Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Makrophagen, die zuerst von Metchnikoff für ihre phagozytäre Fähigkeit identifiziert wurden, sind uralte Zellen, die für das Leben der Metazoen von grundlegender Bedeutung sind. Sie kommen allgegenwärtig bei erwachsenen Säugetieren vor und weisen eine bemerkenswerte anatomische und funktionelle Vielfalt auf. Als Teil des mononukleären phagozytischen Systems spielen Makrophagen neben dendritischen Zellen und Monozyten eine entscheidende Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, von der Entwicklung und Homöostase bis hin zur Immunantwort gegen Krankheitserreger^1,2. Residente Makrophagen, die auf ihre Gewebemikroumgebungen spezialisiert sind, fungieren als Wächter, überwachen die Gesundheit des Gewebes und reagieren auf physiologische Veränderungen und äußere Bedrohungen. Es wird angenommen, dass ihre begrenzte Plastizität eine evolutionäre Anpassung ist, um die Homöostase des Gewebes aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu sind rekrutierte Monozyten flexibler und können sich während einer Entzündung in verschiedene Makrophagen-Phänotypen differenzieren. Dieser doppelte Einfluss von Entzündung und Gewebenische prägt die funktionelle Diversität von Makrophagen³. So können sich Monozyten-abgeleitete Makrophagen (M-DM) je nach lokalem Gewebemilieu in viele Subtypen differenzieren. Die lokalen Metaboliten, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Zell-Zell-Interaktion^4,5,6 beschreiben ihre Phänotypen und Funktionen. Darüber hinaus sind Makrophagen wichtige Produzenten von Faktoren, die Entzündungen dämpfen und die Revaskularisation und Gewebereparatur vorantreiben^7,8.

Angesichts der Tatsache, dass mindestens drei Hauptwaffen die Polarisation kontrollieren (extrinsische, intrinsische und Gewebeumgebungsbedingungen), sollte die Makrophagenpolarisation als multidimensional betrachtet werden². Die Haupthindernisse und Fallstricke bei der Beschreibung der Differenzierung und Polarisierung von Makrophagen sind die heterogenen experimentellen Bedingungen in der Literatur und der fehlende Konsens über die Definition von Makrophagenbegriffen in in vitro und in vivo Experimenten⁹. Nichtsdestotrotz hat eine gewisse Vereinheitlichung der experimentellen Standards für verschiedene experimentelle Szenarien begonnen.

Um das Feld der menschlichen Makrophagen besser zu verstehen, benötigen wir standardisierte und gut definierte In-vitro-Modelle von M-DM, um Differenzierung, Polarisation, Phänotyp und Reprogrammierung sowie spezifische Funktionen zu verknüpfen. Unser Ziel war es, ein standardisiertes in-vitro-Modell von humanen nichtpolarisierten M-DM M0 und zytokinpolarisierten Makrophagen zu erstellen, um die verzerrte Reprogrammierung von M-DM mittels Durchflusszytometrie und real-time PCR zu untersuchen. Obwohl die Polarisation von Makrophagen aufgrund ihrer hohen Plastizität und der Fähigkeit, mehrere Signale aus ihrer Umgebung zu integrieren, ein dynamischer Prozess ist, charakterisierten wir hier die unpolarisierte M-DM (M0) und einige in-vitro Polarisationszustände, als die klassischen pro-inflammatorischen, allgemein auch als M1 bekannten und mit IFNγ und LPS induzierten Zustände. In ähnlicher Weise können die Gewebereparatur- und regulatorischen M2-Makrophagen als M2a definiert werden, wenn sie mit IL-4 induziert werden, und M2c, wenn sie mit Dexamethason oder IL-10 stimuliert werden. Diese polarisierenden Zustände erfassen eine Momentaufnahme des breiten Spektrums des M-DM-Milieus in Zeit und Raum, geben uns aber einige Himmelsrichtungen, um die analytische Karte festzulegen, wo die Testbedingungen zu verorten sind.

