Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll trennt unlösliche Zellwand- und Membranproteine in einfache Fraktionen (1-5 Proteine) unter Verwendung der präparativen isoelektrischen Fokussierung (IEF) auf der Grundlage des isoelektrischen Punktes, gefolgt von der Trennung nach Molekulargewicht. Die resultierenden Fraktionen können ohne weitere Reinigung direkt für die immunologische und proteomische Analyse verwendet werden.

Zusammenfassung

Mycobacterium-Zellwand- und Membranproteine, die eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der Tuberkulose spielen, wurden erfolgreich mit der präparativen isoelektrischen Fokussierung (IEF) und der präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt. Gefolgt von der Gelelution, die die Einschränkungen herkömmlicher Methoden zur Trennung hydrophober Proteine überwindet. Bei diesem Verfahren wurden M . tuberculosis-Kolonien aus Lowenstein-Jensen-Schrägen in 2 ml 7H9-Brühe überführt, mit Glasperlen dispergiert und 2 Wochen lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Kultur auf 200 mL hochskaliert und 4 Wochen lang in einem Shaker gezüchtet. Es wurde weiter auf 1 L mit 500 mL 7H9-Brühe hochskaliert und für weitere 4 Wochen angebaut. Gewachsene Mykobakterien wurden durch Zentrifugation bei 1741 × g für 30 min pelletiert. Für jedes 2-g-Pellet wurde 1 ml Brechpuffer hinzugefügt und die Probe beschallt. Das Lysat wurde bei 3436 × g für 15 min zentrifugiert, um ununterbrochene Zellen zu entfernen, und der Überstand wurde konzentriert. Dieser Überstand (Ganzzelllysat) wurde bei 13751 × g für 30 min zentrifugiert, um Zellwandproteine zu pelletieren. Der verbleibende Überstand wurde 4 h lang bei 100.000 × g ultrazentrifugiert, um die Zellmembran und das Zytosol zu trennen. Die isolierten Zellwand- und Membranproteine wurden bei 4 °C auf ein flüssiges präparatives IEF-System geladen und bei 12 W getrennt, bis sich die Spannung bei 1400 V stabilisiert hatte, wodurch 20 Fraktionen getrennt wurden. Diese IEF-Fraktionen wurden weiter durch präparatives SDS-PAGE getrennt, und die Proteine wurden mit einem Ganzgel-Eluter bei 250 mA eluiert, was zu 30 Fraktionen führte. Durch dieses Protokoll konnten wir neuartige M. tuberculosis-Zellwände und membranspezifische Biomarker identifizieren, und es zeigt auch Potenzial für die Charakterisierung ähnlicher Proteine in anderen Krankheitserregern.

Einleitung

Immunologische Studien haben gezeigt, dass die menschliche Immunantwort auf Krankheitserreger wie M. tuberculosis neben löslichen Proteinen, die leicht zu reinigen sind, auch das hydrophobe Protein in der Zellwand¹ und den Zellmembranproteinen² von Mycobacterium tuberculosis ist. Diese Zellwand- und Membranproteine spielen eine entscheidende Rolle bei der immunologischen Kontrolle gegen viele Krankheitserreger, einschließlich der Tuberkulose. Einige dieser Proteine werden als immundominante Antigene beschrieben, die die T- und B-Zell-Antwort auslösen. Im Gegensatz dazu werden andere Proteine als molekulare Signaturen von Krankheitserregern identifiziert, von denen anerkannt wird, dass sie eine angeborene Immunantwort auslösen, wie z. B. pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) von Immunzellen, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird. Zum Beispiel werden mykobakterielle Lipoproteine wie LprG, LpqH, LprA und PhoS1 vom Toll-like-Rezeptor 2³ erkannt.

Die hydrophobe Natur von Zellwand- und Membranproteinen stellt erhebliche technische Herausforderungen in Bezug auf ihre Solubilisierung und Trennung dar. Studien haben gezeigt, dass Membranproteine etwa 20 % bis 30 % der kodierenden Regionen aller Organismen, einschließlich Mykobakterien, ausmachen ^4,5. Aufgrund ihrer intrinsischen Beschaffenheit und technischen Herausforderungen sind Zellwand- und Membranproteine im Vergleich zu löslichen Proteinen schwieriger zu solulisieren und zu isolieren. Infolgedessen wurden nur 2 % der Membranproteinstrukturen berichtet⁶. Mehrere Faktoren tragen dazu bei, dass es schwierig ist, diese Proteine zu isolieren. Die größte Herausforderung ist ihre geringe Häufigkeit innerhalb der Zelle, was die Isolierung einzelner Proteine für die weitere Charakterisierung erschwert⁷. Darüber hinaus neigen diese Proteine dazu, sich zu aggregieren, was ihre Löslichkeit weiter erschwert. Dieses Problem kann durch die Zugabe von Detergenzien zur Unterstützung der Solubilisierung behoben werden. Einige Proteine können jedoch auch in Gegenwart von Detergenzien noch Aggregate bilden, in diesem Fall können Chaotropika und Reduktionsmittel verwendet werden, um die Löslichkeit zu verbessern.

