Verbesserte Methodik für die Flüssigkeitsabgabe in die Lunge der Maus: Intubation mit einem Consumer-Otoskop

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie die optimale Positionierung einer Maus und das transorale Einsetzen eines kamerabasierten Otoskops die Visualisierung der Stimmritze, eine schnelle Intubation mit minimalem Gewebetrauma und eine gleichmäßige Flüssigkeitsabgabe an die Lunge ermöglicht.

Zusammenfassung

Die konsistente Abgabe von Flüssigkeiten, einschließlich potenzieller Therapien, an die Lunge ist entscheidend für die Modellierung von Lungenerkrankungen und die präklinische Therapieentwicklung. Derzeitige Methoden, die bei Mäusen verwendet werden - wie z. B. die oropharyngeale Aspiration durch die Zungenzugmethode - können jedoch zu einer variablen Abgabe führen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines erschwinglichen, mit einem Mobiltelefon verbundenen, beleuchteten Otoskops, um die Stimmritze sichtbar zu machen und eine direkte Inokulation in die Atemwege zu ermöglichen. Wir beschreiben eine optimierte Inszenierungstechnik mit adäquater Beleuchtung und Positionierungshilfen. Außerdem wird beschrieben, wie die Intubation mit einem 20 G flexiblen Katheter mit oder ohne faseroptisches Licht zuverlässig durchgeführt werden kann. Diese Technik reduziert die Varianz bei der intrapulmonalen Verabreichung erheblich und erhöht das Volumen der abgegebenen Flüssigkeit, die die Lunge erreicht. Aufgrund der reduzierten Varianz können bei dieser Methode anstelle der oropharyngealen Instillation durch die Zungenzugmethode kleinere Tierkohortengrößen verwendet werden. Im Folgenden finden Sie eine Methode für eine effektive, schnelle und konsistente Intubation von Mäusen und die Verabreichung an die Lunge, einschließlich einer robusten Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus. Mit dieser verbesserten Methodik sind eine konsistente, sichere Intubation und eine replizierbare, effiziente Verabreichung an die Lunge in Reichweite.

Einleitung

Weltweit sind Atemwegserkrankungen die häufigste Todesursache bei Kindern unter 5 Jahren und eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Erwachsenen¹. Im Jahr 2021 war die SARS-CoV2-Infektion die dritthäufigste Todesursache in den USA². Mausmodelle werden häufig zur Untersuchung von Lungenerkrankungen wie Asthma, Lungenentzündung, chronisch obtrusiven Lungenerkrankungen und Lungenfibrose verwendet. Fast alle diese Modelle erfordern die Abgabe von flüssigen Mitteln an die Lunge. Dies kann durch direkte Kanulation der Luftröhre (typischerweise unter direkter Visualisierung unter Verwendung einer chirurgischen Cut-Down-Technik), intranasale Verabreichung oder oropharyngeale Aspiration nach der etablierten Zungenzugmethode^{erfolgen 3,4,5}. Diese Techniken haben jedoch alle Nachteile. Die Bildung von Narbengewebe nach der chirurgischen Cut-Down-Technik macht sie ungeeignet für Studien, die eine wiederholte Verabreichung von Wirkstoffen an die Lunge erfordern, und die beiden letztgenannten Techniken können zu einer variablen Lungenabgabe führen. Darüber hinaus kann bei der Anwendung der Zungenzugmethode ein Gewebetrauma der Zunge ausgeprägt sein, und die Verabreichungseffizienz hängt vom Forscher ab, der das Verfahren durchführt, siehe Abbildung 1.

Abbildung 1: Die geführte Intubation und die IT-Instillation führen zu einer verbesserten Abgabe an die Lunge und einer geringeren Variabilität im Vergleich zum Zungenzug. (A) Drei verschiedene Untersucher verabreichten 50 μl verdünnte indische Tinte durch Zungenzug, die etablierte Methode zur oropharyngealen (OP) Verabreichung. Zwei Forscher gaben auch Tinte an die Lunge ab, indem sie wie beschrieben intubierten. (B) Die Lunge wurde 1-4 h nach der Entbindung entnommen und unter 2-facher Vergrößerung fotografiert. Die Fotos wurden mit ImageJ auf fleckige Flächen untersucht. (n=6 (Intubation) oder 9 (OP-Verabreichung), Ergebnisse aus 2 oder 3 unabhängigen Replikaten von 2 -3 verschiedenen Forschern, p<0,0001 Welch's T Test) (C) Die Variabilität in der Lungenverabreichung wurde ebenfalls als prozentuale Abweichung vom Mittelwert berechnet. Die OP-Verabreichung war weitaus variabler. (p = 0,0317, walisischer T-Test, GraphPad Prism 10.2.3 alle Statistiken und Grafiken) (C57BL/6J Männliche und weibliche Mäuse wurden verwendet, sie waren ~10 Wochen alt.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Anatomie der Maus macht die Intubation schwierig und zeitintensiv. Der Mund ist klein, und das bukkale Gewebe kann die Sicht des Forschers auf die Rima glottidis^{behindern 6}. Darüber hinaus sind die Stimmlippen sehr klein, und es kann schwierig sein, sie zu sehen, da sie nahe am Zungenansatz liegen. Schließlich ist es schwierig, die korrekte Platzierung des Endotrachealtubus zu bestätigen, da das kleine Tidalvolumen oft nicht in der Lage ist, einen Spiegel zu beschlagen⁷. Diese Schwierigkeiten haben zu einer Reihe innovativer Techniken zur Intubation von Mäusen geführt. Zu diesen verbesserten Verfahren gehören die Verwendung eines neonatalen Laryngoskops und eines Drahtes, um einen Katheter in die Luftröhre^{zu schieben 8,9}, die Verwendung einer faseroptischen Lichtquelle zur Führung und Versteifung des Katheters^10,11 und die Verwendung einer Live-Videoübertragung⁶. In jüngerer Zeit hat die Verwendung eines klinischen Otoskops die orotracheale Intubation unterstützt¹². Andere haben Transillumination eingesetzt, um die Stimmritze sichtbar zu machen und Mäuse zu intubieren ^7,13,14. Diese Methoden haben jedoch viele Nachteile. Die Verwendung von Enthaarungsmitteln am Hals der Maus und die Nähe der Tiere zu einer heißen Lichtquelle machen die Durchleuchtung zu einem nicht idealen Ansatz. Die Verwendung der Nadel im Katheter oder das Einführen von scharfen Instrumenten in den Mund bedeutet, dass einige Methoden zur Versteifung des Katheters die Tiere einem unangemessenen Risiko aussetzen. Schließlich birgt ein Schnitt über der Luftröhre zur Bestätigung der Platzierung erhebliche Nachteile, einschließlich der Notwendigkeit von Sterilität und der Ansammlung von Narbengewebe. Bisher hat sich die intratracheale Instillation durch Intubation als zu schwierig für eine breite Einführung erwiesen¹⁵ und die Fortschritte in der methodischen Entwicklung sind isoliert und von vielen Laboratorien ungenutzt geblieben¹⁵. Weitere Studien haben sich auf die Wahl des Anästhetikums während der Entbindung konzentriert und festgestellt, dass Ketamin Vorteile gegenüber Isofluran⁵ haben kann. Da Isofluran jedoch keine kontrollierte Substanz ist und nach Abschluss des Eingriffs schnell nachlässt, bietet es attraktive Vorteile, so dass wir diese Form der Anästhesie verwendet haben, während wir andere Aspekte dieser Methodik optimiert haben^16,17.

