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Methodenartikel

Nachweis der Empfindlichkeit und Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten bei Mycobacterium tuberculosis mittels Resazurin-Mikrotiter und Schachbrett-Assay

918 Ansichten

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DOI:

10.3791/67672

⸱

24. Oktober 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung und Standardisierung des Resazurin-Mikrotiter-Assays (REMA) und seiner Schachbrettvariation zur Bewertung der Arzneimittelempfindlichkeit und der Interaktionsprofile von Mycobacterium tuberculosis vor. Diese Methode liefert in vitro Erkenntnisse zur Optimierung von Medikamentenkombinationen für den Einsatz in Behandlungsschemata und zur Bekämpfung multiresistenter Tuberkulose.

Zusammenfassung

Das Auftreten der multiresistenten Tuberkulose (MDR-TB) erfordert schnelle und genaue Methoden zur Empfindlichkeit von Arzneimitteln (DST), um eine wirksame Behandlung zu ermöglichen. In dieser Studie wird eine Methodik vorgestellt, die den Resazurin-Mikrotiter-Assay (REMA) und den Schachbrett-Assay kombiniert, um die minimale Hemmkonzentration (MIC) zu bestimmen und die Wechselwirkungen von Anti-Tuberkulose-Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis zu bewerten. Der REMA, der an ein 96-Well-Format angepasst ist, nutzt die Reduktion des Resazurin-Farbstoffs durch metabolisch aktive M. tuberculosis als visuellen Indikator für die Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln. Unterschiedliche Konzentrationen von Anti-TB-Medikamenten werden gegen M . tuberculosis-Isolate getestet, und Farbveränderungen werden beobachtet, um die MHK zu bestimmen. Anschließend wird ein Schachbrett-Assay eingesetzt, um potenzielle synergistische, additive oder antagonistische Effekte zwischen Arzneimittelkombinationen zu bewerten. Diese einfache und kostengünstige Methode liefert innerhalb von sieben Tagen Ergebnisse und bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen DST-Methoden. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die DST von M. tuberculosis-Isolaten und erleichtert die Identifizierung vielversprechender Wirkstoffkombinationen für verbesserte Behandlungsergebnisse gegen MDR-TB.

Einleitung

Die durch Mycobacterium tuberculosis verursachte Tuberkulose (TB) stellt nach wie vor eine gewaltige globale Gesundheitsherausforderung dar, die durch das Auftreten arzneimittelresistenter Stämme noch verschärft wird. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gab es im Jahr 2023 schätzungsweise 10,6 Millionen neue TB-Fälle und 1,3 Millionen Todesfälle, was den dringenden Bedarf an wirksameren diagnostischen und therapeutischen Strategien unterstreicht1. Multiresistente Tuberkulose (MDR-TB) und extensiv resistente Tuberkulose (XDR-TB) stellen aufgrund der Komplexität, Toxizität und verlängerten Dauer der derzeitigen Behandlungsschemata große Herausforderungen für die Krankheitsbekämpfungdar 2,3.

Die kürzliche Einführung neuartiger Anti-TB-Wirkstoffe wie Bedaquilin und Delamanid, die auf einzigartige biochemische Signalwege bei M. tuberculosis abzielen, stellt einen Durchbruch in der TB-Behandlung dar 4,5. Diese Medikamente wurden in erster Linie für die Anwendung bei Fluorchinolon- und Rifampicin-resistenter TB im Rahmen der von der WHO empfohlenen längeren und kürzeren MDR-TB-Therapien zugelassen 6,7. Die Bestimmung optimaler Wirkstoffkombinationen und Dosierungsschemata, insbesondere wenn diese Wirkstoffe in Verbindung mit etablierten Therapien eingesetzt werden, bleibt jedoch ein kritisches Untersuchungsgebiet 8,9. Aktuelle Methoden für Arzneimittelempfindlichkeitstests (DST) sind zwar zuverlässig, aber oft zeit- und ressourcenintensiv und unpraktisch für die Bewertung komplexer Arzneimittelkombinationen in einem klinischen oder Forschungsumfeld10. Dies unterstreicht den Bedarf an einfachen, skalierbaren phänotypischen Assays, die sowohl die Wirksamkeit als auch die Interaktionsprofile von Medikamenten bei M. tuberculosis bewerten können.