Die Verwendung von Detergenzien zur Solubilisierung kann nachfolgende Trennmethoden beeinträchtigen. So können beispielsweise geladene Detergenzien nicht mit der Ionenaustauschchromatographie verwendet werden, und alle Detergenzien können die hydrophobe Interaktionschromatographie stören⁸. Daher ist die Auswahl eines Reinigungsmittels, das mit der gewählten Trennmethode kompatibel ist, von entscheidender Bedeutung. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Isolierung von Zellwand- und Membranproteinen ist die Entfernung von Detergenzien, die zur Solubilisierung verwendet werden, da diese die anschließende funktionelle Analyse der Proteine beeinträchtigen können.

Wir haben eine robuste Methodik entwickelt, die viele der Herausforderungen überwindet, die mit der Analyse von Membranproteinen verbunden sind, insbesondere der hydrophoben Proteine aus der Zellwand und der Zellmembran. Eine zentrale Herausforderung bei der Untersuchung dieser Proteine ist ihre Solubilisierung, da sie aufgrund ihrer hydrophoben Natur schwer zu extrahieren und zu analysieren sind. Die hier beschriebene Methodik verwendet einen speziell formulierten isoelektrischen Fokussierungspuffer (IEF), der Zellwand- und Zellmembranproteine effizient auflöst. Dieser Solubilisierungsschritt ist von entscheidender Bedeutung, da er die anschließende Analyse dieser hydrophoben Proteine ermöglicht.

Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist ihre Fähigkeit, die Komplexität der Proteinmischung zu reduzieren. Durch den Einsatz von zwei komplementären Trenntechniken - basierend auf dem isoelektrischen Punkt (pI) und dem Molekulargewicht von Proteinen - trennt diese Methode Zellwand- und Zellmembranproteine effizient in vereinfachte Fraktionen. Jede Fraktion enthält in der Regel nur ein bis drei Proteine, was die Auflösung erheblich erhöht und die nachgelagerte Charakterisierung erleichtert.

Diese Methodik, die unter Verwendung von Mycobacterium tuberculosis-Zellwand - und Zellmembranproteinen als Modellsystem entwickelt wurde, adressiert effektiv die Herausforderungen, die mit der Isolierung und Analyse hydrophober Proteine verbunden sind. Es bietet einen zuverlässigen Ansatz für die Isolierung, Trennung und Charakterisierung dieser komplexen Proteinfraktionen und verbessert die Fähigkeit, sie im Detail zu untersuchen.

Protokoll

Diese Studie entsprach den einschlägigen behördlichen Richtlinien und wurde vom Institutionellen Wissenschaftlichen Beirat und der Ethikkommission genehmigt. Die Einwilligungserklärung der Studienpopulation wurde eingeholt, bevor die Stichproben gezogen wurden.

1. Kultivierung von M. tuberculosis

1. Übertragen Sie ca. 10 M. tuberculosis-Kolonien aus Lowenstein-Jensen-Schrägen auf 2 ml 7H9-Bouillonmedium (suspendieren Sie 2,35 g Middlebrook 7H9 Bouillonbase in 400 mL destilliertem Wasser, 50 mL Ölsäurealbumin-Dextrose-Katalase-Ergänzung, 0,5 g Tween 80 und stellen Sie bis zu 500 mL auf)
   HINWEIS: M. tuberculosis ist ein Erreger der Risikogruppe 3; Es sollte in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) in der BSL3-Anlage gehandhabt werden. Es muss eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden.
2. Dispergieren Sie die Zellen mit Glasperlen unter sterilen Bedingungen in einem Flaschenschüttler bei 15 U/min für 1 min.
3. Die Bakteriensuspension wird in 10 ml 7H9-Brühemedium in einer McCartney-Flasche überführt und 2 Wochen lang bei 37 °C in einem Shaker-Inkubator bei 30 U/min inkubiert.
4. Skalieren Sie die logarithmische Phasenkultur auf 200 ml 7H9-Bouillonmedium und züchten Sie sie 4 Wochen lang in einer Shaker-Kultur bei 30 U/min.
5. Skalieren Sie die Kultur in einem 1-Liter-Kolben mit 500 mL 7H9-Bouillonmedium hoch und züchten Sie sie als Schüttelkultur bei 30 U/min für 4 Wochen bei 37 °C.
6. Ernten Sie die Mykobakterien, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 1741 g zentrifugieren.