Die von uns beschriebene Methode überwindet die Visualisierungsherausforderungen, die andere zu lösen versucht haben, mindert die Risiken für Versuchstiere, verringert die Zeit, die benötigt wird, um kleine Volumina intratracheal über einen Endotrachealtubus zu injizieren, erhöht das Flüssigkeitsvolumen, das die Lunge erreicht, und bietet eine verbesserte Methode zur Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus. Die Verwendung eines Aufhängeständers, magnetischer helfender Hände (Krokodilklemmen an flexiblen Armen, die an einer Basis befestigt sind) und hellerer Beleuchtung ermöglichen es einem einzelnen Forscher, eine effiziente intratracheale Entbindung durchzuführen. Die Visualisierung wird durch ein Otoskop für zu Hause mit WIFI-Konnektivität erleichtert. Dieses Gerät ist günstiger als kommerzielle Intubationsinstrumente. Darüber hinaus ermöglicht die WIFI-Konnektivität einen gleichzeitigen Video-Feed auf einem tragbaren Gerät (z. B. einem Mobiltelefon), wodurch es für das Training geeignet ist. Bei der Intubation kann entweder eine faseroptische Lichtquelle verwendet werden, die durch einen 20 g x 1" flexiblen (PTFE) Katheter gefädelt wird (Nadel entfernt), oder der Katheter ohne Licht. Die Tiefenkontrolle erfolgt durch zwei Methoden - das Hinzufügen eines Intubationssicherheitskeils (ein konischer Schutz am Katheter) und die Tiefenbeobachtung im Video-Feed. Die Platzierung des Endotrachealtubus wird mit der "Blasenmethode" bestätigt, um das Tidalvolumen klarer zu visualisieren als mit der traditionellen Spiegelnebelmethode¹⁸. Dies ist für das Tier weniger belastend, als sich auf eine Trachealobstruktion zu verlassen, um den Atemdrang¹⁰ zu modifizieren und die Platzierung zu bestätigen. Die kombinierte Verwendung von Verlängerungsschläuchen, die an den Katheter gekoppelt sind, um eine erfolgreiche Intubation zu bestätigen (im Folgenden als Bubble-Methode bezeichnet), vereinfacht von Watanabe et. al⁷, und ein Consumer-Video-Otoskop in einem einzigen Verfahren macht die Intubation zu einer praktischen Methode für die therapeutische Verabreichung an die Lunge und zu einer deutlichen Verbesserung der Zungenzugmethode (siehe Abbildung 1). Wenn Sie eine zuverlässige, konsistente und erschwingliche Methode für die nicht-chirurgische Flüssigkeitsabgabe in die Lunge von Mäusen suchen, insbesondere ohne den Einsatz von kontrollierten Substanzen (wie Ketamin) oder teuren Geräten, kann die folgende Methode ideal sein.

Protokoll

Es ist zwingend erforderlich, dass diese Verfahren vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC), der im Protokoll aufgeführt ist, überprüft und genehmigt werden, und dass das Veterinärpersonal konsultiert wird, bevor fortgefahren wird. Die IACUC an unserer Institution genehmigte das Protokoll vor Beginn des Experiments und überprüfte den Videoinhalt vor der Einreichung. Unterstützung und Schulung wurden durch das Tulane Department of Comparative Medicine erhalten, um den höchsten Pflegestandard für alle unsere Labortiere zu gewährleisten.

1. Einrichten

HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für die Einrichtung.

