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Intradermale Inokulation von Mycobacterium avium im Mausohr

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DOI:

10.3791/67675

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3. Juli 2025

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1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung einer niedrig dosierten intradermalen Inokulation von Mycobacterium avium in einem Mausohr vor, um expositionsähnliche Bedingungen widerzuspiegeln.

Zusammenfassung

Im Gegensatz zu natürlichen nichttuberkulösen mykobakteriellen (NTM) Expositionen oder Infektionen, deren Pathologie auf einem langsam replizierenden Organismus beruht, kann die Aerosolinfektion im Mausmodell eine erhöhte Proliferation des Bakterienwachstums in der Lunge verursachen. Chronische Aerosol- und systemische Infektionen können mit antimykobakteriellen Arzneimitteln behandelt werden, die auch eine frühere Exposition widerspiegeln könnten, aber diese Verfahren sind langwierig und weniger repräsentativ für natürliche Expositionen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein weniger invasives Mausmodell für NTM-Expositions-ähnliche Bedingungen zu entwickeln, das translationaler ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur intradermalen Provokation präklinischer Mäuse durch das Ohrgewebe unter Verwendung von Mycobacterium avium (M. avium), um eine Exposition nachzuahmen und Immunantworten auf die Bakterien ohne offensichtliche Erkrankung zu ermöglichen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode der intradermalen Ohrinjektion und bestätigen das Vorliegen einer anhaltenden und eingedämmten mykobakteriellen Infektion, die weitere Möglichkeiten bietet, die Immunantworten in diesem in vivo-Modell zu hinterfragen.

Einleitung

Nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) sind eine wachsende Liste von Arten, die eine Untergruppe pathogener Bakterien umfasst, die oft schwer zu behandeln sind 1,2. NTM kommt in Umweltquellen wie Boden, Wasser und Wasseraerosolen vor 3,4,5. Trotz der gemeldeten Trends, die auf steigende NTM-Infektionen hindeuten, werden sie als Gruppe routinemäßig in weniger als 20 Bundesstaaten der USA gemeldet6,7. Personen mit spezifischen Komorbiditäten, einschließlich Personen mit Mukoviszidose oder Personen, die Immunsuppressiva einnehmen, haben ein erhöhtes Risiko für eine produktive Infektion mit pathogenen NTM-Spezies2. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass gesunde Personen wiederholt und kontinuierlich über Umweltquellen mit NTM in Berührung kommen, ohne dass dies zu robusten oder chronischen Infektionen führt. Es gibt einige Hinweise darauf, dass die NTM-Exposition die gesamte Immunantwort auf mykobakterielle Antigene bei Impfungen8, die Ergebnisse nach Exposition gegenüber anderen Mykobakterien und diagnostischen Tests9 "vorkonditionieren" kann, aber bisher war die präklinische Modellierung dieser Art von Exposition schwierig.

Chronische Lungeninfektionen10 und Behandlungen, die für erregerspezifische Impfstoffwirksamkeitsstudien genutzt werden, stellen keine relativ harmlosen Umwelteinflüsse und die vermutlich unterschiedlichen daraus resultierenden Immunantworten dar. Chronische Infektionen können beispielsweise zu schwer geschädigtem Gewebe und disseminierten Erkrankungen führen10. In jüngster Zeit gab es Impulse, um diese Forschungslücke zu schließen, einschließlich eines Mausmodells, das eine NTM-Exposition über das Trinkwasser aus dem Henao-Tamayo-Labor11 lieferte, wo die Immunantwort auf diese Exposition weiter ausführlich untersucht wurde. Die latente Tuberkulose (TB) ist ein weiterer Krankheitszustand der mykobakteriellen Infektion, der bei präklinischen Tieren nur schwer modellierbar war. Das Kaufmann-Labor leistete Pionierarbeit bei intradermalen Ohrinfektionen mit M. tuberculosis bei C57BL/6,12 und NOS2-/-13 Mäusen, um latente TB-Infektionen und Reaktivierungen nachzuahmen und die Mechanismen hypoxischer Granulome zu charakterisieren. Nemeth et al. nutzten das enthaltene intradermale Ohrmodell, um eine frühere Exposition gegenüber M. tuberculosis nachzuahmen und unterschiedliche Immunantworten zu charakterisieren, um zu bestimmen, wie sich dies auf die nachfolgenden Challenge-Ergebnisse auswirkte14. Das intradermale Ohrmodell wurde erfolgreich unter Verwendung von 104 koloniebildenden Einheiten (KBE) der M. tuberculosis-Stämme H37Rv und Erdman beschrieben, aber bisher wurde es nicht mit NTM-Isolaten getestet.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein reproduzierbares NTM-Ohr-Challenge-Modell zu etablieren, das die durch andere Provokationswege verursachte Erkrankung begrenzt, die im Hinblick auf die Immunantwort auf Exposition weiter untersucht werden können. Die Exposition anfälliger C57BL/6-Mäuse gegenüber hohen Dosen von M. avium im Trinkwasser führt zu infektionsähnlicheren Zuständen als bei Expositionen11. Daher beinhaltet die Begründung für die Entwicklung dieser Technik den vorherigen Erfolg der Verwendung von M. tuberculosis als Provokationsorganismus für die Ohrdermis mit einer relativ höheren Provokationsdosis 12,13,14. Hier wollten wir evaluieren, ob das Modell erfolgreich für ein M. avium-Isolat bei der Hälfte der zuvor berichteten Bakterienkonzentration angepasst werden kann 12,13,14 (102 KBE). Wir gehen davon aus, dass die Weiterentwicklung neuer Modelle der NTM-Exposition und nicht der Infektion dazu beitragen wird, offene biologische Fragen zu diesem Einfluss auf die Gesundheit und die zukünftige Infektions-/Impfdynamik zu beantworten.