2. Herstellung von Ganzzell-Lysatproteinen

1. Setzen Sie das isolierte Bakterienpellet einer Beschallung nach einem Standardprotokoll aus.
2. Bereiten Sie den Brechpuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: 20 mM Tris mit 8,5 % (8,5 g pro 100 mL) NaCl.
3. Stellen Sie den endgültigen pH-Wert mit konzentriertem HCl auf 7,4 ein.
4. Frisch zubereitete Proteaseinhibitoren in den Breaking-Puffer mit den folgenden Konzentrationen geben (Einzelheiten zu den hinzuzufügenden Proteaseinhibitoren sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt)
5. M . tuberculosis-Bazillen (100 ml gepacktes Volumen und gewogen) pro 2 g des Bakterienzellpellets behandeln, 1 ml Brechpuffer mit Lysozym (1 mg/5 ml Zellsuspension) zugeben und 15 Minuten bei 37 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
6. Suspendieren Sie die Bazillen im doppelten Volumen ihres Brechpuffers.
7. Fügen Sie dem Puffer 0,04 % (wt/vol) Natriumazid und 0,05 % Tween 80 hinzu.
8. Zerstören Sie die Bakterienzellen im Brechpuffer mit einem Ultraschallgerät mit einem Zyklus von 9 s an und 9 s aus für 30 Minuten bei 40 % Amplitude, wobei die Suspension auf Eis gehalten wird, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern.
9. Das vorbereitete Lysat bei 3438 g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um unzerbrochene Zellen zu entfernen.
10. Der Überstand wird mit Zentrifugalkonzentratoren (3 kDa Cutoff-Gehalt - 5 ml) konzentriert.
11. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration im Überstand mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinquantifizierungsassay unter Verwendung des BSA-Proteins als Standard.
    HINWEIS: Laden Sie in der SDS-PAGE-Analyse 50 μg Protein für die Analyse.

3. Isolierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen durch Ultrazentrifugation

1. Isolierung von Zellwand-, Zellmembran- und zytosolischen Proteinen aus dem Ganzzelllysat gemäß dem Protokoll von Raja et ^al.9. wie unten beschrieben.
2. Das Ganzzelllysat bei 13751 × g bei 4 °C für 30 min zentrifugieren und die Zellwandproteine als Pellet trennen.
3. Der Überstand wird 4 h lang mit einer Ultrazentrifuge bei 100.000 × g bei 4 °C ultrazentrifugiert, wobei die Zellmembranproteine als Pellet abgetrennt werden und die zytosolischen Proteine im Überstand verbleiben.
4. Schätzen Sie die Proteinkonzentrationen in der Zellwand und in den Zellmembranfraktionen mit dem BCA-Protein-Assay.
   HINWEIS: Laden Sie in der SDS-PAGE-Analyse 50 μg Protein für die Analyse. Die getrennte Zellwand und Zellmembran werden bis zur weiteren Analyse in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert.

4. Präparative isoelektrische Fokussierung der Flüssigphase (Rotofor [IEF-Vorrichtung])

1. Solubilisieren Sie die durch Ultrazentrifugation isolierten Zellwand- und Zellmembranproteine in einem IEF-Puffer, der 8 M Harnstoff, 1 mM DTT, 5 % Glycerin und 2 % Digitonin enthält.
2. Zugabe von 2 % Ampholyten (pH 3,0 bis 10,0 und pH 4,0 bis 6,0 im Verhältnis 1:4)
3. Fraktionieren Sie die löslichen Proteine mit einem flüssigen IEF-System, das bei 4 °C gehalten wird, mit einem Kühlwasserbad.
4. Führen Sie die IEF-Trennung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und wenden Sie eine konstante Leistung von 12 W an, bis sich die Spannung stabilisiert hat (zwischen 1300 V und 1600 V).
5. Setzen Sie den IEF-Lauf nach der Spannungsstabilisierung für weitere 30 Minuten fort, mit einer Gesamtlaufzeit von ca. 5-6 h.
6. Sammeln Sie die einzelnen IEF-Fraktionen mit einer Vakuumpumpe und bestimmen Sie deren pH-Werte.
7. Die abgetrennten Fraktionen (50 μg) werden mit SDS-PAGE versehen und die Proteine mittels Coomassie Brilliant Blue (CBB) oder Silberfärbung visualisiert. Lagern Sie die getrennten IEF-Fraktionen bis zur weiteren Analyse in einem -80 °C-Gefrierschrank.