Trotz der komplexen und dynamischen Kombination von Oberflächenmarkern und Transkriptionsprogrammen haben wir bei der Analyse von in vitro M-DM festgestellt, dass CD64, CD206, CD163, CD14 und MERTK unpolarisierte M0-Bedingungen von IFNγ/LPS-induziertem M1, IL-4-induziertem M2a und IL-10 oder Dexamethason-induziertem durch Durchflusszytometrie unterscheiden können. Darüber hinaus wurde die IRF1- und CXCL10-Genexpression als spezifisch für IFNγ/LPS-induziertes M1 definiert; IRF4-, CCL22- und TGM2-spezifische Transkripte für IL-4-abgeleitetes M2a; und MERTK-Gen für Dexamethason-abgeleitetes M2c, das zusätzliche Kardinalpunkte setzt, um die verzerrte Reprogrammierung von M-DM zu vergleichen, die mit verschiedenen Stimuli herausgefordert oder sogar mit anderen Zelltypen kokultiviert wurde.

Alle gesunden freiwilligen Blutspender gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und die Studie wurde von der Institutionellen Ethikkommission der Nationalen Akademie für Medizin (IMEX-CONICET-ANM) Argentinien genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)

HINWEIS: PBMCs werden aus 40 ml antikoaguliertem peripherem Blut mit Natriumcitrat bei 3,8% und unter Verwendung von Ficoll-Hypaque-Dichtegradient (1077) Zentrifugation isoliert. Dieses Protokoll wird unter sterilen Bedingungen in einer BSL2-Biosicherheitswerkbank durchgeführt.