Protokoll

Weibliche C57BL/6 wurden im Alter von 6-7 Wochen von einem Forschungsmodell-Versorgungslabor gekauft. Die Mäuse wurden in der Tiereinrichtung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) des Seattle Children's Research Institute (SCRI) unter pathogenfreien Bedingungen untergebracht und gemäß Versuchsprotokollen behandelt, die vom SCRI Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften in Bezug auf den Tierschutz durchgeführt. Das Institut arbeitet unter dem USDA-Zertifikat #91-R-0061 und der PHS Assurance #A4337-01. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Bakterienbrühen für die Inokulation

  1. In einer Biosicherheitswerkbank, die für die bakterielle Arbeit förderlich ist, ein Vorratsfläschchen mit Mycobacterium avium (ATCC 25291) aus der Lagerung bei -80 °C nehmen und bei Raumtemperatur auftauen.
    HINWEIS: Die Stammkonzentrationen von M. avium werden im Voraus bestimmt, wie es bei allen Stammmaterialien der Fall ist, indem serielle Verdünnungen auf 7H10-Agarplatten plattiert und koloniebildende Einheiten (KBE) gezählt werden.
  2. Verwenden Sie eine 26-g-Nadel mit stumpfer Spitze und resuspendieren Sie die Stammprobe, indem Sie die Flüssigkeit 10x oder öfter auf der 1,0-ml-Spritze auf und ab leiten, um eine gleichmäßige Suspension zu erzeugen.
  3. Die Konzentration von M. avium wird durch Plattieren von 100 μl serieller 1:10-Verdünnungen der Suspension auf 7H10-Agarplatten überprüft. Inkubieren Sie die Platten 3 Wochen lang bei 37 °C und zählen Sie die Kolonien, um sicherzustellen, dass die Inokulumkonzentrationen genau sind.
  4. Die Konzentration von M. avium wird auf die bevorzugte Dosis eingestellt, indem die Probe mit sterilem PBS verdünnt wird. Bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahren.
    HINWEIS: In diesem Versuch wurden 102 KBE pro 10 μl Dosis verwendet.

2. Aufbereitung und Betäubung der Tiere

  1. Bereiten Sie vor der Verabreichung der Anästhesie eine warme Oberfläche vor, z. B. ein Heizkissen, auf dem die Käfige der geimpften Mäuse aufbewahrt werden können, um ihre Körpertemperatur während der Genesung zu regulieren.
  2. Injizieren Sie Ketamin (100 mg/ml) und Xylazin (20 mg/ml) Cocktail intraperitoneal in Mäuse.
  3. Nach der Betäubung führen Sie eine Zehenkneifung durch, um zu bestätigen, dass die Mäuse ausreichend betäubt sind, um Eingriffe durchführen zu können.
  4. Tragen Sie das Augengleitmittel beidseitig auf.

3. Impfplattform und Materialvorbereitung

  1. Verwende eine Schaumstoffplatte, um eine Kante zu schaffen, auf der sich die Maus stabilisieren kann, während sie manipuliert wird.
    HINWEIS: Doppelseitiges Klebeband hilft, das Ohr flach auf der Plattform zu halten. Der Klebstoff darf nicht zu stark sein, um die Gesundheit des Ohrgewebes zu erhalten.
  2. Ordnen Sie eine beleuchtete Lupe an, um die Plattform zu sehen.
  3. Sammeln Sie eine sterile Hamilton-Spritze und ein funktionierendes M. avium-Präparat in der Nähe.

