Beurteilung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern in vitro unter wiederholter Magnetstimulation

Myelin ist eine stabile, röhrenförmige Membranstruktur, die Axone umgibt, die von Oligodendrozyten im Zentralnervensystem (ZNS) produziert werden. Diese Myelinscheide spielt eine entscheidende Rolle bei der schnellen und effizienten Ausbreitung von Aktionspotentialen¹. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Schlaganfall und traumatische Verletzungen, einschließlich Rückenmarksverletzungen (SCI) und traumatische Hirnverletzungen (TBI), können jedoch zum Verlust der Myelinintegrität führen. Dies führt zur Bildung von Myelintrümmern aufgrund der Störung der Myelinscheide und einer direkten Schädigung der Myelinstrukturen ^2,3,4. Die Anhäufung von Myelintrümmern behindert nicht nur die Remyelinisierung und die funktionelle Erholung, sondern verschlimmert auch die Neuroinflammation ^5,6. Daher ist eine wirksame Beseitigung von Myelintrümmern unerlässlich für die Beseitigung von Neuroinflammation, die Förderung der axonalen Regeneration und die Wiederherstellung der Homöostase im Nervensystem nach neurologischen Erkrankungen.

Myelinablagerungen werden hauptsächlich von Fresszellen wie Makrophagen und Mikroglia im Zentralnervensystem (ZNS) beseitigt. Mikroglia, die residenten Immunzellen des ZNS, überwachen ihre Umgebung ständig auf potenzielle Bedrohungen und schützen das ZNS, indem sie beschädigtes Myelin und Myelintrümmer entfernen. Darüber hinaus spielt die mikrogliale Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Neurogenese durch Debris Clearance ^7,8. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Verbesserung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern die schädlichen Auswirkungen von Entzündungen mildern, ZNS-Schäden reduzieren und die axonale Regeneration nach Nervenverletzungen fördern kann. ^4,9,10.

Die Magnetstimulationstherapie, eine nicht-invasive Neuromodulationstechnik, hat sich bei der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen durchgesetzt¹¹. Insbesondere die wiederholte transkranielle Magnetstimulation (rTMS) hat sich als vielversprechender therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit (AD), Hirnverletzungen und Schlaganfälle erwiesen 12,13,14. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass rTMS die mikrogliale Phagozytose von Amyloid-beta (Aβ) und Apolipoprotein E (ApoE) verstärken und dadurch das pathologische Fortschreiten der AD in Tiermodellen hemmen^{kann 15}. In ähnlicher Weise ergab unsere jüngste Arbeit, dass die wiederholte transspinale Magnetstimulation (rTSMS) die mikrogliale Phagozytose von Myelintrümmern nach einer Rückenmarksverletzung bei Ratten^{fördert 16}.

Nichtsdestotrotz wurde der Einfluss der repetitiven Magnetstimulation auf Mikroglia überwiegend durch experimentelle Modelle an Tieren untermauert 17,18,19. In der Tat wurde gezeigt, dass die magnetische Stimulation die neuronale Erregbarkeit durch die Induktion von Strömen moduliert²⁰. Folglich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Interaktion zwischen Neuronen und Mikroglia die Funktion der Mikroglia beeinflussen kann. Folglich sind In-vitro-Experimente notwendig, um festzustellen, ob der Einfluss der Magnetstimulation auf Mikroglia unabhängig von der Veränderung der neuronalen Erregbarkeit ist. Neuere Studien haben in experimentellen Modellen einen modulatorischen Effekt der repetitiven magnetischen Stimulation auf Mikroglia identifiziert. Einige Studien zeigten, dass die repetitive magnetische Stimulation die Polarisation der Mikroglia in Richtung M2 fördern kann^19,21. Die weitere Erforschung ihrer Mikroglia-Funktion muss jedoch noch geklärt werden. Amelie Eichler et al. intervenierten in vitro mit 10-Hz-Magnetstimulation in Hirngewebeschnitte und fanden heraus, dass die 10-Hz-Magnetstimulation in der Lage war, die Freisetzung von Zytokinen aus Mikroglia zu fördern, um die neuronale Erregbarkeit und Plastizität zu beeinflussen²². Während diese Studie das Verständnis der Auswirkungen der Magnetstimulation auf Mikroglia erweiterte, sind weitere Untersuchungen auf zellulärer Ebene notwendig, um ihre Mechanismen vollständig aufzuklären.

