Method Article

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

DOI:

10.3791/67656

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May 2nd, 2025

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1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Verständnis der Genexpression ist essentiell für die Entschlüsselung zellulärer Funktionen. Die Methoden, um die Expression zahlreicher Gene in situ innerhalb eines bestimmten Gewebes zu analysieren, sind jedoch nach wie vor begrenzt. Das hier beschriebene EASI-FISH-Protokoll wurde angepasst, um die Expression von Dutzenden von Genen im intakten adulten Drosophila-Zentralnervensystem (ZNS) mit kommerziell erhältlichen Reagenzien nachzuweisen. Dieses Protokoll enthält eine neue Gelformulierung, die die Robustheit des Gels erhöht, mehrere Hybridisierungsrunden ermöglicht und die Einbettung mehrerer Gehirne pro Gel ermöglicht. Diese Verbesserung erhöht den Durchsatz, ermöglicht einen optimalen Vergleich der Versuchsbedingungen und senkt die Reagenzienkosten. Darüber hinaus kann durch den Einsatz des GAL4-UAS-Systems zur Co-Detektion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) die Genexpression in spezifischen neuronalen oder glialen Zelltypen sichtbar gemacht werden. Insbesondere die hohe Auflösung, die durch die Expansionsmikroskopie erreicht wird, in Kombination mit der Empfindlichkeit der Methode, ermöglicht den Nachweis einzelner RNA-Transkripte. Dieser Ansatz integriert effektiv eine hohe Bildqualität mit hohem Durchsatz und ist damit ein leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression im gesamten intakten Fliegengehirn.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH wurde erstmals vor über 40 Jahren in Drosophila eingesetzt, um Gene auf Polyten-Chromosomen zu kartieren1,2. Heute ist die Einzelmolekül-FISH der Goldstandard für die räumliche Lokalisierung und Quantifizierung von mRNA-Transkripten in intaktem Gewebe3. Aufgrund von Problemen mit der Probenintegrität und dem RNA-Verlust waren die Einzelmolekül-FISH-Techniken in Drosophila jedoch auf nur wenige Gene beschränkt, die in derselben Probe analysiert werden können4,5,6,7. Während die jüngste Entwicklung des Barcodes (z.B. 8,9,10) die Anzahl der Transkripte, die auch in dickem Gewebe nachgewiesen werden können, auf mehrere hundert erhöht11,12, erfordert die Etablierung solcher Protokolle einen erheblichen Ressourceneinsatz, der eine Hürde für die Implementierung darstellen könnte. In der Tat haben sich viele erfinderische räumliche Transkriptomtechniken nie über ihre Herkunftsinstitutionen hinaus verbreitet13. Daher würde eine einfache und vergleichsweise kostengünstige Methode zum Nachweis der Expression von Dutzenden von Genen im selben intakten Gehirn verschiedene Forschungsziele erleichtern: die Validierung von RNA-Seq- und Zellatlas-Daten, die Kartierung molekularer Zelltypen im gesamten ZNS, die Quantifizierung von Entwicklungs-, Geschlechts- oder speziesspezifischen Unterschieden in der Genexpression oder die Messung von Veränderungen in der Genexpression, die durch die große Vielfalt genetischer oder umweltbedingter Störungen in Drosophila induziert werden.