Unter diesen phänotypischen Ansätzen hat sich der Resazurin-Mikrotiter-Assay (REMA) als weithin akzeptierte und konventionelle Methode zur Beurteilung der Empfindlichkeit von Arzneimitteln herausgestellt. Der Assay basiert auf der Reduktion des blauen Resazurin-Farbstoffs zu rosa Resorufin durch metabolisch aktive Bakterien, die als visueller Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen dienen. Obwohl das Prinzip der Verwendung von Resazurin zur Beurteilung des Bakterienwachstums von Palomino et al. im Jahr 2002 populär gemacht wurde11, geht es auf die Arbeit von Pital et al. zurück 12. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die REMA-Methode umfassend validiert und in die Standardarbeitsanweisungen für die Mykobakterienforschung und diagnostische Tests aufgenommen 13,14,15.

Ergänzend zum REMA erweitert der Schachbrett-Assay, wie er von Caleffi-Ferracioli et al. eingeführt wurde, den Nutzen von REMA, indem er Interaktionsstudien mit zwei Arzneimitteln in einem Mikrodilutionsformat unter Verwendung desselben Resazurin-basierten Messwerts ermöglicht16. Obwohl diese Methode prinzipiell vielversprechend ist, bleibt sie in erster Linie ein Forschungsinstrument, das für das Screening potenzieller synergistischer oder antagonistischer Wirkstoffkombinationen während der frühen präklinischen Bewertung nützlich ist, und nicht als routinemäßiger diagnostischer Assay.

In diesem Manuskript werden REMA oder seine Schachbrettvariante nicht als neuartige Methoden vorgestellt. Vielmehr ist das Ziel dieser Arbeit, eine nützliche und validierte Methodik zur MHK-Bestimmung und Arzneimittelwechselwirkungsprüfung visuell darzustellen, die in früheren Studien beschrieben und erfolgreich angewendet wurde. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit detaillierten Anleitungen zur Inokulumvorbereitung, zur Wirkstofftitration, zum Plattenlayout, zur MHK-Interpretation und zur Schachbrett-Interaktionsanalyse. Dieses Manuskript zielt darauf ab, eine breitere und konsistentere Verwendung von REMA- und Schachbrett-Assays in der TB-Arzneimittelentwicklung und experimentellen Pharmakologie zu unterstützen.

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Protokoll

HINWEIS: Die in den Beispielexperimenten verwendeten Chemikalien und Materialien sind in der Datei mit der Materialtabelle verfügbar.

1. Vorbereitung der 7H9-S Medien

  1. Für 100 ml 7H9-S-Medien werden 0,47 g 7H9-Pulver und 0,1 g Casiton gewogen und dann in 90 ml destilliertem Wasser gelöst. Rühren, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
  2. Die Brühe wird in einem 250-ml-Kolben im Autoklaven bei 121 °C 15 Minuten lang sterilisiert.
  3. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen fügen Sie 10 ml Ölalbumin-Dextrose-Katalase (OADC) und 0,5 ml Glycerin hinzu.
  4. Über Nacht bei 37 °C inkubieren, um die Sterilität zu überprüfen.
    HINWEIS: Die Sterilität des vorbereiteten 7H9-S-Mediums wird durch Inkubation über Nacht bei 37 °C überprüft. Das Medium sollte am nächsten Tag klar bleiben, ohne dass eine Trübungen beobachtet werden.
  5. Lagern Sie das Medium 7H9-S bei 4 °C und vor direktem Licht schützen.