1. Die erhaltene antikoagulierte periphere Blutprobe wird zur Zentrifugation in geeignete 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen überführt.
2. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 200 × g für 15 Minuten (Beschleunigung: 4, Verzögerung: 2, wenn das Maximum 5 beträgt) bei Raumtemperatur, um oben plättchenreiches Plasma (PRP) und unten zelluläre Fraktion, einschließlich roter und weißer Blutkörperchen, zu erhalten. Siehe Abbildung 1.
3. Die obere Fraktion (PRP) wird in 15-ml-Röhrchen überführt (wenn Plasma gelagert wird) und 10 Minuten lang bei 600 × g zentrifugiert (maximale Beschleunigung und Verzögerung), um die endgültige Plasmafraktion ohne Blutplättchen zu erhalten. Plasma bei -20 °C lagern.
4. Die aus der ersten Zentrifugation erhaltene zelluläre Fraktion wird 2x (Minimum) bis 3x (Maximum) mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) verdünnt, die bei Raumtemperatur vorgewärmt wird. Homogenisieren Sie es vorsichtig und verwenden Sie diese verdünnte Fraktion für die Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation.
5. 15 ml Ficoll-Hypaque in ein steriles 50-ml-Röhrchen überführen. Geben Sie dann vorsichtig und langsam 30 ml verdünntes Blut auf das Ficoll, ohne die Phasen zu vermischen. Wenn Sie mit 10 ml oder weniger verdünntem Blut arbeiten, geben Sie 4 ml Ficoll-Hypaque in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie dann die 10 ml verdünnte Blutprobe hinzu.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um die mononukleäre Fraktion zu erhalten.
6. Das Röhrchen mit dem Ficoll plus verdünntem Blut bei 600 × g für 25 min zentrifugieren (Beschleunigung: 1; Verzögerung: 0) bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie einen Teil der gelben Deckschicht mit einer sterilen 3-ml-Pasteurpipette. Sammeln Sie dann vorsichtig die Grenzfläche (mononukleäre "Ring"-Fraktion), die zwischen der gelben Deckschicht und der Ficoll-Schicht gebildet wurde, mit einer sterilen Pasteur-Pipette. Dieser "Ring" enthält die mononukleären Zellen (PBMC) von Interesse.
   HINWEIS: Ein Teil der verbleibenden Plasmaphase kann aufgefangen werden, aber vermeiden Sie unbedingt die Ficoll-Phase, da sie für die PBMCs giftig sein könnte.
8. Übertragen Sie die gesammelten PBMCs in ein neues 15-ml-Röhrchen, das mindestens 3 mL steriles 1x PBS enthält. Füllen Sie dann mit dem entsprechenden Volumen an sterilem 1x PBS auf 12-15 mL auf. Zentrifugieren Sie die PBMCs bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 min.
9. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die PBMCs erneut. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie 1 ml steriles 1x PBS hinzufügen, und füllen Sie es dann auf 12-14 mL mit zusätzlichem sterilem 1x PBS auf. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 min.
10. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das PBMC-Pellet in sterilem 1x PBS, das 2 % inaktiviertes fötales Rinderserum (1 x PBS-2 % FBS) enthält, und erhöhen Sie das Volumen auf 10 ml. Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler oder zählen Sie die Zellen und bereiten Sie eine 1:5-Zellsuspension vor, die in sterilem Kälte-1x PBS und dann (1:2) in Trypanblau verdünnt wird, um eine endgültige Verdünnung von 1:10 zu erhalten. Verwenden Sie zum Zählen ein Lichtmikroskop.
11. Schleudern Sie die PBMC-Suspension bei 300 × g für 5 min bei 8-10 °C herunter. Resuspendieren Sie die Zellen in einem gewünschten Volumen sterilen, kalten 1x PBS-2% FBS, um eine Endkonzentration von 10⁸ Zellen/ml zu erhalten. Lassen Sie diese Zellen bis zum nächsten Schritt bei 4 °C.
    HINWEIS: Wenn die entnommenen PBMCs nicht am selben Tag verwendet werden, wird empfohlen, sie in einem kryogenen Fläschchen bei 10⁸ Zellen/ml in geeignetem Gefriermedium einzufrieren (90 % der FBS enthalten 10 % Dimethylsulfoxid, DMSO). Über Nacht bei -80 °C in einem Polyethylenglykolbehälter lagern, damit die Zellen langsam einfrieren und so die Zellschäden minimiert werden. Setzen Sie die Zellen am nächsten Tag in eine Lagerbox um und lassen Sie sie einige Tage lang bei -80 °C oder stellen Sie sie für eine lange Lagerung in einen Flüssigstickstofftank um.

2. CD14⁺ Monozytensortierung mit magnetischen Kügelchen

HINWEIS: Die Menge an CD14-Monozyten, die in PBMCs gesunder Spender gefunden werden, variiert je nach Alter und Geschlecht. Falls verfügbar, verwenden Sie einen Zellzähler, um den prozentualen Anteil der Monozyten in jeder Probe zu ermitteln, und berechnen Sie dann die Anzahl der PBMCs, die zum Sortieren der erforderlichen CD14-Monozyten erforderlich sind. Wenn kein Zellzähler verfügbar ist, könnten 10 % der Monozyten pro PBMC-Probe als breiter Ansatz betrachtet werden^{4,6,7,10,11,12,13}.

CD14⁺ Monozyten werden mit einem humanen CD14-Positiv-Selektionskit isoliert⁵. Wir haben das Isolationsprotokoll mit 1 bis 2 × 10⁷ PBMCs in 100 μl Reaktion standardisiert; Verwenden Sie dieses Verhältnis für höhere Zahlen. Das empfohlene Mindestreaktionsvolumen beträgt 100 μl, auch bei einer niedrigeren Zellzahl als 1 × 10⁷ PBMCs.