Abbildung 2: Die für die geführte Intubation verwendete Station ist wie abgebildet vorbereitet. Von links: Pipetten für die Verabreichung, Sprudelschlauch zur Bestätigung der korrekten Platzierung des Endotrachealtubus, Pinzette, Spatel, pädiatrisches Nasenspekulum (besprochen, aber für dieses Verfahren nicht benötigt), helfende Hände, Lupenlicht, Mausständer mit Nasenkonus, faseroptische Sonde, Anästhesie-Induktionskammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Reinigen Sie den mit dem Intubationskit gelieferten Sicherheitskeil mit einem Isopropanol-Vorbereitungspad. Schieben Sie den sauberen Sicherheitskeil (grün im Video) auf die 20 G flexible Kanüle und entsorgen Sie die mitgelieferte Nadel sicher.
   HINWEIS: Das verwendete Nagetier-Intubationskit (Materialtabelle) enthält Intubations-Sicherheitskeile. Dabei handelt es sich um kleine, konische Hüllen, die über einen flexiblen Katheter von 20 G x 1 Zoll passen. Sie verhindern, dass der Katheter die Carina beschädigt.
2. Besorgen Sie sich die anderen benötigten Werkzeuge, darunter ein Mobiltelefon, ein handelsübliches Otoskop, ein Mausstativ mit Nasenkonus, eine fein gezackte, gebogene Pinzette, den vorbereiteten Endotrachealtubus (aus 1.1) und das faseroptische Licht, falls Sie ihn verwenden. Reinigen Sie all diese vor dem Gebrauch mit Isopropanol-Vorbereitungspads.
3. Nehmen Sie ca. 20 cm flexiblen Schlauch. Biege es in eine U-Form, füge an einem Ende einen Luer-Lock-Anschluss hinzu und befestige es mit einem Drehbinder. Geben Sie 200-300 μl steril gefiltertes Wasser oder Tusche in das Röhrchen. Im Folgenden wird diese Anordnung als "Blasenrohr" bezeichnet.
4. Machen Sie eine Nahtschlaufe, indem Sie ~13 cm geflochtene Seidennaht der Größe 0 in einen Kreis binden. Platzieren Sie diese Schlaufe oben auf dem Ständer und stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Naht gesichert sind und der Ständer sauber ist. Platzieren Sie den Mausständer auf der Metallbasis für Lupenlicht. Positionieren Sie die helfenden Hände an der Stelle, an der sich der Mund der Maus befinden wird.
   HINWEIS: Viele Anbieter stellen austauschbare Ständer her (siehe Materialtabelle), und einer kann im Labor kostengünstig hergestellt werden ^4,7,14. Zur Aufhängung des Tieres wurde eine geflochtene Seidennaht der Größe 0 verwendet. Die Verwendung anderer Materialien für den gleichen Zweck wurde jedoch beschrieben ^4,13.
5. Platzieren Sie eine Maus in der Anästhesie-Induktionskammer. Verwenden Sie eine konstante Durchflussmenge O₂ bei 0,8 l/min und 2 % Isofluran. Betäuben Sie das Tier ausreichend (siehe Hinweis), damit es während des Setzens des Nasenkegels nicht erwacht. Unterdrücken Sie die Atemfrequenz der Maus nicht signifikant. Regelmäßige Atemzüge helfen bei der Wertschätzung der Stimmlippen.
   HINWEIS: Die Atemfrequenz der Maus sollte normal sein. Dieses Kriterium wird verwendet, um die geeignete Anästhesietiefe zu bestimmen. Dies kann von Tier zu Tier variieren und 200 Atemzüge/min überschreiten. Daher ist es weder praktisch noch notwendig, die Atemzüge zu zählen oder eine Zehenkneifung zu verwenden.
   ACHTUNG: Dieser Vorgang kann bei Bedarf abgebrochen werden. Die Tiere sollten jedoch nicht länger als unbedingt erforderlich in der Induktionskammer bleiben.
6. Schließen Sie das Otoskop an ein Mobiltelefon an und stellen Sie sicher, dass der Video-Feed stabil ist.
   VORSICHT: Um die Isofluran-Exposition der Forscher während dieses Verfahrens zu minimieren, verwenden Sie ein chemisches Atemschutzgerät, wenn Sie mehrere Intubationen durchführen oder in dieser Methode trainieren. Alternativ können Sie den Eingriff in einem Abzug durchführen.

2. Tierhaltung

1. Sobald das erste Tier schläft, nehmen Sie es aus der Induktionskammer, ziehen Sie es ab und legen Sie die oberen Zähne auf die Länge der Naht. Üben Sie leichte Spannung auf das Tier aus, um die Positionierung der Naht beizubehalten, während Sie die Maus wieder auf den Ständer legen.
   HINWEIS: Im Durchschnitt werden die Tiere insgesamt 2 Minuten lang betäubt, einschließlich Induktion. Dies verringert das Risiko für das Tier erheblich, macht eine ophthalmologische Schmierung überflüssig und verhindert die Bildung von Speichel. Arbeiten Sie daran, die Tiere so kurz wie möglich sediert zu halten.
2. Stellen Sie den Halswinkel leicht nach hinten ein (stellen Sie den Hals in eine leichte Verlängerung, 5°-15°). Schieben Sie den Nasenkegel vorsichtig über die Nasenlöcher. Drücken Sie den Kegel nicht fest nach unten, da er die Naht beeinträchtigen und die Maus aufhängen kann.
3. Fassen Sie die Zunge mit einer großen, fein gezackten, gebogenen Pinzette so fest wie möglich an der Unterlippe. Ziehe es nach unten und weg von den oberen Zähnen zu einer Seite der unteren Zähne.
   ACHTUNG: Längeres Tressen, übermäßige Spannung oder Quetschen der Zunge können die Gesundheit der Tiere beeinträchtigen. Bitte überwachen Sie die Zunge auf Anzeichen eines Traumas (Blutergüsse, Blutungen, Schwellungen oder Austrocknung), und brechen Sie den Eingriff ab, wenn Sie beobachtet werden, und alarmieren Sie das Tierarztpersonal.
4. Wenn Sie helfende Hände verwenden, stützen Sie die Pinzette in dieser Position ab. Abhängig von der Erfahrung und der Sehschärfe des Forschers kann eine beleuchtete Lupe bei der richtigen Positionierung des Tieres helfen.
5. Führen Sie das faseroptische Licht (falls verwendet) durch den flexiblen Katheter, wobei der Intubationssicherheitskeil (grün im Video) an Ort und Stelle ist.
   HINWEIS: Befestigen Sie das Glasfaserkabel nicht zu fest an der Lichtquelle. Wenn Sie zu stark drücken, ist es schwierig, das Licht zu entfernen, während der Endotrachealtubus an Ort und Stelle bleibt.

3. Visuelle Wertschätzung der Stimmbänder und der Intubation

1. Mit dem Otoskop in der nicht dominanten Hand drücken Sie es leicht auf die Zunge. Richten Sie dann die Kamera und ihre Lichtquelle aus, um die Stimmbänder in der Nähe des Zungenansatzes zu visualisieren.
   HINWEIS: Leichte Abweichungen in der Anatomie und der Gewebefarbe können die Orientierung erschweren. Verwenden Sie die Bewegung, die mit der Atmung verbunden ist, um die strukturelle Identifizierung zu bestätigen.
2. Führen Sie die Kanüle bei eingeschaltetem faseroptischem Licht (falls verwendet) entlang der Oberseite des Otoskops durch und halten Sie leichten Kontakt mit der Basis der Zunge oder dem Lippenteil des Otoskops als Referenz. Schieben Sie es in den Mund der Maus zwischen die weiche Palette und die Lippe des Otoskops.
   HINWEIS: Wenn das faseroptische Licht nicht verwendet wird, kann der in Schritt 4 beschriebene "Blasenschlauch" zu diesem Zeitpunkt am Katheter befestigt werden. Helles, fokussiertes Licht im Mund der Maus ist für diese Änderung des Verfahrens erforderlich.
3. Stellen Sie den Annäherungswinkel so ein, dass der Katheter sehr flach ist. Unmittelbar nach dem Einführen des Katheters (weniger als 1 mm über die Stimmlippen hinaus) heben Sie die Spitze des Katheters an, so dass sie fast parallel zur Tischplatte ist. Dadurch wird verhindert, dass der Epiglottis den Katheter dorsal in die Speiseröhre drückt. Besonders während des Trainings, bei Schwierigkeiten oder zu Beginn der eigenen Erfahrung ist die Verwendung des Video-Feeds von unschätzbarem Wert, um den Endotrachealtubus zwischen den Stimmlippen zu platzieren.
   HINWEIS: Die Speichelproduktion behindert die Sicht auf die Stimmlippen nicht, während dieser Vorgang abgeschlossen ist. Die Verwendung eines Baumwollapplikators mit Speerspitze zur Entfernung von behinderndem Speichel wird jedoch in früheren Publikationen bei der Intubation von Ratten beschrieben¹⁹. Diese Methode kann sich als nützlich erweisen, wenn Speichel zu einem Problem wird.
   1. Wenn Sie auf Widerstand stoßen, entfernen Sie sofort den Katheter und lassen Sie die Atmung wieder normal werden. Wenn Blutungen beobachtet werden, wenden Sie sich an das Tierarztpersonal.
      HINWEIS: Beim Vorschieben des Katheters sollte es fast keinen Widerstand geben.

4. Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus

1. Bestätigen Sie visuell mit dem Otoskop, dass sich der Endotrachealtubus an der richtigen Stelle befindet. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Sonde korrekt platziert wird, indem Sie berücksichtigen, dass die Luftröhre während der Platzierung weniger Widerstand leistet als die Speiseröhre. Beachten Sie, dass sich der Endotrachealtubus in der richtigen Position ~5 mm hinter den Stimmlippen befindet. Achten Sie darauf, dass das Licht der Glasfaserquelle durch die Halshaut scheint, um erneut zu bestätigen, dass die Platzierung korrekt ist.
   HINWEIS: Der Intubationssicherheitskeil sollte verhindern, dass der Endotrachealtubus zu weit eingeführt wird. Der Sicherheitskeil verhindert ein Trauma der Carina; Es muss jedoch nicht den Fortschritt verhindern. Es sollte als Sicherheitsmerkmal verwendet werden und die optimale Tiefe ist oft flacher, als der Keil zulässt.
2. Halten Sie dann den Endotrachealtubus fest und entfernen Sie das faseroptische Licht. Stellen Sie sicher, dass der Katheter mit der "Bubble-Methode" (siehe unten) korrekt platziert wird, anstatt mit einem Spiegelbeschlagen.
3. Nehmen Sie das in Schritt 1.3 vorbereitete Blasenröhrchen. Bereiten Sie es vor dem Eingriff vor und verwenden Sie es für alle Tiere wieder.
   ACHTUNG: Die 200-300 μl Wasser oder Tinte im Luftpolsterrohr sollten niemals abgesaugt werden. Um dies zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit weit vom Luer-Lock entfernt ist.
4. Wenn der Endotrachealtubus an Ort und Stelle ist, fixieren Sie den Blasenschlauch mit dem Luer-Lock. Das Tidalvolumen sollte sofort ersichtlich sein. Ist dies nicht der Fall, ist der Endotrachealtubus falsch platziert. Entfernen Sie es schnell und lassen Sie die normale Atemfrequenz der Maus zurückkehren.
   ACHTUNG: Wenn der Katheter in der Speiseröhre verlegt wird, wird die Luftröhre zusammengedrückt und eine ausreichende Atmung verhindert. Eine Fehlplatzierung geht oft mit einer erschwerten Atmung (einschließlich eines nennenswerten Beitrags der Interkostalmuskulatur) und/oder einer dramatisch verringerten Atemfrequenz einher. Darüber hinaus kann das Kanulieren der Speiseröhre zu einem Muskelkrampf führen, der eine spätere Intubation erschwert; Aus diesem Grund empfehlen wir den Einsatz mehrerer Tiere während des Trainings.

5. Intratracheale Entbindung

VORSICHT: Ähnlich wie bei der Zungenzugmethode bei der oropharyngealen Entbindung besteht bei der Entbindung durch Intubation die Gefahr, dass das Tier ertränkt wird. Bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen sind 50 μl ein im Allgemeinen sicheres Flüssigkeitsvolumen, das in der Lunge verteilt werden kann.

1. Wenn Sie eine Spritze zur Verabreichung verwenden: Nehmen Sie den Blasenschlauch und den Luer-Lock vom Katheter ab, setzen Sie eine geladene Luer-Slip-Spritze auf und drücken Sie den Kolben, um das gewünschte Volumen (maximal 50 μl) abzugeben.
2. Wenn Sie eine Pipette zur Verabreichung verwenden: Pipettieren Sie das gewünschte Volumen (maximal 50 μl) direkt in den Katheter und lassen Sie die Maus die Lösung inhalieren.
   HINWEIS: Wenn Sie trainieren, sollten Sie einen Indikator wie verdünnte, gefilterte Tusche oder Methylenblau verwenden.
3. Um eine diffuse Abgabe an die Lunge zu gewährleisten, spülen Sie die abgegebene Flüssigkeit mit bis zu 500 μl Luft in die Lunge²⁰. Dies kann entweder mit einer vorgeladenen 0,5-ml-Luer-Lock-Spritze oder einem P1000-Pipettierer mit Filterspitze erfolgen, die sich beide als zuverlässig erwiesen haben. Falls gewünscht, können mehrere Vertiefungen des Pipettierers durchgeführt werden, ohne eine negative Aspiration der abgegebenen Flüssigkeit zu riskieren.
   VORSICHT: Wenn Sie das Tier mit dieser Methode impfen, sollten Sie erwägen, die Inokulumkonzentration zu verringern, da die Verabreichungseffizienz im Vergleich zur oropharyngealen Aspiration oder intranasalen Verabreichung erhöht ist.
   HINWEIS: Bei der Spülung des Inokulums mit Luft kann die Verwendung von mehr als dem Tidalvolumen (~200 μL) erforderlich sein. Die Verwendung von 500 μl birgt jedoch kein Risiko für ein Barotrauma, da es nur etwa die Hälfte der vitalen Kapazität ausmacht²¹. Erwachsene Mäuse haben eine inspiratorische Reservekapazität von etwa ~800 μL, so dass selbst wenn die Maus unmittelbar vor dem Spülen inspiriert hat, kein Barotrauma auftritt²¹. Überlegen Sie, ob niedrigere Luftspülvolumina Ihren Anforderungen an die Verteilung des Inokulums entsprechen könnten (100-200 μl wurden empfohlen).

6. Bewertung der Lieferung

HINWEIS: Dies geschieht nur, wenn man das Verfahren trainiert oder übt.