4. Inokulation der Ohrdermis

  1. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Leiste, so dass das Ohr auf doppelseitigem Klebeband positioniert werden kann.
  2. Üben Sie leichten Druck aus, um das Ohr auf das Klebeband zu drücken, und stellen Sie sicher, dass sich das Ohr nicht bewegt.
    HINWEIS: Alkoholtücher können vor der Injektion auf den Ohren verwendet werden, um eine Kreuzkontamination und Infektion mit Hautkommensalen nach der Infektion zu begrenzen. In Pilotstudien ohne Verwendung von Alkoholtüchern wurden solche Infektionen jedoch nicht beobachtet.
  3. 10 μl M. avium-Präparat mit einem Gehalt von 100 KBE werden in die sterile Hamilton-Spritze aufgezogen.
    HINWEIS: M. avium Suspension schwenken, bevor Sie ein Volumen von 10 μl aufziehen, um sicherzustellen, dass es homogen ist.
  4. Halten Sie die Plattform in einer Hand und die Hamilton-Spritze in der anderen Hand und achten Sie darauf, dass die abgeschrägte Seite der Nadel nach oben zeigt (Abbildung 1).
  5. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze mit sehr leichtem Druck unter der Ohrdermis. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nicht vollständig durch das dünne Ohrgewebe geht.
  6. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, drücken Sie den Kolben der Spritze allmählich und langsam nieder.
  7. Beobachten Sie die Farbe des Ohrs während der Verabreichung.
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Verabreichung erscheint als undurchsichtige Erhebung an der Injektionsstelle, wie eine Blase.
  8. Sobald die Dosierung vollständig verabreicht ist, überprüfen Sie das Mausohr und das Klebeband auf Anzeichen von Undichtigkeiten.
    HINWEIS: Wenn es zu einer Leckage kommt, kann eine geschätzte verlorene Dosis an das gegenüberliegende Ohr verabreicht werden. Zumindest sollte das Tier so gekennzeichnet und aufgezeichnet werden, dass es möglicherweise eine Dosis unterhalb der Zieldosis erhalten hat.
  9. Wenn die Dosierung erfolgreich ist, stellen Sie sicher, dass die Maus wieder in ihren Heimkäfig gesetzt wird, um der warmen Oberfläche ausgesetzt zu sein, während sie überwacht wird, bis sie erfolgreich aus der Narkose aufgewacht ist.

5. Bewertung der bakteriellen Belastung

  1. Tiere gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen einschläfern.
    1. Hier wird die Euthanasie mit mindestens zwei Methoden pro Opfer abgeschlossen. Für dieses Verfahren werden zwei Methoden gewählt: die Verwendung von CO2 -Erstickung und die Zervixluxation.
    2. Verlängern Sie zunächst ein Röhrchen, um CO2 -Gas in den Heimkäfig der Mäuse abzugeben, und verabreichen Sie das Gas, bis keine Anzeichen mehr von Bewegungen der Mäuse zu sehen sind. Achten Sie darauf, einen Käfig zu verwenden, aus dem das Gas nicht austreten kann.
    3. Als nächstes verrenken Sie die Halswirbel durch manuelle Manipulation.
  2. Präparieren Sie die Ohren von Tieren, die von M. avium betroffen waren, vier Wochen nach der Exposition (28 Tage, entspricht12 früheren Studien). Präparieren Sie die Ohren von 2 Mäusen mit sterilen Werkzeugen. Die Ohren werden in konische Röhrchen mit KBE-Puffer (PBS + 0,05 % Tween80) eingeführt und mit einem Gewebehomogenisator homogenisiert, bis eine gleichmäßige Suspension gebildet wird. Auch unangefochtene Ohren werden bearbeitet und als Kontrollen dienen.
    HINWEIS: Es können alle Zeitpunkte nach der Belichtung und alle Organe von Interesse verwendet werden. Für dieses Experiment wurden auch die Lunge, die Milz, der drainierende Lymphknoten und die Gehirnorgane entnommen.
  3. 100 μl Homogenat zu 700 μl KBE-Puffer in einem Deep-Well-Block in 1/8-facher Verdünnung geben. Wiederholen Sie den Vorgang über den gesamten Block, so dass mindestens 5 serielle Verdünnungen erzeugt werden. 50-100 μl reines Homogenat oder serielle Verdünnungen (hier werden die Verdünnungen 0 bis 5 verwendet) zu 7H10-Agar-Tri-Platten geben, mit T-Spreadern gleichmäßig verteilen und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 2-3 Wochen inkubieren.
  4. Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE) und wandeln Sie sie zu Analysezwecken in Tabellenkalkulationssoftware in Log10 um.