1. Bereiten Sie eine PBMC-Zellsuspension in einer Konzentration von 1-2 × 10⁸ Zellen/ml in 1x PBS-2% FBS mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) Puffer vor und überführen Sie die gewünschte Menge an PBMCs in ein 5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden.
2. 10 μl Positive Selection Cocktail pro 100 μl Zellsuspension zugeben, gut mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Fügen Sie 10 μl magnetische Nanopartikel pro 100 μl Zellsuspension hinzu, pipettieren Sie mehr als 5x kräftig auf und ab, um die magnetischen Nanopartikel gleichmäßig zu suspendieren, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min.
   HINWEIS: Vortexen wird nicht empfohlen.
4. Fügen Sie 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA-Puffer hinzu, um das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf 2,5 mL zu erhöhen. Pipettieren Sie die Zellen im Röhrchen vorsichtig 2-3x auf und ab. Setzen Sie das Rohr in den Magnetsortierer ein und stellen Sie es 5 Minuten lang auseinander.
5. Nehmen Sie den Magneten und drehen Sie ihn und das Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung um, wobei Sie den Überstandsanteil verwerfen. Die magnetisch markierten Zellen verbleiben im Inneren der Röhre. Lassen Sie den Magneten und das Rohr 2-3 s lang invertiert und drehen Sie sie dann senkrecht aufrecht.
   HINWEIS: Lassen Sie alle hängenden Tropfen aus der Öffnung der Tube; Schütteln oder tupfen Sie sie nicht ab.
6. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und geben Sie wieder 2,5 mL 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA-Puffer in das Röhrchen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig 2-3x auf und ab, um sie zu mischen. Setzen Sie das Rohr wieder in den Magneten ein und stellen Sie es für 5 Minuten auseinander.
7. Drehen Sie in einer kontinuierlichen Bewegung sowohl den Magneten als auch das Rohr um und verwerfen Sie die überstehende Fraktion. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge von 1x PBS-2% FBS-Puffer (ohne EDTA). Die positiv selektierten Zellen sind nun gebrauchsfertig.
   HINWEIS: Insgesamt sind zwei 5-Minuten-Abstände im Magneten erforderlich.
8. Waschen Sie sortierte CD14-Zellen mit 1x PBS-2% FBS-Puffer, bringen Sie die Zellsuspension auf 12-14 mL, um das verbleibende EDTA zu verdünnen, und zentrifugieren Sie sie dann bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 Minuten.
9. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie das Waschen, indem Sie das Zellpellet zuerst mit 1 ml 1x PBS-2% FBS-Puffer resuspendieren und dann das Volumen auf 12-14 ml auffüllen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 min.
10. Den Überstand verwerfen und die positiv selektierten CD14-Monozyten in 2 ml 1x PBS-2% FBS-Puffer resuspendieren. Verwenden Sie den automatischen Zellzähler oder zählen Sie die Zellen, indem Sie die Zellsuspension (1:5) in steriler Kälte 1x PBS und dann (1:2) in Trypanblau mit einem Lichtmikroskop verdünnen. Lassen Sie die Zellen bis zur Kulturvorbereitung auf Eis.
    HINWEIS: Die Reinheit der Zellen kann durch Durchflusszytometrie getestet werden, indem 50 μl der Zellsuspension entnommen und auf CD14⁺-Zellen (Klon HCD14) gefärbt werden. Empfohlen wird eine Reinheit von mehr als 90%.
11. Für die Kultivierung die Zellsuspension bei 300 × g für 5 min bei 8-10 °C abschleudern. Das Pellet in einer Konzentration von 10 6 Zellen/ml mit RPMI 1640 resuspendieren, ergänzt mit 10 % inaktiviertem FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (RPMI-10 % FBS-1 % P/S).
    HINWEIS: Es ist wichtig, ein hochwertiges, endotoxinarmes, hitzeinaktiviertes FBS zu verwenden. Immer auf Eis halten, um ein Anhaften von Monozyten an der Kunststoffwand vor dem Plattieren zu vermeiden.

