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Methodenartikel

Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis

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DOI:

10.3791/67679

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11. Juli 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung, Ernte und Konzentration von sezernierten Proteinen von Mycobacterium tuberculosis. Kulturfiltratproteine (CFPs) werden quantifiziert, durch isoelektrische Fokussierung in 20 Fraktionen getrennt und mit einem präparativen SDS-PAGE und einem Elektroelutionssystem weiter in 30 Fraktionen aufgelöst.

Zusammenfassung

Sekretierte Proteine von Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Tuberkulose, der Immunmodulation und dem Fortschreiten der Krankheit. Das Verständnis ihrer Zusammensetzung und Funktion ist entscheidend für die Identifizierung neuartiger Biomarker, die bei der Tuberkulosediagnose, der Impfstoffentwicklung und therapeutischen Interventionen helfen können. Diese Studie konzentriert sich auf die systematische Isolierung, Fraktionierung und Charakterisierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs), um umfassende immunologische und proteomische Analysen zu ermöglichen. CFPs wurden aus M . tuberculosis H37Rv-Kulturen gewonnen, die unter chemisch definierten Bedingungen gezüchtet wurden, um eine kontrollierte Proteinexpression zu gewährleisten. Der Kulturüberstand wurde durch Filtration gereinigt und mit einem Hohlfasersystem konzentriert, um Proteine über 10 kDa zurückzuhalten. Die Fraktionierung wurde durch isoelektrische Fokussierung in der flüssigen Phase erreicht, bei der Proteine basierend auf ihren isoelektrischen Punkten in 20 verschiedene Fraktionen unterteilt wurden. Eine weitere Auflösung erfolgte mittels präparativer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von einer Elektroelution, die 30 Proteinfraktionen ergab. Die auf diese Weise gewonnenen fraktionierten Proteine stellen eine wertvolle Ressource für immunologische Profilerstellung und massenspektrometrische Proteomanalysen dar. Durch die systematische Isolierung und Charakterisierung sekretierter Proteine trägt diese Studie zur Identifizierung von Tuberkulose-spezifischen Protein-Biomarkern bei, die die diagnostische Genauigkeit verbessern und unser Verständnis der Pathogenese von M. tuberculosis verbessern könnten.

Einleitung

Umfangreiche Forschungen haben die bedeutende Rolle sekretierter Proteine beim Wachstum und den Immuninteraktionen von Mycobacterium tuberculosis1 hervorgehoben. Das Kulturfiltrat von M. tuberculosis enthält eine komplexe Reihe von Protein- und Nicht-Proteinkomponenten, was es zu einer wertvollen Ressource für das Verständnis seiner Biologie und immunogenen Eigenschaften macht. Frühe proteomische Studien identifizierten fast 450 Proteine in der Kultur Filtrat2, von denen viele eine entscheidende Rolle bei der Auslösung von Immunantworten gegen Tuberkulose spielen. Die Identifizierung dieser immunologisch relevanten Antigene ist für die Entwicklung innovativer Diagnostika und Impfstoffe gegen Tuberkulose unerlässlich. Der Fortschritt in diesem Bereich wird jedoch durch die Komplexität der Immunantwort auf eine M . tuberculosis-Infektion und die technischen Grenzen der biochemischen Reinigungsmethoden zur Isolierung mykobakterieller Proteine in Frage gestellt.

Verschiedene Trenntechniken wurden eingesetzt, um M. tuberculosis-Proteine aufzulösen, was den Nachweis kleinerer, aber funktionell bedeutsamer Proteine erleichtert und den Umfang proteomischer Studien erweitert. Eine ideale Trennmethode löst komplexe Proteinmischungen effektiv in eine begrenzte Anzahl unterschiedlicher Fraktionen auf. Zwei weit verbreitete Ansätze zur Trennung mykobakterieller Proteine sind chromatographiebasierte und elektrophoresebasierte Methoden 1,2.

Chromatographische Techniken, einschließlich Affinitäts-, Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie, sind seit über einem Jahrzehnt der Eckpfeiler der Proteinfraktionierung. Diese Methoden wurden in großem Umfang zur Trennung von M. tuberculosis-Proteinen eingesetzt 3. Sie sind jedoch durch Faktoren wie geringe Proteinausbeuten und Interferenzen durch Nicht-Protein-Komponenten begrenzt, was spätere immunologische Analysen erschweren kann. Diese Nachteile schränken den Nutzen der Chromatographie für die Identifizierung immunologisch relevanter Antigene ein.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein zweidimensionales, auf Elektrophorese basierendes Trennverfahren eingesetzt. In der ersten Dimension werden Proteine auf der Grundlage ihrer isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einem präparativen IEF-System getrennt, das Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten segregiert. In der zweiten Dimension werden die Proteine weiter durch Molekulargewicht unter Verwendung von präparativem SDS-PAGE aufgelöst, gefolgt von der Elution mit einem Ganzgel-Eluter-Instrument.

