Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schrittweise Methode zur Analyse der Atmungsmechanik eines ex vivo Mausmodells unter Verwendung der erzwungenen Oszillationstechnik (FOT).
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Methodenartikel
Evaluierung der Lungenfunktion in einem ex vivo Mausmodell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Atmungsmechanik ist ein Schlüsselgebiet bei der Definition und Behandlung von Lungenpathologien durch die Beurteilung der funktionellen Lungenkapazität. Die Lungenmechanik kann durch verschiedene Lungenmanöver bewertet werden, die unterschiedliche oszillatorische Wellenformen beinhalten. Wenn diese Manöver auf die Lunge angewendet werden, messen sie mehrere Variablen wie Druck, Volumen und Durchfluss, basierend auf der Reaktion auf die Wellenformen. Diese Signale werden dann berechnet und analysiert, um Parameter wie Hysterisivität, Widerstand, Compliance, Gewebedämpfung und Gewebeelastizität zu bestimmen und eine detaillierte Bewertung der Gesamtlungenfunktion zu ermöglichen. Die Analyse der Atemmechanik ist besonders wichtig bei der Bewertung von Spenderlungen für eine Lungentransplantation. Das vorliegende Protokoll ist das erste seiner Art und bietet eine umfassende und reproduzierbare schrittweise Methode zur Beurteilung der Atmungsmechanik unter Verwendung eines ex vivo Mausmodells. Es enthält Details über das ausgewählte Tiermodell, die Wiederherstellung, Lagerung und Konservierung der Lunge sowie Experimente mit einem auf der Technik der erzwungenen Oszillation basierenden System. Darüber hinaus werden die Datenanalyse, die klinische Bedeutung und die Anwendungen der Technik der erzwungenen Oszillation bei der Untersuchung eines ex vivo-Modells skizziert.
Einleitung
Die Lungentransplantation ist die einzige dauerhafte Behandlung von Lungenerkrankungen im Endstadium. Weltweit erhalten jedes Jahr etwa 4.600 Menschen eine Lungentransplantation, aber fast 600 Patienten sterben auf der Warteliste aufgrund des Mangels an geeigneten Spenderlungen 1,2. In dem Bestreben, den Pool der verfügbaren Lungen zu vergrößern, werden die Zuteilungssysteme für Spender kontinuierlich angepasst, was dazu geführt hat, dass Chirurgen größere Entfernungen zurücklegen müssen, um Spenderorgane zu sichern3. Die vergrößerten Abstände erhöhen unweigerlich die kalte ischämische Zeit, was einen Bedarf an zusätzlichen Methoden zur Organkonservierung darstellt.
Der derzeitige Standard für die Konservierung von Spenderorganen bei Lungentransplantationen ist die kalte statische Konservierung bei 4 °C, wodurch die Konservierungszeit auf 6-8 h begrenzt wird - ein kleines Zeitfenster für die Lebensfähigkeit der Transplantation4. Angesichts der längeren Transportstrecken und der daraus resultierenden verlängerten ischämischen Zeiten ist die Beurteilung der Lungenfunktion vor der Transplantation jedoch von entscheidender Bedeutung4. Mit der Weiterentwicklung der Richtlinien für Lungentransplantationen wurden neue Forschungsarbeiten durchgeführt, um diesem Bedarf gerecht zu werden. Kürzlich haben Studien gezeigt, dass die kalte statische Konservierung bei 10 °C eine optimalere Lagertemperatur für die Lungenkonservierung ist, was zu einer Verbesserung der Lungenfunktion, der Widerstandsfähigkeit gegen Verletzungen und vergleichbaren Raten der primären Transplantatdysfunktion bei der Implantation führt 4,5,6,7,8. Darüber hinaus hat die Forschung, die sich auf die ex vivo Lungenperfusion (EVLP) konzentriert, eine signifikante Verbesserung der Nutzung der Spenderlunge und der Transplantationen ohne Nachteile für die Empfänger gezeigt9. Während die Verwendung von EVLP zur Erweiterung des Spenderpools für Lungentransplantationen und zur Verlängerung der Konservierungszeit gut dokumentiert ist, ist diese Technologie teuer, zeitintensiv und erfordert eine spezielle Schulung, um sie durchzuführen10. Daher besteht ein Bedarf an zusätzlichen Methoden zur Untersuchung der Ex-vivo-Lungenfunktion, die umfassend, kostengünstig und reproduzierbar sind.