3. Differenzierung und Polarisierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (M-DM)

HINWEIS: M-DM-Kultur wird durchgeführt, indem 2,5 × 10⁵ CD14⁺ Monozyten in 48-Well-Platten mit 500 μl RPMI-10% FBS-1% P/S plattiert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C 7 Tage lang mit CO₂ (5%) kultiviert werden. Wählen Sie behandelte Platten, um die Adhärenz der Monozyten an der Platte zu verbessern.

1. Definieren Sie alle experimentellen Bedingungen, die ausgeführt werden sollen, einschließlich der Vertiefungen für basales M-DM (M0), das inflammatorische M1, das Gewebereparatur-M2a, das regulatorische M2c und die gewünschten Testbedingungen.
2. 250 μl der in Schritt 2.11 hergestellten Zellsuspension pipettieren, um 2,5 × 10⁵ CD14⁺-Monozyten in jede Vertiefung zu säen.
3. Geben Sie 250 μl RPMI-10 % FBS-1 % P/S plus 50 ng/ml M-CSF in jede Vertiefung, um das Gesamtvolumen von 500 μl zu vervollständigen.
4. Die Zellkulturplatte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ 4 Tage lang inkubiert, um den ersten Schritt der Makrophagendifferenzierung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig die Zellkulturdifferenzierung, um festzustellen, ob morphologische Veränderungen wie erwartet aufgetreten sind oder ob unerwünschte nicht gebundene Zellen vorhanden sind.
5. Ersetzen Sie die Hälfte des Kulturmediums (250 μl RPMI-10 % FBS-1 % P/S) an Tag 4 der M-DM-Kultur. Fügen Sie Zytokine oder Reagenzien für die polarisierenden Bedingungen hinzu und kultivieren Sie diese 3 Tage lang (Endpunkt ist Tag 7): LPS (1 ng/ml) plus IFNγ (50 ng/ml) für M1, IL-4 (40 ng/ml) für M2a, IL-10 (50 ng/ml) oder Dexamethason (0,1 μM) für M2c.
6. Ernten Sie M-DM an Tag 7, um eine phänotypische Charakterisierung durchzuführen, sammeln Sie sie für die mRNA-Expression, wie in den nächsten beiden Schritten gezeigt, oder führen Sie einen funktionellen Assay durch.

4. Charakterisierung des Oberflächenphänotyps in polarisiertem M-DM durch Durchflusszytometrie

1. Verwerfen Sie das gesamte Volumen des Kulturmediums (500 μl einer 48-Well-Platte) und fügen Sie 200 μl 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA-Puffer für die Zellentnahme hinzu. 20 min auf Eis inkubieren und dann 200 μl 1x PBS-2% FBS hinzufügen, um den EDTA-Puffer zu verdünnen. Sammeln Sie das M-DM, indem Sie es in 1,5-ml-Mikroröhrchen auf und ab pipettieren. Waschen Sie diese geernteten Zellen einmal mit 1x PBS-2% FBS und zentrifugieren Sie sie bei 800 × g für 3 min.
2. Resuspendieren Sie das M-DM-Pellet mit 200 μl 1x PBS-5% FBS und überführen Sie es zur Blockierung bei Raumtemperatur für 15 min auf eine 96-Well-Mikroplatte mit rundem Boden. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 × g für 3 min.
3. Bereiten Sie die geeignete Kombination von direkt konjugierten Antikörpern in 1x PBS - 2% FBS vor. Jede Vertiefung oder Bedingung (1x) mit 50 μl des Antikörperpanels färben und bei 4 °C 30 min im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Hier bestand das Antikörper-Panel aus CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 und MERTK-Biotin plus Streptavidin-PE. Die Konzentration der prätiterierten Antikörper ist in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Waschen Sie das verschmutzte M-DM durch Zugabe von 150 μl 1x PBS und zentrifugieren Sie es bei 800 × g für 3 min.
5. Um die Zellviabilität zu messen, fügen Sie 100 μl des fixierbaren Viabilitätsfarbstoffs Zombie Violet (1:1.000 in 1x PBS) hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 30 min im Dunkeln.
6. Waschen Sie die gefärbten Zellen durch Zugabe von 100 μl 1x PBS und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 800 × g. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 200 μl 1x PBS.
7. Fixieren Sie, indem Sie das M-DM-Pellet mit 100 μl des Fixierreagenzes (aus dem Fixier-/Permeabilisierungskit) resuspendieren und 20 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Um eine angemessene Fixierung zu erreichen, ist es wichtig, das Zellpellet korrekt zu homogenisieren.
8. Waschen Sie den M-DM durch Zugabe von 100 μl 1x PBS-2% FBS und zentrifugieren Sie ihn 3 Minuten lang bei 800 × g. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 200 μl 1x PBS-2% FBS.
9. Resuspendieren Sie das M-DM-Pellet in 200 μl 1x PBS und lassen Sie die gefärbten Zellen im Durchflusszytometer laufen.