2. Vorbereitung des M.tuberculosis Inokulums

  1. Präparation eines Inokulums aus M. tuberculosis-Kultur , gezüchtet auf festem Medium von Lowenstein Jensen (LJ)
    1. Entnehmen Sie mit einer sterilen Impföse eine vollständige Öse der M. tuberculosis-Kultur von einem frisch gewachsenen (21-28 Tage alten) LJ-Medium.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es sorgfältig, zu tief in das Medium einzudringen, da dies ältere Völker stören könnte.
    2. Geben Sie die gesammelten Bakterien in eine sterile Bijouflasche mit sterilen Glasperlen und 2,5 ml 7H9-S-Brühe. Stellen Sie sicher, dass die Glasperlen beim mechanischen Aufbrechen von Klumpen während des Vortexens helfen.
      HINWEIS: Frische Kulturen zwischen 21 und 28 Tagen sind unerlässlich, um zuverlässige Empfindlichkeitstestergebnisse zu gewährleisten. Vermeiden Sie die Verwendung älterer Kulturen, da diese zu inkonsistenten Ergebnissen führen können.
    3. Sichern Sie die Bijouflasche und wirbeln Sie sie mindestens 1 Minute lang kräftig ein. Stellen Sie sicher, dass Sie kontinuierlich mischen, um bakterielle Klumpen aufzubrechen, was zu einer relativ trüben Suspension führt. Ziel ist eine homogene Verteilung der Bakterien im Medium.
    4. Die Kultursuspension in eine frische Bijouflasche umfüllen und 15 min ungestört ziehen lassen. Dieser Schritt ermöglicht es den größeren Bakterienklumpen, sich am Boden abzusetzen.
    5. Anhand des McFarland 1.0 Standards wird die Trübung der Kultursuspension überprüft und mit 7H9-S-Bouillon eingestellt, bis die gewünschte Trübung erreicht ist.
      HINWEIS: Als Referenz für eine Trübung, die etwa 1,97 × 106 KBE/ml17 entspricht, wird ein McFarland-Standard, typischerweise 1,0, verwendet. Der Standard wird durch die Kombination von 0,1 mL 1 % Bariumchlorid und 9,9 1 mL 1 % Schwefelsäure hergestellt, was zu einem feinen Niederschlag von Bariumsulfat führt, der für die Trübungen sorgt. Die bakterielle Suspension wird visuell mit dem McFarland-Standard verglichen, indem beide Röhrchen auf einen weißen Hintergrund mit schwarzen Linien gehalten werden. Die Trübung der Bakteriensuspension wird an die Norm angepasst.
  2. Vorbereitung des Inokulums aus der M.tuberculosis-Kultur , die in einem flüssigen Medium 7H9 gezüchtet wurde
    1. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipette 2,5 ml M . tuberculosis-Kultur (2-3 Wochen alt) in eine frische Bijouflasche mit Glasperlen.
    2. Die Mischung mindestens 1 Minute lang aufwirbeln, um eine homogene Suspension zu gewährleisten. Die Vortex-Wirkung hilft, eventuelle Klumpen zu lösen.
    3. Füllen Sie die 2,5 mL der Kultursuspension in eine frische Bijouflasche und lassen Sie sie 15 Minuten lang stehen, damit sich die Klumpen am Boden absetzen können.
    4. Vergleichen Sie die Trübung mit dem McFarland 1.0 Standard und stellen Sie sie mit 7H9-S-Brühe ein, um die erforderliche Konzentration zu erreichen.
  3. Verdünnung des Inokulums
    1. Bereiten Sie eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 vor: Um das Inokulum zu verdünnen, fügen Sie 1 ml der Bakteriensuspension zu 9 ml 7H9-S-Brühe in einem sterilen Behälter hinzu (dies ergibt ungefähr 1,97 × 105 KBE/ml).