Traditionelle Messungen der Lungenmechanik, z. B. Compliance-, Widerstands-, Elastanz- und Druck-Volumen-Kurven, können zuverlässig mit Hilfe der Körperplethysmographie oder mit Beatmungstechniken unter Verwendung eines Einkompartimentmodells bestimmt werden. Eine detailliertere Mechanik kann mit dem Modell der erzwungenen Oszillation erhalten werden, um das Modell der konstanten Phase anzupassen, das die Atemwegsmechanik in zentrale und periphere Kompartimente (Newtonscher Widerstand, Gewebedämpfung/-elastizität, Hysteresivität) unterteilen kann11. Während die Anwendung dieser Techniken reproduzierbar und umfassend ist, bestand eine Einschränkung bisher darin, dass solche Messungen in einem in-vivo-Modell durchgeführt werden mussten, vermutlich da die exsanguinierte Lunge am alveolären Eintrittsring12 an Struktur verliert. In dieser Studie wurde ein kommerziell erhältliches Beatmungsgerät für kleine Nagetiere verwendet, das auf der Technik der erzwungenen Oszillation basiert, mit dem Ziel, ein ex vivo-Modell zu entwickeln, um die Lungenmechanik für Lungentransplantationsanwendungen besser zu charakterisieren.
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Protokoll
Diese Studie wurde vom Committee on Animal Research in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Es wurden C57Bl/6-Wildtyp-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 18 und 28 g verwendet. Einzelheiten zu den Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung
- Verwenden Sie für alle chirurgischen Eingriffe ein Operationsmikroskop mit bis zu 20-facher Vergrößerung.
- Reinigen und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen. Autoklaven Sie Instrumente oder verwenden Sie eine geeignete Sterilisationslösung, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
2. Entnahme von Spenderlungen
- Führen Sie alle Vorgänge unter sterilen Bedingungen durch.
HINWEIS: Dieser Schritt wird in einem speziellen Operationssaal und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. - Setzen Sie die Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer und leiten Sie eine Anästhesie mit 5 % Isofluran in Sauerstoff ein und halten Sie die Anästhesie mit 3,5 % Isofluran in Sauerstoff während des gesamten Eingriffs aufrecht (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
- Erfassen Sie das Gewicht der Maus vor dem ersten Schnitt.
- Befestigen Sie die Maus auf dem Operationstisch und sorgen Sie für die richtige Narkosetiefe, indem Sie Druck auf einen Zeh ausüben. Wenn sich die Maus vor Schmerzen zurückzieht, erhöhen Sie die Anästhesie nach Bedarf.
- Entnehmen Sie dem Spender die Lunge nach dem Standardverfahren13.
HINWEIS: Die Lunge und das Herz wurden en block extrahiert, um die Lunge ex vivo zu perfundieren, und ein Teil der Luftröhre wurde für eine spätere Intubation entfernt.
3. Lagerung und Konservierung der Lunge
- Sobald die Lunge aus dem Spender entnommen wurde, intubieren Sie die Luftröhre mit einem intravenösen 18-G-Angiokatheter, indem Sie den Katheter vorsichtig vorschieben und sicherstellen, dass er die Luftröhre nicht durchsticht.
- Befestigen Sie die Luftröhre mit einer 3-0-Seidennaht über der Kanüle, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Schieben Sie den intravenösen 18-G-Angiokatheter vor, bis er sich im rechtsventrikulären Ausflusstrakt (RVOT) befindet, direkt hinter der Pulmonalklappe.
- Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Lunge aus dem Körper entfernt wurde.
- Lagern Sie die Lunge über Nacht in einem konischen 50-ml-Röhrchen, das die handelsübliche Konservierungslösung bei 4 °C oder 10 °C enthält.
4. Einrichtung und Kalibrierung
- Beginnen Sie mit dem Einschalten des Systems und/oder der Software.
- Starten Sie das Programm, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Studie erstellen und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um das Protokoll zu definieren und Probanden zuzuweisen.
- Klicken Sie auf Experimentiersitzung und melden Sie sich mit den ersten und letzten Initialen des Benutzers an.
- Beginnen Sie mit der Bezeichnung von Themen nach einer einheitlichen Benennungskonvention.
- Geben Sie die Informationen zu Geschlecht, Geburtsdatum und Gewicht der einzelnen Personen ein.
- Wählen Sie Probanden aus, weisen Sie sie der Messstelle zu und bestätigen Sie die Gewichtungen.
- Fahren Sie mit der Einrichtung und Kalibrierung der Software fort, indem Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen.
HINWEIS: Während der Kalibrierung des Schlauchs wurde derselbe Kanülentyp, der bei der Intubation der Spenderlunge verwendet wurde, an den Y-Schlauch des Systems befestigt, um die Konsistenz zu gewährleisten. - Wiederholen Sie die Kalibrierung, wenn die Kalibrierungswerte außerhalb der akzeptierten Bereiche liegen.
- Brechen Sie die Aufforderungen ab, um die Beatmung zu starten, bis sie bereit ist. Experimentelle Sitzungen mit Lüftung und Datenaufzeichnung können nachträglich initiiert werden.
5. Lungenbeatmung und Datenerfassung
- Entfernen Sie die Lunge aus dem konischen 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie den rechtsventrikulären Ausflusstrakt (RVOT) mit dem zuvor platzierten intravenösen 18-G-Angiokatheter mit einer zusätzlichen Konservierungslösung in einer Dosis von 60 ml/kg, um die Lungenkapillaren zu spülen.
HINWEIS: Es muss große Sorgfalt walten gelassen werden, um eine Dehydrierung der Spenderlunge zu vermeiden, da dies ein bekannter Störfaktor bei der Erforschung der Lungenmechanik ist. - Befestigen Sie die Spenderlungen an der Beatmungsmaschine und beginnen Sie mit dem Experiment.
- Klicken Sie auf Beatmung starten, und wenn Sie fertig sind, drücken Sie Aufnahme starten , um die experimentelle Sitzung zu starten.
HINWEIS: Das für diese Studie verwendete Beatmungsgerät war auf eine Atemfrequenz von 150 Atemzügen/min, ein Atemzugvolumen von 10 ml/kg und einen PEEP von 3 eingestellt. - Führen Sie jede Aufgabe aus, indem Sie in der Aufgabenliste auf der rechten Seite auf die Aufgabe zur Beurteilung der Lungenmechanik doppelklicken.
- Führen Sie die Aufgabe Tiefes Aufblasen aus, die sich in der Aufgabenliste befindet, um sicherzustellen, dass atelektatische Regionen rekrutiert und Lungenvolumina standardisiert wurden. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Ergebnisse.
- Fahren Sie mit der Reihenfolge der Aufgaben fort.