5. Genprogrammprofil zur Unterscheidung der M-DM-Polarisation durch qPCR

HINWEIS: Am Tag 7 der Kultur können 2,5 × 10⁵ M-TM unter Verwendung des RNA-Extraktionsreagenzes für die Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA geerntet werden. Die RNA-Isolierung kann auch mit alternativen Methoden wie säulenbasierter RNA-Extraktion und einem Elutionskit durchgeführt werden.

1. Das gesamte Volumen des Kulturmediums und das lysierte M-DM werden durch direkte Zugabe von 350 μl des Extraktionsreagenzes verworfen. Homogenisieren und überführen Sie diese Zellsuspension in ein 1,5 mL RNase-/DNase-freies Mikroröhrchen und fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort.
   HINWEIS: Wenn die RNA-Isolierung nicht am selben Tag durchgeführt wird, kann die Probe aus Schritt 5.1 über Nacht bei 4 °C oder bis zu einem Jahr lang bei -20 °C gelagert werden.
2. Um eine vollständige Dissoziation des Nukleoproteinkomplexes zu ermöglichen, inkubieren Sie die homogenisierten Proben aus Schritt 5.1 für 5 min bei 25 °C
3. Geben Sie 70 μl Chloroform zu jeder Probe. Verschließen Sie jedes Röhrchen fest, um ein Auslaufen zu verhindern, und mischen Sie den Inhalt gründlich, indem Sie das Röhrchen schütteln. Inkubieren Sie die Proben 2-3 Minuten lang und zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 15 °C bei 12.000 × g. In diesem Schritt werden die Phasen vollständig in eine untere Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase getrennt.
   HINWEIS: Das Volumen von Chloroform basiert auf einem Verhältnis von 0,2 ml Chloroform pro 1 ml Extraktionsreagenz, das während des Lyseschritts verwendet wird.
4. Die wässrige Phase, die die RNA enthält, wird in ein neues 1,5 mL RNase-/DNase-freies Mikroröhrchen überführt.
   HINWEIS: Lassen Sie bei der Einnahme der wässrigen Phase ein kleines Volumen zurück, um eine Übertragung der Interphasen- oder organischen Schichten zu vermeiden.
5. Geben Sie 175 μl Isopropanol zu jeder Probe, um die RNA auszufällen. 10 min bei 4 °C oder alternativ über Nacht bei -20 °C inkubieren.
   HINWEIS: Das Volumen von Isopropanol basiert auf einem Verhältnis von 0,5 ml Isopropanol pro ml des Erstextraktionsreagenzes.
6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C. Ein weißes, gelartiges Kügelchen aus Gesamt-RNA fällt am Boden des Röhrchens aus. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette.
7. Waschen Sie die RNA, indem Sie das weiße, gelartige Pellet in 350 μl 75%igem Ethanol resuspendieren (1 mL pro 1 mL Extraktionsreagenz (v/v), das für die Lyse verwendet wird).
   HINWEIS: Die RNA kann in 75%igem Ethanol bis zu 1 Jahr bei -20 °C oder bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
8. Das resuspendierte Pellet kurz vortexen und bei 7.500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Mikropipette entfernen und entsorgen. Trocknen oder vakuumieren Sie das RNA-Pellet für 5-10 min.