1. Euthanasieren Sie das Tier auf humane Weise gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll. Hier wurden die CO₂ -Asphyxie als primäre Methode der Euthanasie und die Zervixluxation als konfirmatorische Methode der Euthanasie eingesetzt.
2. Öffnen Sie die Brustwand und entfernen Sie die Lunge. Öffnen Sie dazu das Bauchfell, greifen Sie von der kaudalen Seite auf das Zwerchfell zu und punktieren Sie es mit einer kleinen Schere, wo das Herz zu sehen ist. Dies führt dazu, dass sich die Lunge zurückzieht und mehr Platz gibt, um die Brusthöhle zu öffnen, indem die Rippen durchtrennt werden.
   HINWEIS: Wenn eine Perfusion erforderlich ist, um das Blut in der Lunge zu reduzieren, führen Sie den Eingriff in diesem Stadium durch den rechten Ventrikel des Herzens durch.
3. Spülen Sie die Lunge nach dem Entfernen kurz mit 1 ml sterilem PBS. Legen Sie sie flach auf eine weiße Oberfläche (wie einen chirurgischen Schwamm), um die maximale Fläche freizulegen und gleichzeitig die relative Positionierung des Lappens beizubehalten.
4. Fotografieren Sie die Lunge ex vivo (wir haben ein Mobiltelefon verwendet), öffnen Sie die Bilder in ImageJ und quantifizieren Sie die gefärbten und ungefärbten Bereiche, indem Sie den Umriss der Farbstofffront nachzeichnen. Quantifizieren Sie den gefärbten Bereich mit einem unabhängigen verblindeten Forscher, um Verzerrungen zu vermeiden.
   HINWEIS: Bei Verwendung von Lumineszenz und IVIS, wie in Abbildung 3 gezeigt, sollte anstelle von Schritt 6 eine In-vivo-Live-Bildgebung durchgeführt werden.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1 und Abbildung 3 zu sehen ist, führte die intrapulmonale Inokulation mit der traditionellen Zungenzugmethode (oropharyngeale Verabreichung) zu einer lückenhaften, inkonsistenten Tintenverteilung und einer größeren Variabilität zwischen den Forschern. Im Gegensatz dazu führte die IT-Instillation nach der Intubation zu einer konsistenteren Verabreichung sowohl in die rechte als auch in die linke Lunge und war weniger variabel (Abbildungen 1C und Abbildung 3D). In der Lunge von Tieren, die durch oropharyngeale Aspiration mit Zungenzug Tinte erhalten, ist die Tinte subtil und nur in der Nähe der großen Atemwege von Tieren vorhanden (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu breitete sich die Tinte bei geführter Intubation viel weiter in das Gewebe aus und markierte einen weitaus größeren Bereich der Lunge. Beim Vergleich der mit Tinte gefärbten Lungenoberfläche zwischen den Methoden erwies sich die Intubationsmethode als dem Zungenzug weit überlegen (Abbildung 1B). Die Variabilität in der Menge der zugeführten Tinte war auch unter den Intubationsbedingungen drastisch geringer (Abbildung 1C). Die vergrößerte Färbung der Lungenfläche und die geringere Variabilität in der Flüssigkeitsmenge, die die Lunge erreicht, deuten stark darauf hin, dass die IT-Abgabe dem Zungenzug überlegen ist.

Wie in Video 1 zu sehen ist, haben herkömmliche Endoskope (wie bereits veröffentlicht) eine zu lange Brennweite, um die Stimmlippen zu erfassen und die Platzierung des Endotrachealtubus zu leiten ^6,19. Im Gegensatz dazu hatten Videobilder, die mit einem Consumer-Otoskop aufgenommen wurden (Abbildung S1 und Zeitstempel: 6:34 und 7:05 im Video), eine viel bessere Auflösung, was zu einer verbesserten Visualisierung der Stimmritze führte.

Diese Intubationsmethode umfasst mehrere Überprüfungen der Sondenplatzierung in der Luftröhre. Das Tidalvolumen der Maus war bei Verwendung der Blasenmethode (Abbildung S2 und Zeitstempel: 8:25) leicht erkennbar und dient als endgültige Sicherheit, dass die abgegebene Flüssigkeit in die Lunge gelangt.

Um die Varianz der beiden Verabreichungsmethoden weiter zu beurteilen, untersuchten wir die Transgenexpression im Lungengewebe nach Inokulation von Mäusen mit 1 x 10¹¹ vg AAV6.2-Luciferase unter Verwendung der beiden verschiedenen Methoden (oropharyngeale Instillation durch die Zungenzugmethode oder intratracheale Verabreichung nach geführter Intubation). Sieben Tage nach der Verabreichung des Vektors wurden Lumineszenzmessungen mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) durchgeführt (Abbildung 3A). Dann berechneten wir die mittlere Ausstrahlung über beide Lungen. 10 min vor der Bildgebung (30 s Exposition) wurden ihnen 200 μl Luciferin (15 mg/ml) subkutan injiziert. Wie in Abbildung 3B gezeigt, hatten Tiere, denen der Vektor durch oropharyngeale Instillation verabreicht wurde, ein Lumineszenzsignal, das sowohl im Brust- als auch im Nasenbereich weit verbreitet war. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, denen der Vektor durch intratracheale Verabreichung mittels geführter Intubation verabreicht wurde, eine konzentrierte Lumineszenz in der Lunge. Die durchschnittliche Ausstrahlung bei intubierten Tieren war im Vergleich zur oropharyngealen Verabreichung wesentlich höher, was auf eine verbesserte Effizienz der Vektorabgabe in die Lunge und eine verringerte Variabilität der Verabreichung hinweist, berechnet anhand der Differenz zum Mittelwert (Abbildung 3C und Abbildung 3D).

Die positiven Ergebnisse der Intubationsmethode waren eine replizierbare Instillation von bis zu 50 μl in die Lunge der Maus (durchgeführt in Abbildung 1 und Abbildung 3), mit diffuser Verteilung in der gesamten Lunge (wie in Abbildung 1 gezeigt) und nicht in anderen Bereichen (wie den oberen Atemwegen/der Nase, wie in Abbildung 3 zu sehen).

Jegliche Schädigung des Tieres, übermäßiger Stress, verringertes Flüssigkeitsvolumen, das die Lunge erreicht, schlechte Verteilung des Inokulums in der Lunge oder längerer Trainingsbedarf hätten ein negatives Ergebnis dargestellt, sind aber nicht eingetreten.