HINWEIS: Die Lungenfunktion kann durch mehrere Aufgaben zur Bewertung der mechanischen Eigenschaften beurteilt werden. Deep Inflation standardisiert das Lungenvolumen, während Prime-8 die Lungenmechanik stabilisiert. PV-P und PV-V messen die statische und dynamische Nachgiebigkeit, den Atemwegswiderstand und den Leitwert. Snapshot 150 bietet eine schnelle Bewertung von Widerstand, Compliance und Elastanz, während QuickPrime den Atemwegs- und Gewebewiderstand zusammen mit der Viskoelastizität der Lunge bewertet. Diese Aufgaben sorgen zusammen für eine umfassende Analyse der Lungenfunktion. In diesem Artikel werden die Daten für die Aufgaben, die in Deep Inflation, Snapshot 150 und QuickPrime (mit kommerziell erhältlichen Geräten) ausgeführt wurden, als repräsentative Ergebnisse bereitgestellt. Die Lungenvolumina wurden zwischen den Störungen mit der Aufgabe "Deep Inflation" standardisiert, um Störvariablen bei der Interpretation der Daten zu minimieren. - Führen Sie die ausgewählte Abfolge von Aufgaben in dreifacher Ausführung aus.
- Klicken Sie auf Aufzeichnung stoppen und dann auf Lüftung stoppen.
- Exportieren Sie die Daten einzeln oder fahren Sie mit dem nächsten Thema fort und wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.9.
HINWEIS: Für Daten, die aus den Störungen von Snapshot 150 und QuickPrime abgeleitet wurden, ist für eine zuverlässige Analyse ein CSB von >0,95 erforderlich.
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Ergebnisse
Für das Mausmodell wird eine grafische Darstellung des Versuchsaufbaus bereitgestellt (Abbildung 1). Die Lungen wurden mit einem kommerziell erhältlichen Beatmungssystem für kleine Nagetiere aufgeblasen, um die Atmungsmechanik des Spendergewebes unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen (Abbildung 2). Beim Vergleich der Ergebnisse zwischen den Gruppen der konservierten Spenderlungen zeigte sich, dass Gruppen von Spenderlungen, die bei 10 °C gelagert wurden, ...
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Diskussion
Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten
Die Atemmechanik wird routinemäßig in verschiedenen Anwendungen eingesetzt, um Lungenpathologien und Lungenverletzungen zu untersuchen. Die Erforschung der Atemmechanik wurde viele Male für das Fortschreiten von Krankheiten wie ARDS und bei assistierter Beatmung beschrieben, aber in der Literatur weit weniger beschrieben, da sie sich auf Organtransplantationen bezieht 15,16,17,18,19.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als Interessenkonflikt missverstanden werden könnten.
Danksagungen
Die Autoren danken Sophie Paczensy für den Einsatz des Beatmungssystems und Colin Welsh für seine Unterstützung. Abbildung 1 wurde mit biorender.com erstellt. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des South Carolina Clinical and Translational Institute (NIH/National Center for Advancing Translational Sciences) unter der Fördernummer UL1-TR001450 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 18 G Angiokatheter | B. Braun | 4251687-02 | Gerade Nabe |
| 24 G Angiokatheter | B. Braun | 4251601-02 | Gerade Nabe |
| 3 mL Spritze | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 Seidennaht | Medex | ETH-A304H | |
| 50 mL konische Schläuche | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70% EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anästhesie-Induktionskammer | Harvard Apparatus | 75-2030 | Luftdichte Induktionskammer für Ratten |
| Anästhesiegerät | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobiles Anästhesiesystem mit passiver Spülung |
| Anästhesiemaske | Harvard Apparatus | 59-8255 | Ratten-Anästhesiemaske |
| Stumpfe Mikrozange | Welt Precision Instruments | 501217 | Abrichtzange, 12,5 cm, gerade, gezahnt |
| C57Bl/6 Mäuse | Charles River | Stammcode 027 | Wildtyp, 6-8 Wochen, 18-28g |
| Digitale Waage | Fisher Scientific | S72422 | |
| FlexiVent System | Scireq | NC2926059 | auf der Basis der Zwangsoszillationstechnik für kleine Nagetiere |
| Insulinspritze, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Isofluran, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Operationsmikroskop oder chirurgische Lupen | AmScope | SM-3BZ-80S | 3,5x - 90x Stereomikroskop |
| Perfadex-Lösung | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Petrischalen | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Sterile Wattestäbchen | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile Mullschwämme | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Chirurgische Schere | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Schere |
Referenzen
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