3. Vorbereitung der Antibiotika und Lagerung

  1. Herstellung von Stamm- und Arbeitslösungen: Bereiten Sie die im Beispielexperiment verwendeten Arzneimittel zusammen mit ihren Methoden zur Herstellung von Stamm- und Arbeitslösungen vor, wie in Tabelle 1 zusammengefasst.
    1. Isoniazid (INH oder I): Zur Herstellung einer 1 mg/ml-Stammlösung von Isoniazid lösen Sie 2 mg Isoniazidpulver in 2,0 ml destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter.
    2. Moxifloxacin (MOX oder M): Zur Herstellung einer 1 mg/ml-Stammlösung von Moxifloxacin lösen Sie 2 mg Moxifloxacin-Pulver in 2,0 ml destilliertem Wasser auf. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter.
    3. Bedaquilin (BDQ oder J): Bedaquilin ist schwer wasserlöslich. Zur Herstellung einer 1 mg/ml-Stammlösung lösen Sie 2 mg Bedaquilinpulver in 2,0 mL DMSO. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter.
    4. Delamanid (DEL oder D): Ähnlich wie Bedaquilin hat Delamanid eine schlechte Wasserlöslichkeit. Um eine 1 mg/ml-Stammlösung herzustellen, lösen Sie 2 mg Delamanid-Pulver in 2,0 mL DMSO auf. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter.
  2. Lagerung: Aliquotieren Sie 100 μl jeder Wirkstoff-Stammlösung in sterile Kryoröhrchen und lagern Sie diese bis zu 3 Monate lang bei -20 °C. Nach dem Auftauen die restliche Lösung entsorgen. Nicht wieder einfrieren.

4. Herstellung der Resazurin-Lösung und Lagerung

  1. Resazurin bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % oder 0,02 % in destilliertem Wasser auflösen. Die Lösung zur Sterilisation durch einen 0,2 μm Filter filtrieren.
  2. Lagern Sie die sterilisierte Resazurin-Lösung bis zu 1-2 Wochen lang bei 4 °C lichtgeschützt, um eine Degradation zu verhindern.

5. Vorbereitung der REMA-Platte

HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie eine visuelle Anleitung zum Aufbau der REMA 96-Well-Mikrotiterplatte. Die 96-Well-Platte bietet ausreichend Platz, um Wirkstoffassays für jedes Medikament in sechs zweifachen Verdünnungen in doppelter Ausführung durchzuführen.

  1. 7H9-S-Brühe hinzufügen: Mit einer Mehrkanalpipette 100 μl 7H9-S-Brühe in die Spalten 2-11, Reihen B-G geben. Stellen Sie sicher, dass die Verteilung gleichmäßig über alle Wells erfolgt.
  2. Wirkstofflösungen hinzufügen: Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung INH in die Vertiefungen B2 und B6. Fügen Sie auf ähnliche Weise die MOX-, DEL- und BDQ-Arbeitslösungen zu ihren jeweiligen Wells hinzu (B3 und B7, B4 und B8, B5 und B9).
  3. Verdünnen Sie die Wirkstoffkonzentrationen: Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette zweifache serielle Verdünnungen von den Reihen B bis G (Spalten 2-9) durch und stellen Sie sicher, dass die letzten 100 μl nach dem Mischen in Reihe G verworfen werden.
  4. Vertiefungen zur Wachstumskontrolle: Geben Sie 100 μl 7H9-S-Bouillon in die Vertiefungen B10 und C10 für die Wachstumskontrolle.
  5. Negativ- und Sterilitätskontrollen: Geben Sie 200 μl 7H9-S-Bouillon in die Vertiefungen B11 und C11, die als Negativ- und Sterilitätskontrollen dienen.
  6. Verdunstung verhindern: Geben Sie 200 μl steriles destilliertes Wasser in alle äußeren Vertiefungen, um die Verdunstung während der Inkubation zu minimieren.
  7. Impfplatten: Beimpfen Sie jede Vertiefung mit 100 μl der 1:10 verdünnten Kultursuspension, mit Ausnahme der Vertiefung der Negativkontrolle. Stellen Sie eine gleichmäßige Inokulation in allen Vertiefungen sicher.
  8. Versiegeln und inkubieren: Verschließen Sie die Platten in Plastiktüten, um die Sterilität zu erhalten, und inkubieren Sie 7 Tage lang bei 37 °C.

6. REMA-Schachbrett-Titrationsassay

HINWEIS: In Abbildung 2A, B finden Sie eine visuelle Anleitung auf der REMA-Schachbrett-Titrationsassay-Vorlage für Arzneimittelkombinationen (z. B. BDQ und DEL).