Daher haben wir ein Protokoll etabliert, um zu überprüfen, ob die Magnetstimulation die Phagozytose von Myelintrümmern in vitro fördern kann. Im Gegensatz zu Myelin-Trümmern nach einer Krankheit oder Gewebeschädigung, die ein Produkt einer Verletzung sind, haben die Myelin-Trümmer, die in diesem Experiment verwendet werden, die Form der Myelinscheide, nachdem sie abgebaut wurde. Darüber hinaus ist das Konzept der Myelintrümmer ein Produkt des Myelinzerfalls. Als primäre phagozytäre Zellen des Gehirns spielen Mikroglia eine zentrale Rolle bei der Beseitigung geschädigter Zellen und Myelintrümmer²³, die mit Krankheiten wie Multipler Sklerose und Alzheimer in Verbindung gebracht werden^24,25. Es wurde gezeigt, dass die Anhäufung von Myelintrümmern die Neuroinflammation verschlimmert und die Regeneration behindert²⁶. Ziel der Studie ist es, das Potenzial der Magnetstimulation zur Verbesserung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern zu untersuchen, wodurch die Neuroinflammation reduziert und die ZNS-Genesung bei neurodegenerativen und traumatischen Zuständen unterstützt wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der Studie ein Co-Kultur-Ansatz verwendet wird, bei dem Mikroglia mit Myelin-Trümmern co-kultiviert und eine wiederholte Magnetstimulation durchgeführt wird, um die Wirkung der repetitiven Magnetstimulation auf die phagozytische Kapazität der Mikroglia zu überprüfen.

Hier wurden drei weibliche SD-Ratten (im Alter von 2-3 Wochen) verwendet, um Myelinreste durch Saccharosegradientenzentrifugation zu extrahieren. Alle Ratten wurden von der Animal Core Facility der Nanjing Medical University, Nanjing, China gekauft (Tierlizenz: SYXK (Su) 2021-0023). Alle Ratten wurden unter Kontrollbedingungen aufgezogen (Temperatur 22 ± 2 °C, 12 h/12 h Hell-/Dunkelperiode, 55 % ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit). Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Nanjing Medical University genehmigt (Nr. IACUC-1903031 und Nr. IACUC-2005001) und zielten darauf ab, das Leiden und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.

1. Myelin-Isolierung

HINWEIS: Myelin-Trümmer wurden wie zuvor beschrieben extrahiert, und es wurden einige Modifikationen vorgenommen²⁷. Stellen Sie sicher, dass alle Schritte bei 4 °C und unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurden.