Ergebnisse

Wir verwendeten das oben beschriebene Protokoll, um zu bestimmen, ob ein reproduzierbares NTM-Challenge-Modell unter Verwendung der Ohrdermis als Infektions- oder Expositionsweg etabliert werden kann. Die Ohren wurden von zwei Tieren 28 Tage nach der Provokation entnommen, homogenisiert und plattiert, wie auf dem Mykobakterien-selektiven 7H10-Medium beschrieben. Wir beobachteten, dass M. avium bis zu 28 Tage in Ohren persistierte, die intradermal herausgefordert wurden, und dass M. avium in den unbestrittenen Ohren fehlte (Abbildung 2).

Während wir 28 Tage nach der Infektion keine Ausbreitung in das unbehelligte Ohr beobachteten, haben andere, die dieses Ohrdermismodell für die Modellierung latenter TB verwendeten, eine Ausbreitung auf andere distale Organstellen beobachtet14. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine niedrigere Dosis der Provokation und die Verwendung von M. avium-Isolat die Ausbreitung auf spätere Zeitpunkte reduzieren könnte, die die Exposition im Vergleich zu einer chronischen Infektion besser widerspiegeln könnten. Daher wurde die Euthanasie an Kohorten von n=5 M. avium herausgeforderten Mäusen 28, 56, 90 und 132 Tage nach der Infektion durchgeführt. Die folgenden Organe wurden mit dem gleichen Protokoll wie für das Ohrgewebe homogenisiert: Lunge, Milz, drainierender Lymphknoten (DLN) und Gehirn. Dieser Provokationsweg führte zu einer sporadischen Ausbreitung im Laufe der Zeit, wobei weniger als die Hälfte der Tiere 56 oder 90 Tage nach der Infektion eine zählbare KBE in den getesteten Organen aufwiesen (Tabelle 1). 132 Tage nach der Provokation hatten alle Mäuse nachweisbare M. avium in ihrer Milz (n = 5/5 bewertete Tiere), schienen aber zu diesem Zeitpunkt nur minimale (n = 1/5 in DLN) oder keine (n = 0/5 in Lunge oder Gehirn) Bakterien in anderen Organen zu beherbergen (Tabelle 1).

figure-results-1
Abbildung 1: Ausrichtung einer Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben. Vor dem Einführen der Nadel muss die abgeschrägte Seite nach oben zeigen, um das Inokulum richtig zu verabreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Besiedlung des Ohrgewebes durch M. avium 28 Tage nach der Provokation. Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden im Ohr mit 102 KBE Mycobacterium avium provoziert. Das herausgeforderte Ohr (+) wurde nach 28 Tagen mit dem unbehelligten Ohr (-) verglichen, n=2 einzelne Tiere aus einem einzigen gezeigten Experiment, wobei jedes Tier eine andere Farbe und ein anderes Symbol hatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Uhrzeit (Tag)Organprotokoll10 KBE
LungeMilzDLNGehirn
283.08, ND, ND, ND, ND2.81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,78, 0,90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1.53, 3.43, ND, ND, ND2.78, ND, ND, ND, ND1.20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0,60, 3,35, 3,26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0.60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = drainierender Lymphknoten, ND = nicht erkannt

Tabelle 1: Ausbreitung von M. avium aus dem Ohr im Laufe der Zeit nach der Provokation. Lunge, Milz, drainierender Lymphknoten (DLN) und Gehirn wurden von n=5 Mäusen pro Zeitpunkt nach der Challenge entnommen. Homogenisierte Gewebe wurden plattiert und auf Bakterienwachstum untersucht. Organ-KBE dargestellt als logarithmisch10 transformierte Werte, bei denen Bakterien gezählt und nicht nachgewiesen wurden (ND), bei denen bei keiner der plattierten Konzentrationen KBE beobachtet wurden. Zeitverlaufsdaten, die für ein Experiment repräsentativ sind.