  1. Arzneimittel vertikal und horizontal verdünnen: Verdünnen Sie das erste Arzneimittel (BDQ) vertikal (Zeilen B-H) und das zweite Arzneimittel (DEL) horizontal (Spalten 2-8), um verschiedene Kombinationen aus zwei Arzneimitteln zu erzeugen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die seriell verdünnte Arbeitslösung in einem sterilen Fläschchen (von 4 μg/ml bis 0,06 μg/ml) für ein horizontal verdünntes Arzneimittel vor.
  2. BDQ-Arbeitslösung für die vertikale Verdünnung hinzufügen: 100 μl der BDQ-Arbeitslösung in die Vertiefungen B2 und B8 geben.
  3. 7H9-S-Brühe hinzufügen: Mit einer Mehrkanalpipette 50 μl 7H9-S-Brühe in die Spalten C2-H8 geben. Stellen Sie sicher, dass die Verteilung gleichmäßig über alle Wells erfolgt.
  4. Verdünnen Sie die Wirkstoffkonzentrationen: Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette zweifache Verdünnungen aus den Reihen B-H (Spalten 2-8) durch, wobei Sie darauf achten, dass die letzten 50 μl nach dem Mischen in Reihe H verworfen werden.
  5. DEL-Arbeitslösung zur horizontalen Verdünnung hinzufügen: Geben Sie seriell verdünnte Arbeitslösungen der Arzneimittel von 4 μg/ml bis 0,06 μg/ml in die entsprechenden Vertiefungen.
  6. Vertiefungen zur Wachstumskontrolle: Geben Sie 100 μl 7H9-S-Brühe in die Vertiefungen B9 und C9 für die Wachstumskontrolle.
  7. Negativ- und Sterilitätskontrollen: Geben Sie 200 μl 7H9-S-Bouillon in die Vertiefungen B10 und C10, die als Negativ- und Sterilitätskontrollen dienen.
  8. Impfplatten: Beimpfen Sie jede Vertiefung mit 100 μl der 1:10 verdünnten Kultursuspension, mit Ausnahme der Vertiefung der Negativkontrolle. Stellen Sie eine gleichmäßige Inokulation in allen Vertiefungen sicher.
  9. Versiegeln und inkubieren: Verschließen Sie die Platten in Plastiktüten, um die Sterilität zu erhalten, und inkubieren Sie 7 Tage lang bei 37 °C.

7. Inkubation und Interpretation der Ergebnisse

  1. Resazurin-Färbung: Nach 7 Tagen Inkubation geben Sie 30 μl Resazurin (0,01 %-0,02 %) in jede Vertiefung. Versiegeln und inkubieren Sie die Platte über Nacht, um die Farbe zu entwickeln.
  2. Interpretieren Sie Farbänderungen.
    1. Untersuchen Sie die Vertiefungen visuell bei gleichbleibend weißem Licht oder tageslichtausgeglichener Beleuchtung.
      HINWEIS: Die Wachstumskontrolle (kein Medikament) sollte blau bis rosa werden, was auf einen aktiven bakteriellen Stoffwechsel hinweist. Eine blaue Farbe zeigt eine vollständige Hemmung des Wachstums an. Rosa steht für aktives Wachstum, während Violett (ein gemischter Farbton) für eine partielle Hemmung steht.
    2. Vergleichen Sie die Intensität der Farbe sowohl mit der Negativkontrolle (nur Medien) als auch mit der Positivkontrolle (Bakterienwachstum ohne Medikament), um eine genaue Interpretation zu erzielen. Um die Verzerrung des Beobachters zu minimieren, verwenden Sie duale unabhängige Messwerte oder Plattenfotografie.
      HINWEIS: Die visuelle Beurteilung kann je nach Umgebungslicht variieren, daher ist eine gleichmäßige Beleuchtung unerlässlich.
  3. Minimale Hemmkonzentration (MHK)
    1. Definieren Sie MIC als die niedrigste Konzentration eines Arzneimittels, bei der die Vertiefung vollständig blau bleibt, was auf eine Hemmung der Stoffwechselaktivität von ≥99 % hinweist. Betrachten Sie Vertiefungen mit violetter oder rosafarbener Farbe, die auf teilweises oder vollständiges Wachstum hinweisen.
      HINWEIS: Die MHK-Bestimmung durch REMA nähert sich den Prinzipien der klassischen Proportionsmethode an, bei der die MHK als die niedrigste Konzentration gilt, die ≥99% des Inokulums im Vergleich zur arzneimittelfreien Kontrolle hemmt. Während REMA keine KBE-Zahlen verwendet, stellt der visuelle Endpunkt ein phänotypisches Korrelat dieses anteilsbasierten Schwellenwerts dar. Diese Interpretation stimmt mit den zuvor etablierten kolorimetrischen Protokollenüberein 11,14.