5. Präparative SDS-PAGE und Ganzgel-Elution

1. Mischen Sie die IEF-separierten Zellwand- und Zellmembranfraktionen mit 6x SDS-PAGE-Probenpuffer und erhitzen Sie sie 5 min lang bei 95 °C, bevor Sie die SDS-PAGE-Analyse durchführen.
2. Trennen Sie die Proteinfraktionen in der zweiten Dimension mit 16 cm 20 cm Polyacrylamid-Gelen, bestehend aus einem 12,5 % auflösenden Gel und einem 4 % großen Stapelgel.
3. Verwenden Sie eine einzelne 13 cm lange Probenvertiefung zum Laden der Probe.
4. Führen Sie die Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 50 mA/Gel durch, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
5. Das Gel wird nach dem Elektrophoreselauf 10 Minuten lang in Elutionspuffer (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure [CAPS]) äquilibriert.
6. Übertragen Sie das Gel auf ein ganzes Gel-Elutergerät, wie vom Gerätehersteller beschrieben.
7. Eluieren Sie die Proteine aus dem Gel, indem Sie den Eluter 1 h lang mit einem konstanten Strom von 250 mA laufen lassen.
8. Sammeln Sie mit einer Vakuumpumpe etwa 30 Proteinfraktionen mit einem Volumen von jeweils 3 ml aus jedem Gel.
9. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration in den eluierten Fraktionen mit dem BCA-Protein-Assay.
10. 10 μg der eluierten Fraktionen einer SDS-PAGE-Analyse unterziehen und durch Coomassie Brilliant Blue (CBB) Färbung sichtbar machen.
    HINWEIS: Abgetrennte ganze geleluierte Fraktionen wurden bis zur weiteren Analyse im -80 °C-Gefrierschrank gelagert.

Ergebnisse

Isolierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen durch Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation
Zellwand- und Membranproteine wurden aus Ganzzelllysaten mittels Ultrazentrifugation isoliert, wie im Protokoll beschrieben. Die SDS-PAGE-Analyse der abgetrennten subzellulären Fraktionen Zellwand, Zellmembran und Zytosolproteinprofile von M. tuberculosis ist in Abbildung 1 dargestellt.

Trennung von Zellwandproteinen durch präparati...

Diskussion

Die hydrophobe Natur von Zellwand- und Membranproteinen stellt erhebliche experimentelle Herausforderungen bei ihrer Solubilisierung und Trennung dar. In dem oben genannten Protokoll haben wir eine neuartige zweidimensionale Elektrophorese-basierte Trennmethode beschrieben, um diese hydrophoben Proteine effektiv zu isolieren. In diesem Protokoll trennten wir zunächst die Membran- und Zellwandproteine anhand ihrer isoelektrischen Punkte mit dem flüssigen IEF-System. Um das Solubilisierung...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
7H9 Brühe	Himedia	M198
40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	BIO-RAD	1631113
BCA-Protein-Assay	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 Ampholyte	BIO-RAD	1631152
Zentrifugalkonzentratoren 3 kDa	MERCK	Z629456
Digitonin.	MERCK	Nr. D141
Dnase	MERCK	11284932001
DVB-T	MERCK	Nr. D9779
EDTA	MERCK	Nr. E9884
EGTA (EGTA)	MERCK	Nr. E3889
Glycerin	MERCK	Nr. G5516
Leupeptin	MERCK	E18
Pepstatin A	MERCK	Nr. P5318
PMSF (Englisch)	MERCK	78830
Rnase	MERCK	10109134001
Rotofor	BIO-RAD	170-2986	isoelektrische Fokussierung (IEF)
Ultraschallgerät	Vibra-Zelle, Sonics	VC 750
TLCK	MERCK	Nr. T7254
TPCK	MERCK	4376
Harnstoff	MERCK	Nr. U5378
Ganzes Gel Eluter Gerät	BIO-RAD	1651250