Expansionsmikroskopie ist eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Gewebe mit höherer Auflösung zu beobachten, indem sie in einem quellfähigen Hydrogel expandiert werden14. EASI-FISH kombiniert Expansionsmikroskopie und RNA FISH15, die die Hybridisierungskettenreaktion (HCR) nutzt, eine nicht-enzymatische Technik zum Nachweis der Oligosondenbindung16. EASI-FISH wurde zunächst als alternativer Ansatz zu Dünngewebe-FISH entwickelt, um Expressionsmuster von Dutzenden von Genen in dicken (300 μm) Gewebeschnitten des lateralen Hypothalamus der Maus zu kartieren17. Diese Methode ist ideal für die Anwendung auf adulte Fliegengehirne, da dieses Gewebe weniger als 300 μm dick ist und kürzlich ein Prototyp des EASI-FISH-Protokolls für die Fliege beschrieben wurde18. Hier werden präparierte und fixierte Drosophila-Gehirne in ein quellfähiges Hydrogel eingebettet, wobei mRNA und Proteine mit den Alkylierungsmitteln Melphalan-X bzw. Acryloyl-X (Ac-X) kovalent am Gelpolymer verankert sind. Nach dem Proteinverdau, der eine isotrope Expansion des Gehirns ermöglicht, werden genspezifische DNA-Oligosonden im Gewebe mit mRNA hybridisiert, um die interessierenden Transkripte zu lokalisieren. In einem zweiten Hybridisierungsschritt werden dann fluoreszenzmarkierte DNA-Haarnadeln hinzugefügt. Mehrere Haarnadelmoleküle polymerisieren in der HCR-Reaktion zu metastabilen DNA-Polymeren. Dies führt zu einer Verstärkung des Signals für einzelne Transkripte, die als helle Flecken mittels Lichtblatt- oder konfokaler Mikroskopie detektiert werden können.

Die kovalente Verankerung von mRNA und Protein an der Gelmatrix und der proteolytische Verdau von Proteinen nach der Gelbildung schafft eine Umgebung, in der mRNA-Transkripte relativ stabil und potenziell leichter für die Sondenbindung zugänglich sind. Die Stabilität der mRNA und des Gels ermöglicht mehrere Runden der erneuten Sondierung und Bildgebung, wobei DNA-Sonden und HCR-Produkt durch Inkubation mit dem Enzym DNase1 zwischen den Runden entfernt werden können15,17. Darüber hinaus reduziert die Expansion der Probe die Autofluoreszenz und Lichtstreuung durch molekulares De-Crowding und erhöht effektiv die Bildauflösung14. Daher können einzelne mRNA-Transkripte leichter aufgelöst werden.

GFP hält das Verfahren ausreichend aufrecht, um durch Fluoreszenz oder Antikörperbindung nach der Expansion nachweisbar zu bleiben. Daher kann dieser Reporter verwendet werden, um interessante Zellentypen zu markieren und zu segmentieren. In Verbindung mit den vielen verfügbaren neuronenspezifischen split-GAL4-Treiberlinien (z.B. 19,20) eröffnet dies die Möglichkeit, weitere Einblicke in die molekulare Identität eines neuronalen Typs zu gewinnen oder molekulare Subtypen zu identifizieren, die aufgrund ihrer Anatomie nicht ohne weiteres zu unterscheiden sind.

Hier wird eine aktualisierte Version des Prototyps des fly EASI-FISH-Protokolls beschrieben18, das sich durch eine hervorragende mRNA-Retention, die Beseitigung technischer Schwierigkeiten und eine größere Robustheit des Gels auszeichnet. Zu den Modifikationen gehören die Erhöhung der PFA-Konzentration, die Senkung der Fixierungstemperatur und die Erleichterung der Probenvorbereitung durch die Montage der Gehirne vor der Inkubation mit Melphalan-X und Ac-X. Dieses Protokoll enthält auch eine neue Gelrezeptur zur Erhöhung der Gelrobustheit, die Gelschäden bei der Durchführung vieler FISH- und Bildgebungsrunden effektiv reduziert. Diese Modifikationen machen das Protokoll einfacher durchzuführen, verringern sowohl die Verarbeitungszeit als auch den Reagenzienverbrauch und erhöhen das Vertrauen in konsistente Ergebnisse. Wichtig ist, dass die Fähigkeit des Multiplexings so erhöht wird, dass Dutzende von Genen im selben Gehirn über einen Zeitraum von Monaten untersucht werden können. Dies wird durch die Expressionsmuster mehrerer neuronaler Gene im adulten Drosophila-Gehirn über eine Reihe von Expressionsniveaus veranschaulicht.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde an erwachsenen (5-6 Tage alten) Drosophila melanogaster-Weibchen durchgeführt, aber jedes Geschlecht oder jede Drosophila-Art ist anwendbar. Für Rezepturen von Gelankern siehe Ergänzende Tabelle 1; für das Gelrezept Ergänzende Tabelle 2; und für andere EASI-FISH-Reagenzien Ergänzende Tabelle 3. Einen Leitfaden für alltägliche Materialien und Reagenzien finden Sie in der ergänzenden Tabelle 4. Für den Halter von Lichtblattmikroskop-Gelen siehe Ergänzende Datei 1. Abbildung 1A-C zeigt eine schematische Darstellung der Einbettung von Gehirnen in Gele vor der Expansion und Sondenhybridisierung (Schritte 2.1 bis 3.8). Abbildung 1D ist ein Foto des eingebetteten Gehirns, Abbildung 1E zeigt einen Gelhalter für die Lichtblattmikroskopie und Abbildung 1F zeigt die Zeitleiste eines typischen Experiments. Die kommerziellen Details der Reagenzien und der verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissektion und Fixierung des Fliegengehirns