8. Berechnung des Index der fraktionellen Hemmkonzentration (FIC)

HINWEIS: Der FIC-Index (fractional inhibitory concentration) hilft bei der Bestimmung der Wechselwirkung zwischen zwei Arzneimitteln (Synergie, Antagonismus oder Indifferenz). Er wird auf der Grundlage der MHK-Werte berechnet, die aus dem Schachbrett-Assay erhalten wurden.

  1. Identifizieren Sie die MHK für jedes Medikament allein: Bestimmen Sie anhand des REMA-Assays die MHK für jedes Medikament, wenn es einzeln verwendet wird.
  2. Identifizieren Sie die MHK für jedes Medikament in Kombination: Identifizieren Sie anhand des Schachbrett-Titrationsassays die MHK jedes Arzneimittels, wenn es in Kombination mit dem zweiten Arzneimittel verwendet wird.
  3. Berechnen Sie die FIC für jedes Medikament.
    HINWEIS: In Tabelle 2 finden Sie die Formeln, die zur Berechnung des FIC und des FIC-Index verwendet werden. Tabelle 3 zeigt die konsolidierte MIC auf der Grundlage des REMA-Assays. Repräsentative MIC- und FIC-Indexwerte sind in Tabelle 4 dargestellt.
    1. Interpretieren Sie den FIC-Index wie folgt:
      FIC ≤ 0,5: Weisen Sie auf Synergie hin - die Medikamente wirken zusammen, um das Wachstum effektiver zu hemmen als jedes Medikament allein.
      FIC > 0,5 bis < 4,0: Additivität angeben - der kombinierte Effekt ist gleich der Summe der Einzeleffekte.
      FIC ≥ 4.0: Zeigen Sie Antagonismus an - die Medikamente stören sich gegenseitig in ihrer Aktivität.
  4. Beispiel: Berechnen des FIC-Index für BDQ und DEL in H37Rv
    1. Bestimmen Sie die MHK von BDQ für H37Rv (z. B. 0,125 μg/ml). In Kombination mit DEL ist die MHK von BDQ mit 0,03 μg/ml aufzuzeichnen.
    2. Bestimmen Sie die MHK der DEL für H37Rv (z. B. 0,063 μg/ml). In Kombination mit BDQ ist die MHK von DEL mit 0,125 μg/ml aufzuzeichnen.
    3. FIC für BDQ berechnen:
      FIC(BDQ) = MIC von BDQ in Kombination / MIC von BDQ allein = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Berechnen Sie FIC für DEL:FIC(DEL) = MIC von DEL in Kombination / MIC von DEL allein = 0,125 / 0,063 = 1,98
    5. Addieren Sie beide FICs, um den FIC-Index zu erhalten:FIC-Index = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Interpretieren Sie das Ergebnis.
      HINWEIS: Ein FIC-Index von 2,26 liegt im Bereich der additiven Wechselwirkung (>0,5 bis <4,0), was darauf hindeutet, dass die Kombination von BDQ und DEL einen additiven Effekt auf die Wachstumshemmung von M. tuberculosis hat.

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Ergebnisse

Bestimmung der MHK von Anti-TB-Medikamenten mittels REMA-Assay
Die Aktivitäten von Bedaquilin, Delamanid, Moxifloxacin und Isoniazid wurden unter Verwendung von REMA gegen arzneimittelempfindliches H37RV und arzneimittelresistentes klinisches Isolat von M. tuberculosis untersucht. Bedaquilin, Delamanid und Isoniazid wurden im Konzentrationsbereich von (1 μg/ml bis 0,03 μg/ml) und Moxifloxacin im Bereich von (2 μg/ml bis 0,06 μg/ml) verwendet. Die bakteriellen Suspensionen von arzneimittelresi...