Video 1: Eine traditionelle endoskopische Ansicht des Oropharynx und der Stimmlippen der Maus ist unscharf und schwer effektiv zu nutzen. Die Brennweite von 3 cm dieses Endoskops bedeutet, dass die Stimmlippen und die Ausrichtung schwer zu erkennen sind. Zunge unten links. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Abbildung 3: Die Intubation führt zu einer größeren Abgabe an die Lunge mit geringerer Variabilität im Vergleich zur OP-Aspiration. (A) 6-10 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit 1x10¹¹ vg AAV6.2-Luciferase (Penn Vector Core) dosiert und 7 Tage später mit in vivo Biolumineszenz-Bildgebung (IVIS) untersucht. 10 min vor der Bildgebung (30 s Exposition) wurden ihnen 200 μl Luciferin (GoldBio, 15 mg/ml) subkutan injiziert. (Erstellt mit biorender.com) (B) Repräsentative IVIS-Bilder von Mäusen, die AAV6.2-Luciferase durch OP-Aspiration (Zungenzug, links) oder IT-Verabreichung (Intubation, rechts) erhielten. Die interessierenden Bereiche sind gleich groß, und die durchschnittliche Strahldichte innerhalb des Bereichs wird in der Abbildung angezeigt. (C) Quantifizierung des Luciferase-Signals bei OP-Aspiration (n=7) im Vergleich zu Intubationsmäusen (n=5). p<0,0001 durch ungepaarten Welsh-t-Test mit der After-Log-Transformation von Luciferase-Rohdaten. (D) Abweichung vom Mittelwert in Prozent der mittleren durchschnittlichen Strahldichte. (p=0,0381, walisischer T-Test) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Gezeigt werden Beispielbilder aus dem Consumer-Otoskop, das im beschriebenen Protokoll für die geführte Intubation verwendet wird (links) und einem Endoskop mit ähnlichen Kosten und Verfügbarkeit (rechts). Beachten Sie die deutlichen Unterschiede in der Schärfe zwischen den Bildern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Ein Beispielbild, das das Blasenrohr im Einsatz zeigt. Das Atemzugvolumen bewegt das Tröpfchen in der Blasenröhre schnell um mehrere Zentimeter. Das Tröpfchen bewegt sich nur sehr wenig, wenn sich der Schlauch in der Speiseröhre befindet. Die Atemfrequenz und das Atemzugvolumen konnten mit dieser Methode geschätzt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S3: Eine grundlegende Beleuchtungsbaugruppe, die den Kauf eines teuren faseroptischen Beleuchtungssets überflüssig macht. Eine 20 G Nadel wurde durch ein konisches 50 mL dickes 0,75 mm Glasfaserkabel geschoben und mit einer Rasierklinge auf Länge (~1m) geschnitten und mit Klebeband fixiert. Das Fixieren des Katheters war aufgrund des festen Sitzes auf dem Glasfaserkabel nicht erforderlich. Das Befestigen des konischen Deckels über einer Handy-Taschenlampe führt zu einer ausreichenden Lichttransduktion, um eine Intubation in einem abgedunkelten Raum durchzuführen. Diese Montage senkt die Kosten, die ein Labor, das diese Technik einsetzt, übernehmen muss, weiter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Intubation und intratracheale Instillation sind die besten Methoden für die Flüssigkeitsabgabe in die Lunge, aber die zahlreichen Herausforderungen, die die Mausanatomie mit sich bringt, haben eine breite Einführung in Lungenforschungslabors verhindert¹⁵. Obwohl es eine effiziente Verabreichung eines Inokulums an die Lunge gewährleistet, ist ein potenzieller Nachteil der IT-Verabreichung durch diese und andere Intubationstechniken die Umgehung der oberen Atemwege. Die intranasale Verabreichung ist eine bewährte Methode, bei der die oberen Atemwege nicht umgangen werden. Obwohl die intranasale Verabreichung häufig in pulmonalen virologischen Laboratorien verwendet wird und in einigen Fällen wirksamer sein kann²², spiegelt sie nicht den natürlichen Expositionsweg²³ für einige aspirierte Wirkstoffe wider, führt zu variableren Mengen an Inokulum in der Lunge²⁴ und ist weniger wirksam, wenn Isofluran als Anästhetikum^{verwendet wird 5}. Daher wurden umfangreiche Arbeiten an Aerosolisierungsgeräten und deren Vergleich mit anderen pulmonalen Verabreichungstechniken durchgeführt²⁵, aber diese Methoden bergen aerosolassoziierte Gefahren und sind tendenziell teuer. All diese Schwierigkeiten haben dazu geführt, dass die oropharyngeale Instillation durch Zungenzug²⁶ die bevorzugte Methode für die Verabreichung von Lungenflüssigkeit in vielen Laboren ist. Wie wir gezeigt haben, ist diese Methode weitaus variabler als die intratracheale Instillation nach Intubation. Darüber hinaus kann die Verabreichung durch die Zungenzugmethode während der Verabreichung nicht beurteilt werden, und die Mauszunge kann aufgrund der Spannung, die erforderlich ist, um das Schlucken zu verhindern, ein unangemessenes Trauma verursachen. Die Zunge wird auch in der geführten Intubations- und IT-Instillationstechnik gehalten. Da der Video-Feed jedoch eine Stimmritze zeigt, muss ein Forscher, der unsere Methode anwendet, die Kehlkopfpositionierung nicht erzwingen, indem er eine erhebliche Spannung auf die Zunge ausübt. Diese verminderte Traktion führt zu weniger Gewebetraumata. Trotz der erheblichen Vorteile, die Intubation und IT-Instillation mit sich bringen, standen dem Einsatz in einigen Laboren Herausforderungen im Weg. Zum Beispiel: Eine Kompression der Luftröhre aufgrund einer fehlerhaften Kanulation der Speiseröhre kann die Atmung behindern und die Sterblichkeit erhöhen. Ein zu tiefes Einführen des Endotrachealtubus kann zu einer Schädigung der Bronchien der Carina oder des Hauptstamms führen. Und schließlich dauert die Intubation von Mäusen mit herkömmlichen Methoden sehr lange, was sie für die meisten Forscher, die eine zuverlässige intrapulmonale Verabreichung suchen, unpraktisch macht. Unsere Methode befasst sich mit den Schwierigkeiten, die mit der Intubation von Mäusen verbunden sind, und überwindet sogar die anatomischen Barrieren für die Intubation von Mäusen.