  1. Präparieren Sie Fliegengehirne oder ZNS in kaltem S2-Medium (für weitere Details zur Sektion siehe reference21)
  2. Um das Gehirn zu fixieren, fügen Sie bis zu 20 Gehirne oder 10 ZNS zu 2 ml kaltem 4% PFA/PBS hinzu und inkubieren Sie es über Nacht auf einem Nährstoffator bei 4 °C.
    ACHTUNG: PFA ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird, reizt Haut und Augen und kann krebserregend sein.
  3. Spülen Sie die Probe (1x) mit 2 mL kaltem PBT (0,5 %, siehe Ergänzende Tabelle 4) und waschen Sie die Probe dann 15 Minuten lang mit 2 mL kaltem PBT (4x) auf einem Näher bei 4 °C.
  4. Spülen Sie die Probe (1x) mit 2 mL kaltem 70% EtOH. Lagern Sie das Gehirn in 2 mL 70% EtOH bei 4 °C für bis zu 6 Monate.

2. Montieren von Gehirnen und Hinzufügen von RNA- und Protein-Linkern (Tag 1)

HINWEIS: Tragen Sie immer Handschuhe und wischen Sie Ausrüstung und Arbeitsbereich konsequent mit RNase Away ab. Handschuhe sind erforderlich, um (1) RNasen von Proben fernzuhalten und (2) als Schutz vor mehreren Reagenzien, die eine Gesundheitsgefahr darstellen.