1. Isolierung von rohem Myelin
   1. Extraktion von Hirngewebe
      1. Nach der Anästhesie mit Pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneale Injektion) beurteilen Sie die Narkosetiefe anhand der Zehenquetschreaktion. Enthaupte die weiblichen Ratten. Präparieren Sie den ganzen Kopf auf Eis und halbieren Sie den Schädel mit einer Schere, um das Gehirn vollständig freizulegen und die Entfernung des gesamten Gehirns zu erleichtern.
      2. Entfernen Sie die Membranen, das Kleinhirn und den Hippocampus mit einer Schere und Pinzette auf akribische und aseptische Weise, um eine Kontamination der Saccharosemischung des Gehirngewebes zu verhindern. Reinigen Sie das Gehirn 3x mit PBS, um Blut- oder Gewebereste zu entfernen.
      3. Übertragen Sie das gereinigte Gehirn in 10 mL sterile Saccharoselösung von 0,32 M und schneiden Sie das Hirngewebe mit der mikrochirurgischen Schere in 5 mm³ Stücke, um eine Saccharosemischung aus dem Gehirngewebe zu erhalten.
   2. Homogenisierung von Hirngewebe
      1. Übertragen Sie die Saccharosemischung des Gehirngewebes in einen sterilen 50-ml-Homogenisator und fügen Sie 30 ml 0,32 M sterile Saccharoselösung hinzu. Verwenden Sie einen 50-ml-Glashomogenisator, um 2 Minuten lang zu homogenisieren, um ein glattes Homogenat des Gehirngewebes zu erhalten.
      2. Verdünnen Sie das Homogenat des Hirngewebes auf 90 ml mit 0,32 M steriler Saccharoselösung, mischen Sie es und geben Sie es langsam in den oberen Teil von sechs sterilen dünnwandigen Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen mit 38,5 ml, die 20 ml 0,83 M sterile Saccharoselösung enthalten. Geben Sie 15 ml Homogenat in jedes Zentrifugenröhrchen und nivellieren Sie es dann mit 0,32 M steriler Saccharoselösung.
   3. Sammlung von Rohmyelin-Trümmern
      1. Kühlen Sie einen Ultrazentrifugenrotor auf 4 °C vor und zentrifugieren Sie die Probe 45 Minuten lang bei 75.000 x g . Nach dem Zentrifugationsprozess sammeln Sie die Myelinreste von der Grenzfläche zwischen den beiden Saccharosedichten mit einem sterilen Pasteurröhrchen.
         HINWEIS: Während des Entnahmeprozesses ist unbedingt Vorsicht geboten und es ist zu vermeiden, dass versehentlich andere Bestandteile der kontaminierten Probe entnommen werden.
2. Erste isotonische Trennung und Reinigung
   1. Übertragen Sie die gesammelte Myelin-Trümmerlösung in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen mit vorgekühltem sterilem phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer (PBS) auf 35 mL ein. Übertragen Sie die Lösung in einen neuen sterilen 50-ml-Homogenisator und homogenisieren Sie sie 2 Minuten lang, um ein Homogenat zu erhalten.
   2. Verteilen Sie das Homogenat der Myelinreste gleichmäßig in sechs sterilen dünnwandigen Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 38,5 mL und fügen Sie sterilen PBS-Puffer hinzu. Die Röhrchen werden 45 Minuten lang bei 4 °C bei 75.000 x g zentrifugiert.
3. Zweite isotonische Trennung und Reinigung
   1. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das feste weiße Pellet in 10 ml vorgekühltem sterilem PBS-Puffer resuspendiert, um eine Myelin-Rückstandssuspension zu erhalten. Die Suspension gleichmäßig auf zwei sterile dünnwandige Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 38,5 ml verteilen, wobei das Volumen durch die Zugabe von sterilem PBS-Puffer ausgeglichen wird.
   2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C bei 75.000 x g für 45 min.
4. Gereinigte Myelinsammlung
   1. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das feste weiße Pellet in 6 ml sterilem PBS-Puffer resuspendiert. Die Myelin-Debris-Suspension wird in sechs 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und anschließend 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 x g zentrifugiert.
   2. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das feste weiße Pellet in 100 μl vorgekühlter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert.
5. Quantifizierung von Myelin-Trümmern
   1. Nehmen Sie 3 μl der Myelin-Trümmersuspension zur Quantifizierung des Proteingehalts mit einem BCA-Proteinquantifizierungskit. Lagern Sie die restliche Suspension der Myelinreste bei -80 °C.

2. Fluoreszenzmarkierung von Myelin-Trümmern

1. Inkubation von Carboxyfluoresceindiacetat-N-Succinimidylester
   1. Tauen Sie die benötigten Myelinreste bei 4 °C oder Eiswasser auf und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand ist zu verwerfen und die Myelinreste in 200 μl Carboxyfluoresceindiacetat-N-Succinimidylester-Lösung (CFSE; 50 μM) zu resuspendieren.
   2. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 min inkubieren. Nach der Inkubationszeit bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
   3. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben 3x mit 500 μl sterilem PBS-Puffer. Nach dem Waschvorgang werden die Myelinreste in 100 μl vorgekühltem sterilem PBS-Puffer resuspendiert, um eine Suspension aus fluoreszenzmarkierten Myelinresten zu erhalten, die bei -80 °C gelagert werden können.

3. Mikroglia-Kultur

1. Kultivieren Sie BV-2-Zellen in befeuchtetem 5 % CO_{2 bei} 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) FBS, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml). Aussaat von fast 50 % Bv-2-Zellen in der 12-Well-Platte und der 24-Well-Platte für weitere Tests.

