJKT2023012) an H.P. Wir danken allen Labormitgliedern im Wenfu Ma Labor für die hilfreiche Diskussion.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,6-Dichlorindophenol (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-Mercaptoethanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5   Protein Loading DyeSangon BiotechC508320
EssigsäureShanghai MACKLINA111247
AcetonitrilThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR SpektrometerBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424REppendorf022620601
Chirascan&trade plus CD SpektrometerAngewandte PhotophysikChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) kompetente ZellenThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-GlucosidShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlukoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersion? Prism 9Berechnen Sie die kinetischen Parameter Km und kcat
HiLoad Superdex 200 pg präparative SEC-SäulenCytiva28989335
HisTrap HP His Tag ProteinreinigungssäulenCytiva17524802
HiTrap Q FF Säule für AnionenaustauschchromatographieCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  Version 723
HPLC-Säule TC-C18(2), 170Å, 5 µ m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT, HochleistungsflüssigkeitschromatographieShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
ManganchloridShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MethanolThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Wissenschaft und TechnologieN8110
Olympus SZX12 StereomikroskopOLYMPUS SZX7
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixDas Phenix-Entwicklungsteam1.21.2Phenix ist eine umfassende Software-Suite für die Bestimmung der Proteinkristallstruktur, die SAD- (Single-wavelength Anomalous Dispersion) und MR-Methoden (Molecular Replacement) mit Phaser-Software integriert.
Präparativer HochleistungsflüssigkeitschromatographWaters2545/2998
Proteinkristall-Screening-KitHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
SchüttelinkubatorShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
SnakeSkin&Handel; Dialysemembran, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Lösliche StärkeSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Superspeed-ZentrifugeThermo Fisher Scientific™
SpectraMax i3x Multi-Mode Mikroplatten-ReaderMOLEKULARE GERÄTESpectraMax i3x
SpectraMax QuickDrop Mikrovolumen-Spektralphotometer SpezifikationenMOLEKULARE GERÄTEQuickDrop
SaccharoseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD-VorbereitungSäulenwasser186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Ubiquitin-ähnliche Protease 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
UltratiefkühlschrankThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Vakuum-ZentrifugalkonzentratorBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Referenzen

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C Glycosid StoffwechselEnzyme der DarmmikrobiotaProteinkristallographieLC MS AnalyseNMR SpektroskopieEnzymkinetikchromatographische ReinigungFlavonoid Stoffwechsel

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