  1. Bereiten Sie die Gelkammern vor, indem Sie einen nicht geladenen Objektträger mit einem RNase-Dekontaminationsreagenz abwischen. Entfernen Sie die undurchsichtige Folie, die den Klebstoff schützt, von der Silikondichtung, kleben Sie die Dichtung (mit bis zu 4 Kammern) auf den Objektträger und beschichten Sie jede Kammeroberfläche mit einer P20-Pipettenspitze mit 1 μl Polylysin. An der Luft trocknen und den Vorgang wiederholen.
    HINWEIS: Schritt 2.1 kann am Vortag durchgeführt werden.
  2. Übertragen Sie das Gehirn in ein 0,2 mL PCR-Röhrchen (bis zu 4 Gehirne pro Röhrchen) und rehydrieren Sie es für (2x) 5 min in 150 μl PBT (0,1%) und (2x) für 5 min in PBS.
  3. Um die Gehirne zu montieren, fügen Sie 40 μl PBS pro Kammer hinzu und kleben Sie dann die Gehirne vorsichtig in einer Reihe in der Mitte der Kammer mit einer feinen Pinzette fest, wobei Sie etwas Platz zwischen den Gehirnen lassen (siehe Abbildung 1D). Die Montage von bis zu 6 Gehirnen oder 2 ZNS pro Kammer ist möglich.
  4. Entfernen Sie PBS und fügen Sie sofort 50 μl 20 mM MOPS-Puffer hinzu. 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  5. Während das Gehirn in MOPS-Puffer äquilibriert, tauen Sie die Melphalan-X- und Ac-X-Stammlösungen auf und bereiten Sie 75 μl Melphalan-X/Ac-X-Lösung pro Kammer vor (Melphalan-X-Stamm 1:1 mit MOPS-Puffer verdünnen und Ac-X im Verhältnis 1:100 hinzufügen). Vortex und Spin kurz, um die Lösung aufzufangen; Planen Sie die Zubereitung so, dass die Lösung am Ende der 30-minütigen Inkubationszeit fertig ist, nicht früher.
    ACHTUNG: Melphalan-X ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird, reizt Haut und Augen und kann krebserregend sein.
  6. Entfernen Sie den gesamten MOPS-Puffer und fügen Sie 50 μl Melphalan-X/AC-X-Lösung hinzu.
  7. Decken Sie die Kammer ab, indem Sie ein Deckglas darauf legen, aber verwenden Sie nicht den Dichtungskleber zum Abdichten. Stellen Sie die Kammer in eine befeuchtete Box und inkubieren Sie sie lichtgeschützt über Nacht bei RT.

3. Gelierung und Proteinase K Verdauung (Tag 2)

  1. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und Melphalan-X/Ac-X und waschen Sie das montierte Gehirn (2x) für 2 min mit 100 μl PBT (0,1%) und (1x) für 2 min mit 100 μl PBS.
  2. TREx-1000-Lösung, 4HT, TEMED und APS auftauen und auf Eis legen.
    HINWEIS: TREx-1000 kann bei -20 °C ausfallen; gut vortexen, um sich nach dem Auftauen vollständig aufzulösen.
    ACHTUNG: Diese Reagenzien sind schädlich oder giftig, wenn sie verschluckt oder eingeatmet werden, sowie Haut- und Augenreizstoffe.
  3. Bereiten Sie die Gellösung vor, indem Sie TREx-1000 mit 4HT, TEMED und APS in einem Verhältnis von 94:2:2:2 mischen. Vortex und auf Eis halten. Bereiten Sie für jede Kammer 150 μl Gellösung vor.
  4. Entfernen Sie PBS mit einer Pipettenspitze aus der Kammer und wischen Sie das restliche PBS vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab. Geben Sie für jede Kammer sofort 40 μl Gellösung auf das Gehirn. Bei 4 °C 10 min inkubieren.
  5. Entfernen Sie die Gellösung und fügen Sie 40 μl frische Gellösung hinzu und inkubieren Sie weitere 10 Minuten lang bei 4 °C.
    HINWEIS: Sammeln Sie die Gelabfalllösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen und polymerisieren Sie sie, bevor Sie sie entsorgen.
  6. Entfernen Sie die Gellösung und ziehen Sie den klaren Schutzfilm vom Oberflächenkleber der Dichtung ab. Fügen Sie abschließend 45 μl frische Gellösung hinzu, legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Kammer und vermeiden Sie es, Luftblasen einzuschließen. Drücken Sie auf das Deckglas, um die Kammer zu verschließen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C (für insgesamt 30 Minuten Äquilibrierung bei 4 °C).
  7. Polymerisieren Sie das Gel bei 37 °C für 1,5 h.
  8. Sobald die Gele fest geworden sind, lassen Sie sie einige Minuten auf der Bank abkühlen. Nehmen Sie vorsichtig das Deckglas ab und entfernen Sie die Silikondichtung mit einer neuen Rasierklinge. Schneiden Sie dann das Gel in ein Rechteck und schneiden Sie die obere rechte Ecke aus, um die Ausrichtung der Probe zu verfolgen.
  9. Entfernen Sie die Gele mit einem feinen Pinsel, der mit einer kleinen Menge ProK Buffer benetzt ist, vom Objektträger und geben Sie sie einzeln in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
  10. Jedes Gel wird über Nacht mit 500 μl ProK-Puffer und 5 μl ProK-Enzym (1:100) bei 37 °C inkubiert.