   HINWEIS: Um die RNA zu lösen, vermeiden Sie ein Übertrocknen des RNA-Pellets.
9. Suspendieren Sie das Pellet in 20-30 μl RNase-freiem Wasser, indem Sie es auf und ab pipettieren. In einem Wasserbad oder einem Wärmeblock bei 55-60 °C für 10-15 Minuten inkubieren. Fahren Sie mit der Messung der RNA-Konzentration fort und lagern Sie die RNA bei -70 °C.
10. Führen Sie die reverse Transkription (cDNA-Kopie) mit 100-500 ng RNA (minimal bzw. maximal) in 20 μl Reaktionsvolumen durch, indem Sie ein cDNA-Synthesekit verwenden.
11. Führen Sie die Echtzeit-PCR-Reaktionen mit 1 μl cDNA (5-25 ng) durch.
    1. Bereiten Sie die Reaktionsmischung für jedes Röhrchen (1x) mit 5 μl grüner SYBR-Mischung (2x), 0,2 μl jedem Primer (vorwärts und rückwärts) und 3,6 μl nukleasefreiem Wasser vor. Skalieren Sie alle Komponenten entsprechend der Probennummer. Mischen Sie das Reaktionsgemisch gründlich und geben Sie 9 μl in jedes qPCR-Röhrchen und schließlich 1 μl cDNA, um das endgültige Gesamtvolumen von 10 μl zu erreichen.
    2. Programmieren Sie das Temperaturwechselprotokoll auf einem Echtzeit-PCR-Gerät wie folgt: 2-3 min bei 98 °C (1x); 5-15 s bei 98 °C plus 15-30 s bei 60 °C (35-40x); schließen Sie schließlich die Schmelzkurvenanalyse (65-95 °C) in Schritten von 0,5 °C bei 2-5 s/Schritt ein oder verwenden Sie die Standardeinstellung des Geräts.
       HINWEIS: Diese Reaktion wurde unter Verwendung der universellen SYBR Green Mischung standardisiert. Die für die M-DM-Polarisationsanalyse empfohlenen Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.
12. Normalisieren Sie die Ergebnisse mit dem eukaryotischen Translationselongationsfaktor 1 alpha 1 (EEF1A1) als Referenzgen und überprüfen Sie die Spezifität der amplifizierten Produkte durch die Analyse der Dissoziationskurven.
    HINWEIS: Die Dissoziationskurvenanalyse ermöglicht die Bestätigung des Vorhandenseins von nur einem qPCR-Amplifikationsprodukt in der Reaktion.

Basierend auf unserer mehrjährigen Arbeit in der Makrophagencharakterisierung haben wir eine genaue Kombination von Markern gesetzt, die die verschiedenen Untergruppen der in-vitro M-DM klar unterscheidet. Die Phänotyp-Marker wurden auf der Grundlage der Literatur und eines breiten vorherigen Screenings ausgewählt, das wir zuvor durchgeführt hatten9,14,15,16,17. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass CD64, CD206, CD163, CD14 und MERTK dazu beitragen können, mittels Durchflusszytometrie eindeutig zwischen unpolarisiertem M-DM (M0), polarisiertem IFNγ/LPS-induziertem M1, IL-4-induziertem M2a und IL-10- oder Dexamethason-induziertem M2c zu unterscheiden4,5,7,11,12. Die Beschreibung und Funktion jedes ausgewählten Markers finden Sie in Tabelle 24.