Diskussion

Hier haben wir gezeigt, wie man Mäuse in einem geschlossenen intradermalen Ohrmodell reproduzierbar mit Mykobakterien herausfordern kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sterilitätsvorkehrungen zu befolgen und Nadelstichverletzungen zu vermeiden. Bei dieser Impfmethode ist es wichtig, eine geeignete Aufstellstation und eine gute Beleuchtung zu haben, um sicherzustellen, dass der Dermisraum gezielt und nicht vollständig durch das Ohr durchstochen wird. Sollte das passieren, kann je nach Studie ein zweiter Versuch auf dem anderen Ohr unternommen werden. Unbehandelte Ohren innerhalb derselben Maus können auch als Steuerung pro Maus verwendet werden. Diese Methode sollte für Forscher mit minimalem Bedarf an Ausrüstung oder Zeit zugänglich sein. Die Verwendung von Mäusen und Zeit für das Training trägt zur Erfolgsrate des Impfprotokolls bei. Die häufigsten Fehler bei dieser Technik sind das Nichtbetreten des intradermalen Raums mit der Spritze (und das Durchstechen des Ohrs) oder das zu schnelle Drücken der Spritze, was zu einer ungleichmäßigen Abgabe oder einem Abrutschen der Nadel aus dem intradermalen Raum führt. Eine gute Beleuchtung und Vergrößerung können bei der richtigen Positionierung der Nadel für die Inokulation helfen.

Wir nutzen die Methodik für "expositionsähnliche" Bedingungen von NTM. Der überwiegende Teil von M. avium befindet sich im Ohr oder im DLN. Eine Einschränkung dieser Methodik besteht jedoch darin, dass bei allen Tieren, die 132 Tage nach der Provokation untersucht wurden, eine Ausbreitung in systemische Organe, nämlich die Milz, beobachtet wurde. Es kann einen Schwellenwert für die bakterielle Inokulation geben, der die Menge oder Häufigkeit der Ausbreitung verringern könnte, was mit einer Titrationsstudie erreicht werden könnte. Dieses Verfahren ist geeignet, je nach Fragestellung sowohl den Organismus, z. B. andere NTM-Spezies, als auch die abgegebene Dosis zu modifizieren.

Menschliches Verhalten (Mangel an angemessener Trinkwasseraufbereitung, Umweltverschmutzung, Rauchen), eine erhöhte Anzahl von Menschen mit sich verschlechterndem Gesundheitszustand aufgrund des Altersvon 15 Jahren und anderer Begleiterkrankungen, das Fehlen geeigneter diagnostischer Tests und der Klimawandel16 könnten eine Rolle bei den steigenden Raten von NTM-Infektionen spielen, und dieser Trend wird sich wahrscheinlich in naher Zukunft verstärken. Wir schlagen vor, dass Modelle wie die Schleimhautzufuhr über das Trinkwasser11 oder intradermale Ohrinfektionen mit NTM bei Mäusen die Möglichkeit bieten, zu bestimmen, welchen Einfluss diese steigende Exposition auf die spätere Impfung und die Wirksamkeit des Impfstoffs haben wird. Obwohl wir diese Methodik eines geschlossenen Ohrmodells für M. avium adaptiert haben, schlagen wir vor, dass sie erfolgreich für andere NTM-Spezies als Expositionstechnik eingesetzt werden kann.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken dem engagierten Personal des Vivariums für die außergewöhnliche Betreuung der Tiere während dieser Studie. Die Autoren danken auch dem Henao-Tamayo-Labor an der Colorado State University für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten M . avium-Stammes . Die Autoren danken den Mitgliedern der Laboratorien Aderem und Urdahl am Seattle Children's Research Institute für die Schulung in der ursprünglichen Methodik. Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, der National Institutes of Health, des Department of Health and Human Services unter der Vertragsnummer 75N93021C00029 (an RNC) und der Zuschüsse R01AI125160 und R01AI183642 (an RNC und SLB) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Tween80SigmaP6224
1 ml SpritzeFisher15-823-434
7H10 Agar TriplatesMoltox21-40S234
26G stumpfe NadelFisherNC0981254
BiosicherheitswerkbankNuaireNU-543-400
CO2 InkubatorFisher Scientific15-103-0513
Doppelseitiges KlebebandScotch3136
Hamilton 701N MikroliterspritzeFisher14-824-16
Hartgewebe-KugelspitzenFisher15-340-102
HeizkissenKent ScientificHTP-1500
InsulinnadelFisherNC1551333
KetaminPatterson Veterinary07-890-8598
Beleuchtete LupeBrightechB07MMZ27QK
PBSThermoFisher10010072
Tissue-HomogenisatorOmniTH115
Tissue-Homogenisator-StativOmniS1000
XylazinPatterson Veterinary07-808-1947

Referenzen

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