4. In vitro wiederholte Magnetstimulation

1. Führen Sie die wiederholte In-vitro-Magnetstimulationsintervention mit der folgenden Einstellung durch: Behandlungsfrequenz von 20 Hz, Behandlungsintensität von 1% der maximalen Ausgangsintensität (d.h. 0,035 Tesla), Stimulationszeit von 5 s, Ruhezeit von 20 s. Verabreichen Sie 600 Impulse mit einer einzigen Behandlungszeit von 2,5 Minuten.
2. Positionieren Sie während der Magnetstimulation die Mitte der Spule in einer Linie mit der Mitte der Kulturplatte und stellen Sie sicher, dass die Spule eng an der Unterseite der Kulturplatte anliegt.
   1. Legen Sie die Parameter der Magnetstimulation fest und legen Sie die Richtung der Magnetstimulationsspule so fest, dass sie senkrecht zum Boden steht und nach oben ausgerichtet ist. Sterilisieren Sie die Magnetstimulationsspirale mit Alkohol, um eine Kontamination durch Zellen zu verhindern.
   2. Nehmen Sie anschließend die Zellkulturplatte aus dem Inkubator und positionieren Sie sie über der Magnetstimulationsspule für die Magnetstimulation. Sterilisieren Sie die Platte, indem Sie Alkohol darauf sprühen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator. Halten Sie die Platte während des gesamten Vorgangs abgedeckt.

5. Test der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern

1. Wiederholte Magnetstimulationsbehandlung für die LPS+rMS-Gruppe
   1. Verwenden Sie CFSE (50 μM) zur Markierung von Myelintrümmern zur Beurteilung der Phagozytose. Platte: 1 x 10⁴ BV-2-Zellen über Nacht in 24-Well-Platten. Wechseln Sie das Medium auf serumfreies Medium und behandeln Sie die Zellen 12 h lang mit Lipopolysaccharid (LPS; 1 μg/ml). Aspirieren Sie das alte Medium vorsichtig mit einer Pipette und fügen Sie dann sofort mit der Pipette das neue serumfreie Medium hinzu.
   2. Nach einer 12-stündigen LPS-Intervention geben Sie die Myelinreste (100 μg/ml) in das Medium für die Co-Kultur unter dunklen Bedingungen. Unterziehen Sie die Zellen wiederholten Magnetstimulationseingriffen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
2. Immunfluoreszenz und Bildgebung
   1. Waschen Sie die nicht adsorbierten Myelinreste vorsichtig mit PBS und fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 4% PFA. Blockieren Sie die Zellen mit PBS, das 10 % Eselsserumalbumin und 0,3 % Triton X-100 enthält, 1 h bei Raumtemperatur, waschen Sie sie dann mit PBS und inkubieren Sie sie mit dem primären Antikörper (IBA-1, 1:200) bei 4 °C über Nacht.
   2. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörpern (1: 300, Maus) für 2 h bei Raumtemperatur. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop bei 40x und 20x auf.

In dieser Studie fütterten wir zunächst BV-2-Mikrogliazellen in vitro , indem wir aus dem Gehirn stammende Myelintrümmer extrahierten und wiederholte Magnetstimulation einsetzten, um ihre phagozytische Kapazität zu verbessern. Anschließend wurden BV-2-Mikrogliazellen kultiviert und vor der Magnetstimulation einer LPS-Intervention unterzogen, wodurch der in vivo-Zustand der Mikroglia unter strenger neurologischer Validierung emuliert wurde. Anschließend wurde eine rMS-Intervention nach LPS-Stimulation angewendet. Um die Phagozytose von Zellen zu validieren, wurde Immunfluoreszenz eingesetzt, wobei IBA-1 zur Markierung von Mikroglia und CFSE zur Markierung von Myelintrümmern verwendet wurde (Abbildung 1). Die Immunfluoreszenzergebnisse zeigten eine signifikante Verringerung sowohl der Fläche der verschlungenen äußeren Myelintrümmer (CFSE) als auch der Anzahl der IBA+/Myelin+ -Zellen in der LPS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Darüber hinaus zeigten nach der Magnetstimulation die Fläche der verschlungenen externen Myelintrümmer und die Anzahl der IBA+/Myelin+ -Zellen in der LPS+rMS-Gruppe im Vergleich zur LPS-Gruppe einen signifikanten Anstieg (Abbildung 2). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl und Fläche der durch Mikroglia phagozytierten Myelintrümmer in der LPS+4h rMS-Gruppe signifikant größer waren als in der LPS+1h rMS- und der LPS+2h rMS-Gruppe nach rMS-Intervention (Abbildung 3). Somit ist diese fördernde Wirkung zeitabhängig. Diese Ergebnisse bestätigen somit, dass rMS in vitro die mikrogliale Phagozytose von Myelintrümmern fördert.