Die Gruppe der durch Durchflusszytometrie analysierten Marker für die In-vitro-Analyse der M-DM-Polarisation ist in Abbildung 2 dargestellt. Beim Vergleich der verschiedenen polarisierten Makrophagen sehen wir, dass M1, induziert durch IFNγ plus LPS, durch den höchsten Gehalt an CD64, das Fehlen der CD206-Expression und niedrige Spiegel von CD163 und MERTK gekennzeichnet ist. Auf der anderen Seite sind M2a-Makrophagen, die durch IL-4 induziert werden, spezifisch durch eine Erhöhung der CD206-Expression und eine Reduktion von CD64, CD163 und MERTK gekennzeichnet. Schließlich ist der durch IL-10 oder Dexamethason induzierte M2c-Phänotyp durch eine spezifische Erhöhung der CD163-Expression, intermediäre CD64-Spiegel und einen Anstieg von MERTK und CD14 gekennzeichnet. Darüber hinaus kommt es zu einer deutlichen Reduktion von CD206 nur bei Polarisation mit IL-10. Das Dexamethason-induzierte M2c erhöht interessanterweise auch den CD206-Spiegel. Alle diese Marker wurden nach dem Gating von CD11b+ lebensfähigen Zellen analysiert. Zusätzlich zur Oberflächenphänotypisierung haben wir auch ein spezifisches Genexpressionspanel für das klassische IFNγ/LPS-induzierte M1 (IRF1 und CXCL10) und IL-4-induzierte M2a (IRF4, CCL22 und TGM2) festgelegt. Das Dexamethason-M2c-Transkriptions-induzierte Programm ist durch die MERTK-Expression gekennzeichnet.

Abbildung 1: Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes durch den Ficoll-Gradienten. Nachdem plättchenreiches Plasma verworfen wurde, wird die verdünnte periphere Blutprobe (2-3x) auf den Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten geladen und bei 600 × g für 25 min zentrifugiert (Beschleunigung: 1; Verzögerung: 0) bei Raumtemperatur, um die PBMC wie angegeben zu erhalten. Die Grenzfläche zwischen der gelben Deckschicht und der Ficoll-Schicht mit einer sterilen Pasteur-Pipette vorsichtig erfassen. Dieser "Ring" enthält die mononukleären Zellen von Interesse. Abkürzungen: PBMCs = mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; RBC = rote Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Phänotypische Charakterisierung von polarisiertem M-DM mittels Durchflusszytometrie. Monozyten-abgeleitete Makrophagen (M-DM) wurden in-vitro für 7 Tage in RPMI 1640 Medium differenziert, das 10 % FBS und 1 % P/S plus 50 ng/ml M-CSF enthielt. An Tag 4 wurde die Hälfte des Kulturmediums ausgetauscht und polarisierende Zytokine wurden hinzugefügt. Unpolarisierendes M-DM (M0) erhielt nur Medium; LPS (1 ng/ml) plus IFNγ (50 ng/ml) wurde für M1 hinzugefügt; IL-4 (40 ng/ml) wurde für M2a hinzugefügt; IL-10 (50 ng/ml) oder Dexamethason (0,1 μM) wurden für M2c zugesetzt. M-DM wurde für weitere 3 Tage kultiviert. An Tag 7 wurde M-DM entnommen, um eine phänotypische Charakterisierung durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Panels von fünf M-DM-Markern, (A) CD64, CD206, CD163, CD14 und (B) MERTK, durchzuführen. Die Gating-Strategie umfasste auch lebensfähige Zellen und CD11b+-Zellen. Repräsentative Punktdiagramme zeigen die Expressionsniveaus der einzelnen polarisierenden Marker im Vergleich zu jedem Typ von M-DM (M0, M1, M2a und M2c). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Antikörper-Panel für die M-DM-Immunphänotypisierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Eine kurze Beschreibung und Funktion jedes ausgewählten Markers zur Unterscheidung von in-vitro polarisierten Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die in der Durchflusszytometrie und qPCR verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.