Es wurden mehrere Methoden vorgeschlagen, um die anatomischen Herausforderungen der murinen Intubation durch den Einsatz von visuellen Hilfsmitteln zu überwinden. So wurde beispielsweise die Verwendung eines herkömmlichen Endoskops vorgeschlagen⁶. Die lange Brenntiefe des Instruments eignet sich jedoch schlecht für den Einsatz in der Mausin-Intubation (Abbildung S1). Dies ist auch in Video 1 gut zu erkennen, wo die Stimmlippen zwar zu sehen sind, aber verschwommen sind. Klinische Otoskope wurden auch für die direkte Laryngoskopie eingesetzt¹². Die Kosten für klinische Otoskope und das Fehlen eines Video-Feeds machen sie jedoch für die meisten Labore unzugänglich und für die Ausbildung ungeeignet. Die Verwendung eines weit verbreiteten Otoskops für Verbraucher hat die Praktikabilität der geführten Intubation erheblich verbessert. Die kürzere Brennweite, der kleinere Körper und die verlängerte Depressorlippe ermöglichen eine klarere Videoübertragung, eine bessere Manövrierfähigkeit und Positionierung, und die Otoskoplippe kann verwendet werden, um Druck auf die Basis der Zunge auszuüben, was den Zugang zur Rima glottidis verbessert. Neben diesen visuellen Hilfsmitteln wurde die Transillumination auch zur erfolgreichen Visualisierung der Stimmritze und zur Intubation von Mäusen eingesetzt ^7,13,14. Bei auf Transillumination basierenden Ansätzen können jedoch Enthaarungsmittel auf dem Bereich über dem Maushals, in unmittelbarer Nähe zu einer heißen Lichtquelle, die Verwendung der Nadel innerhalb des Katheters, das Einführen scharfer Instrumente in den Mund der Maus und/oder ein kleiner Schnitt über der Luftröhre erforderlich sein, um die Platzierung zu bestätigen. Die hier beschriebene Methode vermeidet diese Risiken und baut auf den besten Aspekten dieser veröffentlichten Methoden auf. Neben der Überwindung anatomischer Barrieren bei der Intubation wurden bei unserer Methode auch Kostenaspekte berücksichtigt.

Zusammen machen die Verwendung von helfenden Händen, einem Mausständer, dem Otoskop und einem faseroptischen Licht die Intubation einfacher zu erlernen und viel schneller durchzuführen, bei geringeren Kosten für die Labore. Die Kosten für den handelsüblichen Intubationsständer können durch die Verwendung eines handgefertigten Intubationsständers^{vermieden werden 27}. Die Kosten für die faseroptische Lichtbaugruppe können durch den separaten Kauf des Glasfaserkabels gedeckt werden (zu einem viel geringeren Preis, ~ $ 9 gegenüber 218 $ - Kent Scientific - zum Zeitpunkt des Schreibens). Um die faseroptische Lichtquelle zu vervollständigen, kann ein konischer 50-ml-Deckel mit einer Lochblende und Klebeband verwendet werden, um das Licht einer Handy-Taschenlampe zu sammeln (siehe Abbildung S3 und Materialtabelle). Das et. al beschreiben eine ähnliche Vorrichtung¹¹. Für einige Labore können die reduzierten Kosten dieser Lösung unsere Methode zu einem viel zugänglicheren Verfahren machen. Abgesehen von den Kosten hat die Schwierigkeit bei der Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus die Intubation von Mäusen entmutigend gemacht.

Um zu bestätigen, dass der Endotrachealtubus richtig positioniert ist, haben sich die Forscher in der Vergangenheit auf das Vernebeln von Spiegeln verlassen, indem sie einen Zahnspiegel über den Endotrachealtubus¹⁸ hielten. Das geringe Atemzugvolumen und Schwankungen der Raumtemperatur verhindern jedoch oft das Beschlagen der Spiegel und führen zu Fehleinschätzungen. Bei der murinen Intubation stellt dies ein ernsthaftes Verletzungsrisiko dar. Andere haben auf die Induktion von Atemnot zurückgegriffen, indem sie den Endotrachealtubus¹⁰ verstopften. Dies verursacht erheblichen Stress für das Tier und liefert weniger Informationen als die "Blasenmethode". Des Weiteren kann die Einführung von Lungentherapeutika und Luft in den Magen aufgrund einer unzureichenden Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus zusätzlich zur Behinderung der Wirksamkeit des verabreichten Mittels Stress verursachen. Die Anwendung der "Bubble-Methode" bietet eine schnellere und zuverlässigere visuelle Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus und stellt eine geringfügige Verbesserung gegenüber einer ähnlichen Methode dar, die zuvor beschrieben wurde²⁸. Die "Bubble-Methode" ermöglicht es einem Forscher auch, die Atemfrequenz und das Atemzugvolumen des Tieres grob abzuschätzen.

Die Positionierung der Tiere und die Visualisierung der Stimmlippen sind der Schlüssel zu dieser Technik. Wir fanden heraus, dass pädiatrische Nasenspekula zu groß und umständlich waren, um den Mund offen zu halten und die Wangen während der Intubation aus dem Weg zu räumen, aber sie waren während des Trainings sehr hilfreich, da sie es einem Forscher ermöglichten, die Platzierung des Otoskops zu demonstrieren. Es ist schwierig, einen Auszubildenden dazu anzuleiten, die relevante Anatomie zu erkennen, und eine verbesserte Sichtbarkeit im Mund der Maus war der Schlüssel, was durch den Einsatz des kommerziellen Otoskops erheblich unterstützt wurde. Die Inszenierung mit einer beleuchteten Lupe und helfenden Händen ist ein wesentlicher Bestandteil der Unterstützung unerfahrener Bediener bei der Intubation, obwohl sie für erfahrene Bediener möglicherweise nicht so wichtig ist.

Während des Trainings in dieser Methode kann eine Fehlerbehebung erforderlich sein. Wenn der Endotrachealtubus wiederholt in die Speiseröhre eintritt, kann sich die Stimmritze verkrampft haben, der weiche Gaumen kann entzündet sein und die richtige Platzierung kann schwieriger sein. Lassen Sie das Tier unter diesen Umständen einige Minuten lang genesen, bevor Sie erneut versuchen, es zu intubieren. Die Anzahl der Wiederholungsversuche sollte im IACUC-Protokoll angegeben und immer eingehalten werden. Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Stimmlippen zu sehen, kann die Atemfrequenz aufgrund von zu viel Anästhesie unterdrückt werden, oder die Positionierung der Maus kann unangemessen sein (meistens Kopf zu weit nach hinten geneigt). Positionieren Sie in diesem Fall das Tier neu und lassen Sie es sich von der Narkose erholen, bevor Sie es erneut versuchen. Das Blasenrohr sollte das Atemzugvolumen des Tieres deutlich sichtbar machen. Wenn sich die Blase nur leicht bewegt, kann Keuchen aufgrund des Drucks, der durch einen falsch platzierten Endotrachealtubus auf die Luftröhre ausgeübt wird, diese Bewegung verursachen. In diesem Fall beziehen Sie sich auf Zeitstempel: 8:25 und Abbildung S3 , um zu sehen, wie leicht das Tidalvolumen erkennbar ist, wenn die "Blasenröhre" an einem korrekt platzierten Endotrachealtubus verwendet wird. Wenn Ihr Endotrachealtubus verlegt ist, entfernen Sie ihn sofort und lassen Sie das Tier sich erholen, bevor Sie den Eingriff erneut versuchen.