4. DNA-Verdau und Sondenhybridisierung (Tag 3)

  1. Waschen Sie die Gele (3x) für 10 min mit 1 mL PBS bei RT.
    HINWEIS: Verwenden Sie Transferpipetten mit feiner Spitze, um eine Beschädigung des Gels beim Austausch der Lösungen zu vermeiden.
  2. Die Gele werden 30 Minuten lang in 1 ml DNase1-Puffer bei 37 °C inkubiert.
  3. 50 μl DNase1-Enzym zu 450 μl DNase-Puffer hinzufügen. Vorsichtig mischen, aber nicht verwirbeln. Jedes Gel in 500 μl DNase1 für 2 h 37 °C inkubieren. Waschen (4x) 15 min mit 1 mL PBS bei RT.
    HINWEIS: Gele können in 5x SSC bei 4 °C vor oder nach dem DNase-Aufschluss/-Waschen mehrere Wochen lang gelagert werden.
  4. Auftauhybridisierung (hyb) und Sondenwaschpuffer. Inkubieren Sie die Gele in 500 μl Hyb-Puffer ohne Sonden für 30 min bei 37 °C.
    ACHTUNG: Der Hyb- und der Sondenwaschpuffer enthalten Formamid, das im Verdacht steht, Krebs zu verursachen.
  5. Verdünnen Sie die Sonden 1:100 in Hyb-Puffer (10 nM) und bereiten Sie 300 μl pro Gel vor. Inkubieren Sie die Gele mit Hyb-Puffer und Sonden über Nacht bei 37 °C. Halten Sie den Sondenwaschpuffer und PBS bei 37 °C.

5. Sondenwaschvorgänge (Tag 4)

  1. Waschen Sie die Gele (3x) für 30 min mit 750 μL Sondenwaschpuffer bei 37 °C.
  2. Waschen Sie die Gele (3x) für 30 min, dann (3x) für 1 h mit 1 mL PBS bei 37 °C.
  3. Waschen Sie die Gele in 2 mL PBS bei RT über Nacht oder 4 °C am Wochenende.

6. Hybridisierungskettenreaktion (HCR) mit fluoreszierenden Haarnadeln (Tag 5)

HINWEIS: Für das HCR-Prinzip siehe reference22.

  1. Inkubieren Sie die Gele in 500 μl Amplifikationspuffer (amp) für 30 min bei RT.
  2. Erhitzen Sie die fluoreszierenden Haarnadeln 90 Sekunden lang in einem PCR-Gerät auf 95 °C und kühlen Sie sie 30 Minuten lang schnell auf 25 °C ab.
  3. Verdünnen Sie für jede Sonde übereinstimmende Haarnadelpaare (h1 und h2) 1:50 in Ampere-Puffer und bereiten Sie 300 μl pro Gel und Vortex vor.
  4. Inkubieren Sie die Gele mit der Haarnadelmischung für 3 h bei RT im Dunkeln.
  5. Waschen Sie die Gele (2x) für 15 min mit 750 μL 5x SSCT und (2x) für 30 min mit 1 mL 0,5x SSCT bei RT.
  6. Wenn Gehirne GFP exprimieren, färben Sie sich mit 500 μl Anti-GFP-AF488-Antikörper (1:500) in PBT (0,1 %) mit 5 mg/ml ultrareinem BSA und inkubieren Sie über Nacht (oder über das Wochenende) bei 4 °C.