Dieses Protokoll hat gewisse Einschränkungen in Bezug auf den Nachweis, und die hier vorgestellten Ergebnisse wurden durch die Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis der Phagozytose durch Mikroglia erzielt. Da es sich bei CFSE tatsächlich um einen Fluoreszenzfarbstoff für Myelinproteine handelt, war es notwendig, ihn vor der Durchführung der Immunfluoreszenz-Experimente (IF) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu reinigen, um einen Überschuss an abnormalen Fluoreszenzsignalen in den Ergebnissen zu vermeiden. Es wurde jedoch beobachtet, dass nicht alle Signale der CFSE effektiv entfernt werden konnten, was eine sorgfältige Identifizierung bei der anschließenden Analyse der Fluoreszenzergebnisse erforderlich machte. Folglich sollten bei der Bewertung der Immunfluoreszenzergebnisse ausschließlich die Fluoreszenzsignale von CFSE berücksichtigt werden, die mit Zellen co-markiert wurden, die als phagozytierte Myelinfragmente identifiziert wurden. Des Weiteren ist der Fluoreszenzbereich von CFSE innerhalb der Zelle während des Zählvorgangs zu zählen. Es sollte beachtet werden, dass alternative experimentelle Techniken, wie z. B. die Durchflusszytometrie, auch eingesetzt werden könnten, um den Anteil phagozytierter Myelin-Trümmerzellen nachzuweisen. Darüber hinaus könnte die Erhöhung der Waschfrequenz und die zusätzliche Beschallung der Myelintrümmer die Genauigkeit der Ergebnisse verbessern.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern mittels rMS. Myelin-Trümmer wurden aus Rattengehirnen extrahiert, und BV-2-Zellen wurden gleichzeitig zum Zwecke nachfolgender zellulärer Experimente kultiviert. Die BV-2-Zellen wurden über einen Zeitraum von 12 Stunden mit LPS stimuliert, woraufhin CFSE-markierte Myelinfragmente hinzugefügt wurden. Es folgten repetitive Magnetstimulationseingriffe und schließlich Immunfluoreszenz und Detektion. Abkürzungen: CFSE = Carboxyfluoresceindiacetat N-succinimidylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: In vitro BV2-Zellphagozytose von Myelintrümmern mittels rMS. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder der Aufnahme von Myelintrümmern (CFSE, grün) durch BV-2-Zellen (IBA-1, rot) in jeder Gruppe (n=4). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsleiste = 50 μm, 10 μm. (B-D). Quantifizierungsanalyse der Myelin-Trümmerfläche innerhalb der BV-2-Zellen (B), des prozentualen Anteils der Myelin-Trümmer und der BV-2-Zellen (C) in (A) und des Verhältnisses der Anzahl der Zellen, die mit Mikroglia und Myelin-Trümmern co-markiert sind, zur Anzahl der Mikroglia in (A), die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, #### p <0,0001 vs. Kontrolle, und** p <0,01 vs. LPS+rMS, bestimmt durch unidirektionale ANOVA. Diese Zahl wurde von16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zeitabhängige BV2-Zell-Phagozytose von Myelintrümmern mittels rMS. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder der Aufnahme von Myelintrümmern (CFSE, grün) durch BV-2-Zellen (IBA-1, rot) in jeder Gruppe (n=4). DAPI wurde zur Gegenfärbung von Zellkernen (blau) verwendet. Maßstabsbalken = 50 μm. (B-D) Quantifizierungsanalyse der Myelin-Trümmerfläche innerhalb der BV-2-Zellen (B), des prozentualen Anteils der Myelin-Trümmer und der BV-2-Zellen (C) in (A) und des Verhältnisses der Anzahl der Zellen, die mit Mikroglia und Myelin-Trümmern co-markiert sind, zur Anzahl der Mikroglia in (A), die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, ### p <0,001 vs. Kontrolle und** p <0,01 und *** p <0,001 vs. LPS+RMS 4h, bestimmt durch unidirektionale ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.