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Diskussion

Die globale Bedrohung durch arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) ist zu einem drängenden Problem geworden 1,19. Dies hat zu einem dringenden Bedarf an der Entwicklung verbesserter, schneller Methoden für Arzneimittelempfindlichkeitstests (DST) geführt, insbesondere für Zweitlinienmedikamente und neuere Medikamente gegen TB. Solche Methoden sind unerlässlich, um Behandlungsstrategien zu verbessern, Medikamente gegen Tuberkul...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
250 mL quadratische Flasche mit VerschlussSchott Duran218203655Vorbereitung der Medien
7H9 BrüheBecton Dickinson271310Wachstumsmedien für M. tuberculosis (Raumtemperatur)
96-Well-Platte mit DeckelCorning359696-Well-Mikrotiterplatten aus klarem Polystyrol mit flachem Boden, TC-behandelt, einzeln verpackt, mit Deckel, steril (Raumtemperatur)
ART-Tips (1000 μ L)TARSONS528106Hydrophobe Polyethylenfilter mit  Polypropylen-Filterspitze-steril (Raumtemperatur)
ART-Tipps (200 μ L)TARSONS528104Hydrophobe Polyethylenfilter mit  Polypropylen-Filterspitze-steril (Raumtemperatur)
Bariumchlorid-DihydratMerck217565McFarland Standardvorbereitung (Raumtemperatur)
Bedaquilin (BDQ)Jansen und JansenGeschenk von Jansen und JansenAnti-TB-Medikament (4 > C)
CasitoneBecton Dickinson225930Ergänzung für Bakterienkultur (Raumtemperatur)
Delamanid (DEL)Otsuka PharmazeutikaGeschenk von Otsuka PharmaceuticalsAnti-TB-Medikament (4 > C)
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich67-68-5Vorbereitung von Arzneistoffen (Raumtemperatur)
Filter 0,2 μ mMilliporeSLGVR33RS0.22  μ m PVDF, steriler Einweg-Spritzenvorsatzfilter (Raumtemperatur)
GlycerinMerck356350Zusatz zu Kulturmedien (Raumtemperatur)
IMPFÖSESigma-AldrichNr. I8263Zur Vorbereitung der Kulturaufhängung (Raumtemperatur)
Isoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-5GAnti-TB-Medikament (4 > C)
LJ medium SchrägBD Mycobactosel221414Wachstumsmedien für M. tuberculosis (4 ° C)
McCartney Bijou Schmalhalsflasche, 14 mLSupertek12.124.0014Zur Vorbereitung der Kulturaufhängung (Raumtemperatur)
McCartney Bijou Schmalhalsflasche, 7 mLSupertek12.124.0007Zur Vorbereitung der Kulturaufhängung (Raumtemperatur)
Mikropipetten (1000 μ L)GilsonF144059MFür präzises Liquid Handling (Raumtemperatur)
Mikropipetten (200 μ L)GilsonFA10005MFür präzises Liquid Handling (Raumtemperatur)
Moxifloxacin (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50MGAnti-TB-Medikament (4 > C)
Mehrkanalpipette(20– 200 μ L)VWR849070024Für gleichzeitiges Pipettieren über Wells hinweg
OADCBecton Dickinson211886Ergänzung für Bakterienkultur (4 ° C)
Pipetten-FüllerMerckZ333980Für präzises Liquid Handling (Raumtemperatur)
Resazurin-NatriumsalzSigma-Aldrich62758-13-8Redox-Indikator für REMA-Assays (Raumtemperatur)
Serologische Pipetten, 10 mLCorningCLS4100Es wurden sterile Einwegpipetten aus Polystyrol verwendet (Raumtemperatur)
Vollglasperlen, Ø 6 mmSigma-AldrichZ265950Zur Vorbereitung der Kulturaufhängung (Raumtemperatur)
Schwefelsäure 95– 97%Merck100731McFarland Standardvorbereitung (Raumtemperatur)
Spritzen für FilterDispo Van100032Zur Verwendung mit Spritzenvorsatzfiltern
Vortex-MischerREMICM-101 PLUSFür die Vorbereitung von Kultursuspensionen
Polybeutel mit Reißverschluss obenSigma-AldrichZ162949

Referenzen

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