7. Einbetten von Gelen und Bildgebung (Tag 6)

  1. Spülen Sie die Gele nach der Antikörperinkubation einmal aus und waschen Sie sie (1x) für 30 min mit 1 mL PBT (0,1%), gefolgt von (3x) für 30 min mit 1 mL PBS.
    HINWEIS: Das Waschen in PBS führt zu einer 2-fachen Ausdehnung; für 3x Expansion mit 0,05x SSC waschen.
  2. Beschichten Sie während des Waschens die Gelaufsatzfläche des Lichtblattmikroskop-Gelhalters zweimal mit 1 μl Polylysin und lassen Sie ihn zwischen den Schichten bei 37 °C trocknen. In ähnlicher Weise ist bei der konfokalen Bildgebung der Gelanheftungsbereich einer Glasbodenschale mit wiederholten Anwendungen von Polylysin zu beschichten.
  3. Färben Sie die Gele 30 min lang bei RT in 1 mL 5 μg/mL DAPI/PBS oder DAPI/0,05x SSC oder färben Sie sie alternativ über Nacht bei 4 °C.
  4. Um das Gel auf den Gelhalter (Lichtblattmikroskop) oder die Glasbodenschale (Konfokalmikroskop) zu montieren, legen Sie das Gel auf ein Deckglas und trocknen Sie die Ränder vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab. Stellen Sie sicher, dass das Gel so ausgerichtet ist, dass das Gewebe dem Ziel am nächsten ist. Tragen Sie das Gel mit einem Pinsel in einer Bewegung vorsichtig auf die Polylysin-Oberfläche auf. Für die Bildgebung baden Sie das Gel in PBS (oder 0,05x SSC bei Erweiterung auf 3x).
    HINWEIS: Nach der Bildgebung können die Gele mit einem feuchten Pinsel vorsichtig von der Polylysinoberfläche entfernt und in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt werden.
  5. Für eine sofortige erneute Sondierung fahren Sie mit Tag 7 fort. Für eine längerfristige Lagerung (1 Woche bis 6 Monate) lagern Sie Gele in 1 mL 5x SSC bei 4 °C. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, waschen Sie die Gele (3x) 10 Minuten lang mit 1 mL PBS, bevor Sie fortfahren.
    HINWEIS: Das Ausmaß der Expansion ist in den beschriebenen Puffern im Allgemeinen konsistent (~2x in PBS und ~3x in 0,05x SSC). Um den Expansionsfaktor zu überprüfen, messen Sie die Größe eines Gehirns vor und nach der Expansion in Bildern, die mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop aufgenommen wurden. Um das Gehirn nach der Expansion sichtbar zu machen, färben Sie es kurz mit DAPI. Der ungefähre Expansionsfaktor ist die Größe nach der Expansion geteilt durch die Größe vor der Expansion.