Obwohl die Intubation und die intratracheale Instillation anderen Methoden weit überlegen sind, waren sie technisch zu schwierig, um sich in der Breite durchzusetzen. Die hier beschriebenen Methoden machen die intratracheale Instillation und die murine Intubation zugänglich und praktikabel. Obwohl zukünftige Anwendungen dieser Technik stark davon abhängen, was in die Lunge abgegeben wird und in welchem Kontext sie verabreicht werden, ebnet eine einfache und zuverlässige Methode den Weg für viele Fortschritte in der Lungenbiologie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fiber Optic LightiFiber Optic Lighting Kit, Maus	Kent Scientific	ETI-12ETI--02	Eine Komponente der Glasfaserbaugruppe, kompatibel mit anderen Leuchten und dem Ersatz-Glasfaserkabel unten
Alternative Faseroptische Baugruppe	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	eine Alternative, nicht diskutiert (aber wir sehen keinen Grund, warum sie nicht funktionieren würde)
Alternative Faseroptische Montage	Harvard Gerät	72-9075	eine Alternative, nicht diskutiert (aber wir sehen keinen Grund, warum sie nicht funktionieren würde)
Alternative faseroptische Montage	Handgefertigt von Labor	N/A	Anleitung hier unter Verwendung eines Gummistopfens: DOI 10.3791/50318
Alternative faseroptische Montage	Handgefertigt von Labor	N/A (unten aufgeführte Materialien)	Hergestellt aus einem konischen 50-ml-Deckel, Klebeband und 0,75 mm faseroptischen
Faser-Intubationsständer, Maus	Kent Wissenschaftlich	ETI--01	Verstellbarer Ständer für die Intubation, viele selbstgebaute Versionen verfügbar, Spitzengestelle und Holzplattformen verwendet, einige Alternativen aufgelistet, viele geeignete Alternativen verfügbar.
Alternative Intubationsständer	Braintree Scientifuc	RIS 100	eine Alternative, nicht diskutiert (aber wir sehen keinen Grund, warum sie nicht funktionieren würde)
Alternative Intubationsständer	Natsume Seisakusho	KN-1014	eine Alternative, nicht diskutiert (aber wir sehen keinen Grund, warum sie nicht funktionieren würde)
Alternative Intubationsständer	Vetland	000A3467	eine Alternative, nicht diskutiert (aber wir sehen keinen Grund, warum sie nicht funktionieren würde)
Alternative Intubationsständer	Handgefertigt von Labor	N/A	Hergestellt aus einem 3-Ringordner hier: DOI 10.3791/60844 (mehrere alternative Methoden veröffentlicht)
Nicht resorbierbares geflochtenes Seidennaht, Größe 0	Fine Science Tools	18020-00	nicht länger als 1 Zoll beschädigt die Carina
Safelet IV Katheter 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Oder ähnlich
RS-5358 Mikro-Präparierzange	Fisher	RS-5358	Oder ähnlich, beinhaltet helfende Hände
Lupe mit Licht und Ständer, EOOKU Flexible Magnetic Helping Hand, 5X& 10X 12V 108pcs LED-Perlen Lupenlampe, 3 Modi einstellbare schwenkbare Schwanenhalsarme & Heavy Duty Bodenplatte	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Flexibel-verstellbarer-Schwanenhals /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9..com gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfyfy gaSMgW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& keywords=Vergrößerung+Glas+mit +Licht+EOOKU+3+in+1& qid=1709661 709& sprefix=Vergrößerung+Glas+mit+ Licht+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	Oder ähnlich, jede gebogene, fein gezackte Pinzette funktioniert
Ohrenschmalzentfernung - Ohrenschmalzentferner-Werkzeug mit 8 Stück Ohrset - Ohrenreiniger mit Kamera - Ohrenschmalzentfernungsset mit Licht - Ohrkamera mit 6 Ohrlöffeln - Ohrenreiniger für iOS & Android (Schwarz)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Entfernen-Android%EF% BC%88Schwarz%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1	oder ähnlich, mehrere Marken verfügbar
AZIMOM PMMA Kunststoff End Glow Glasfaserkabel 0,75 mm (0,02 Zoll) 100 m (328 Fuß) / Rolle für Sternenhimmel Decke Alle Arten von LED-Lichtmotor Treiber Quelle	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Kunststoff-schneidbare-Decke-1 Stück0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY..AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& Schlüsselwörter=fiber%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1	Oder ähnlich, Faser wird verwendet, um das Gerät in Linie 7 zu bauen
50 ml konisches Röhrchen	Cell Treat	, 229421	jeder undurchsichtige 50 ml-Schraubverschluss mit konischem Deckel aus Kunststoff funktionieren sollte. Kommt nicht in Kontakt oder Nähe mit dem Tier, daher ist keine Sterilität erforderlich
Isofluran	VetOne	Consult Tierarzt
Innoculum	N/A	Spezifisch für Ihr Experiment
Pipettenspitzen (Filter)	N/A	Sterilfilter p100 und p1000 Spitzen verwendet	Marke/Lieferant nicht relevant
Induktionskammer	N/A	Wie bei Ihrer Institution verfügbar	Marke/Lieferant nicht relevant
Isopropanol Prep Pads	N/A	Für die Reinigung von Instrumenten	Marke/Lieferant nicht relevant
Schläuche	N/A	flexible Schläuche mit kleinem Durchmesser funktionieren	Für den Bau von "Bubble Tube"  (unseres hat einen Durchmesser von ~3 mm und wurde aus einer Infusionsleitung entnommen)
Luer-Lock	N/A	passend für Ihren obigen Schlauch	Für den Bau von "Bubble Tube"
3M Halbgesichtsmaske Atemschutzmaske	3M	17-986-9B	zur Begrenzung der Gasbelastung
Twist Tie	N/A	N/A	, um die U-Form des Blasenschlauchs beizubehalten