Dieser zweidimensionale Ansatz bietet mehrere Vorteile. Es reduziert die Komplexität von Kulturfiltratproteinen (CFP) erheblich, indem es sie in 600 verschiedene Fraktionen fraktioniert. Darüber hinaus sind die Fraktionen für die direkte immunologische Analyse geeignet, da der Elutionsprozess keine Komponenten einbringt, die die zellulären immunologischen Assays stören 4,5,6.

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung und Trennung von Kulturfiltratproteinen für die immunologische Analyse6.

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Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Wachstum von Mycobacterium tuberculosis und Herstellung von Kulturfiltratproteinen (CFPs)

  1. Aufbereitung des flüssigen Mediums von Sauton
    1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Glycerin, 30,0 ml; Kaliumdihydrogenorthophosphat (KH2PO4), 0,5 g; Magnesiumsulfat, 0,5 g; Zitronensäure, 2,0 g; Kaseinhydrolysat, 0,5 g; Eisen(III)-Ammoniumsulfat, 0,05 g; Natriumglutamat, 4,0 g.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit 40 % Kaliumhydroxid (ca. 5 ml/l) auf 7,2 ein.
    3. Füllen Sie das Volumen auf 1 l auf und autoklavieren Sie 20 Minuten lang bei 15 psi.
  2. Herstellung der mykobakteriellen Suspension
    1. Kolonien von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), die an Lowenstein-Jensen (LJ)-Hängen gezüchtet wurden, werden in 2 mL des flüssigen Sauton-Mediums überführt.
    2. Brechen Sie mykobakterielle Klumpen durch kräftiges Schütteln mit Glasperlen unter sterilen Bedingungen auf.
  3. Initiierung des Wachstums von Mykobakterien
    1. Übertragen Sie die Bakteriensuspension in eine McCartney-Flasche mit 10 ml Sauton's Flüssigmedium.
    2. Inkubieren Sie die Flasche 2 Wochen lang bei 37 °C.
  4. Skalierung der Kultur
    1. Übertragen Sie die gewachsene Kultur in 200 mL Sauton's Medium in einer 1 L Flasche.
    2. 4 Wochen lang auf einem Shaker bei 37 °C inkubieren.
    3. Die logaritäre Phasenkultur wird in einen 4-l-Kolben mit 2 l Sauton-Medium überführt.
    4. Lassen Sie die Kultur weitere 4 Wochen bei 37 °C unter stationären Bedingungen wachsen, bis sich ein Oberflächenpellikel bildet.
  5. Ernte der Kultur Filtratproteine (CFPs)
    1. Ernten Sie die Kultur durch Zentrifugation bei 1.000-1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
    2. Filtern Sie den Überstand durch ein 0,45 μm Vakuumfiltrationssystem.
    3. Das CFP-haltige Filtrat wird unter Verwendung eines Tangentialflussfiltrationssystems mit einer Abschaltung von 10 kDa konzentriert.
  6. Lagerung des geernteten CFP
    1. Schätzen Sie den Proteingehalt mit dem kommerziell erhältlichen BCA-Assay-Kit.
    2. Aliquotieren Sie die Proteine, geben Sie Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % hinzu und lagern Sie sie bei -80 °C.

2. Präparative isoelektrische Fokussierung in der Flüssigphase (IEF)

  1. Vorbereitung der Proteinprobe
    1. Solubilizieren Sie Mycobacterium tuberculosis CFP in 60 ml IEF-Trennpuffer, der 8 M Harnstoff, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 5 % Glycerin, 2 % Digitonin, 2 % Ampholyte enthält (pH 3,0-10,0 und pH 4,0-6,0 im Verhältnis 1:4).
  2. Einrichten des IEF-Systems
    1. Füllen Sie die Anodenkammer mit 0,1 M Phosphorsäure und die Kathodenkammer mit 0,1 M Natriumhydroxid.
    2. Montieren Sie die präparative IEF-Zelle gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  3. Ausführen von IEF
    1. Laden Sie bis zu 350 mg Protein in das IEF-System.
    2. Fokussieren Sie Proteine bei 4 °C mit einem kühlenden Wasserkreislaufsystem.
    3. Legen Sie eine konstante Leistung von 12 W an, bis sich die Spannung bei ca. 1400 V stabilisiert hat, und fahren Sie dann weitere 30 Minuten fort.
  4. Sammeln und Analysieren der Fraktionen
    1. Ernten Sie IEF-Fraktionen und bestimmen Sie ihren pH-Wert.
    2. Analysieren Sie jedes Aliquot mit SDS-PAGE und visualisieren Sie Proteine mittels Silberfärbung.