8. Abisolieren von Sonden und Haarnadeln für das Multiplexing (Tag 7)

  1. Inkubieren Sie die Gele 30 Minuten lang in 1 ml DNase1-Puffer bei 37 °C.
  2. 50 μl DNase1 auf 450 μl DNase-Puffer zugeben. Vorsichtig mischen, aber nicht verwirbeln. Inkubieren Sie die Gele in 500 μl DNase1 für 2 h bei 37 °C.
  3. Waschen (4x) für 15 min mit 1 mL PBS bei RT. Die Gele sind nun bereit für die nächste Runde der Hybridisierung (Tag 3, Schritt 6).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Leistungsfähigkeit dieses modifizierten EASI-FISH-Protokolls wird durch den Nachweis der Expression mehrerer verschiedener Neurotransmitter-assoziierter und Neuropeptid-Gene im adulten Drosophila-Gehirn über mehrere Runden demonstriert. Typischerweise wurden gelierte und expandierte Gehirne mit zwei oder drei Sonden pro Runde hybridisiert, gefolgt von HCR mit Haarnadelpaaren, die mit Alexa Fluor (AF) 488 konjugiert waren (es sei denn, GFP wurde exprimiert), AF546 und AF647 oder Janelia Fluor (JF) 669. Die Bi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das beschriebene EASI-FISH-Protokoll für das intakte Drosophila-Nervensystem ermöglicht den Nachweis von Dutzenden von Transkripten im selben Gehirn oder ZNS. Es ist robust, unkompliziert und empfindlich und kann mit der GFP-Detektion kombiniert werden, um Untergruppen von Neuronen oder Gliazellen zu identifizieren. Da diese Methode einfach zu implementieren ist, sollte sie die Forschung von Drosophila-Labors erleichtern, die an der Kartierung und Quantifizierung der Genexpression im intakten Fliegengeh...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Paul Tillberg für Ratschläge zur Dynamik der Expansionsmikroskopie, Christina Christoforou für die Hilfe bei der Hirnsektion und Geoffrey Meissner für kritisches Feedback. Wir danken außerdem Tanya Wolff und Gerry Rubin sowie Geoffrey Meissner und Wyatt Korff für die Erlaubnis, Ergebnisse einzubeziehen, die im Rahmen von zwei größeren Studien erstellt wurden. Alle Arbeiten wurden auf dem Janelia Research Campus durchgeführt und vom Howard Hughes Medical Institute mit Mitteln für die MultiFISH- und Fly-eFISH-Projektteams, Gerry Rubin und Project Technical Resources unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 mL PCR-Röhrchen USA Wissenschaftlich 1402-4700
0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, AmberUSA Scientific  1405-9707
0,5 M EDTA, PH 8, RNasefreiesInvitrogenAM9260G
10 M NaOHSigma72068
10x PBS FisherBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40% AcrylamidBio-Rad1610140
4-Hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma176141
5 M NaCl RNase-frei ThermofisherAM97060G
5 ml Transferpipette - Feine SpitzeGlobal Scientific134070-S20
6-Well-Glasbodenplatte CellvisP06-1.5H-N
Acetonitril, wasserfrei  ThermoFisher042311-K7
AcrylsäureTCIA0141
Acryloyl-X ThermoFisherA20770
Ammoniumpersulfat (APS)SigmaA3678
Amplifikationspuffer Molekulare Instrumentehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
wasserfreies DMSOInvitrogenD12345
AstA_B2Molekulare InstrumentePRR477
ChAT_B1Molekulare InstrumentePRG115
Crz_B5Molekulare InstrumentePRR480
DAPISigmaD9542
FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2Molecular InstrumentsPRR487
GAD1_B5Molecular InstrumentsRTE581
GFP Polyklonaler Antikörper, Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
HybridisierungspufferMolecular Instruments
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris ViewerOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
MOPs PufferFisherBP308-100
N,N Methylen-Bis-acrylamid  Bio-Rad1610142
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)SigmaT22500
Nukleasefreies Wasser AmbionAM9932
Oligo-Sonden Molekulare Instrumentehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Paraformaldehyd (PFA)EMS15710
PBSFisher 
Photoflo-200 EMS74257
Poly-L-Lysinhydrobromid (Polylysin)SigmaP1524
SondenwaschpufferMolekulare Instrumentehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Proteinase K NEBP8107S
QIAquick NukleotidentfernungskitQiagen28306
RNase weg ThermoFisher7003, Dekontaminationsreagenz
RNase-frei DNase1Qiagen79254
S2 MediumThermoFisher21720024
Silikondichtungen InvitrogenP24743
Tdc2_B5Molecular InstrumentsRTE880
Tk_B5Molecular InstrumentsPRR484
UltaPure 10% SDSThermofisher15553027
Ultrapure BSAThermoFisherAM2616
Unkonjugierte und Alexa Fluor-konjugierte HaarnadelnMolecular Instruments
VAChT_B1Molecular InstrumentsRTA904
vGLUT_B2Molecular InstrumentsRTB212
Zeis Z7 Gelhalter Janelia CAD-Dateien auf Anfrage
Zeiss LSM 980 konfokales InversmikroskopZeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 LichtblattmikroskopZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fishBP24384https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fisherhältlich

References

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