3. Präparative SDS-PAGE und Ganzgel-Elution

  1. Vorbereiten von Mustern für SDS-PAGE
    1. Mischen Sie IEF-Fraktionen mit handelsüblichem 6x SDS-PAGE-Probenpuffer.
    2. Die Mischung bei 95 °C 5 Min. erhitzen.
  2. Vorbereitende SDB-PAGE ausführen
    1. Laden Sie bis zu 10 mg Protein in ein 16 cm × 20 cm Polyacrylamid-Gel mit einem 4%igen Stapelgel und einem 12,5%igen Auflösungsgel.
    2. Führen Sie die Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 50 mA durch, bis die Farbstofffront 2 cm von unten entfernt ist.
  3. Eluieren von Proteinen aus dem Gel
    1. Äquilibrieren Sie das Gel in Elutionspuffer (60 mM Tris, 40 mM CAPS, pH 9,4) für 10 Minuten.
    2. Übertragen Sie das Gel auf das Ganzgel-Eluter-Instrument.
    3. Eluieren Sie Proteine, indem Sie 1 h lang einen konstanten Strom von 250 mA anlegen.
  4. Sammeln und Analysieren der Fraktionen
    1. Eluieren Sie die getrennten Proteine in 30 einzelne Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 2,5 mL.
    2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Proteinschätzungsmethode gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. Analysieren Sie 10 μg Protein aus jeder Fraktion mit SDS-PAGE und visualisieren Sie sie mit Hilfe der Silberfärbung.

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Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht die Komplexität der hergestellten Kulturfiltratproteine (CFP). Zunächst wurden 100 μg CFP einer 2D-SDS-PAGE-Analyse unterzogen, um die Komplexität zu bewerten. Diese Analyse ergab das Vorhandensein von fast 100 verschiedenen Proteinflecken in der CFP (Abbildung 1).

Die 20 Fraktionen, die bei jedem Lauf gesammelt wurden, wurden mit SDS-PAGE analysiert. Davon sind drei repräsentative Fraktionen aus drei versc...

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Diskussion

Kulturfiltratproteine (CFPs) von Mycobacterium tuberculosis stellen ein komplexes Gemisch verschiedener Proteinkomponenten dar, die in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. Proteomische Studien haben bis zu 1.314 Proteine innerhalb des CFPidentifiziert 4,5. Zahlreiche Untersuchungen haben die entscheidende Rolle von GFPs bei der Modulation von Immunantworten hervorgehoben. Insbesondere spielen CFPs eine unverzicht...

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ä KTA Flussmittel-Tangentialfluss-Filtersystem CYTIVA29038437
Ampholyte (pH 3,0 bis 10,0 )BIO-RAD1632094
Ampholyte (pH 4,0 bis 6,0 )BIO-RAD1631143
BCA-Protein-Assay MERCK71285-M
MÜTZENMERCKNr. C2632
KaseinhydrolysatMERCK65072-00-6
ZitronensäureMERCKNr. C0759
DigitoninMERCK300410
DVB-TMERCKNr. D9779
Eisen(III)-AmmoniumsulfatHIMEDIAGRM10944
GlycerinMERCKNr. G5516
Glycerin MERCK252859
Löwenstein-Jensen neigt sich HIMEDIANr. SL001
MagnesiumsulfatMERCKM7506
Millipore Stericup Schnellwechsel-VakuumfiltrationssystemMERCKS2HVU11RE
Phosphorsäure MERCK695017
KaliumdihydrogenorthophosphatMERCKNr. P0662
Kaliumhydroxid MERCK484016
Präparative IEF-Zelle (Rotofor) BIO-RAD170-2986 
Natriumazid MERCKNr. 2002
NatriumglutamatMERCK49621
NatriumhydroxidHIMEDIANr. MB095
TrisMERCK252859
HarnstoffMERCKU5128
Ganzes Gel Eluter Gerät BIO-RAD1651250

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Proteinfraktionierungisoelektrische FokussierungSDS-PAGEProteinbiomarkerimmunologisches ProfilingTangentialflussfiltrationproteomische AnalyseT-Zell-Antigene
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