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Methodenartikel

Innervation menschlicher Darmorganoide

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DOI:

10.3791/67702

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17. Januar 2025

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1Program in Children's Regenerative Medicine, Department of Pediatric Surgery, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Menschliche Darmorganoide müssen innerviert werden, um die Struktur und Funktion des nativen menschlichen Darms besser rekapitulieren zu können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein enterisches Nervensystem in diese Konstrukte einzubauen.

Zusammenfassung

Die Komplexität der intestinalen Zytoarchitektur und -funktion stellt erhebliche Herausforderungen für die Schaffung des biotechnologisch hergestellten Dünndarms dar. Techniken zur Erzeugung menschlicher Darmorganoide (HIOs), die dem menschlichen Dünndarm ähneln, wurden bereits berichtet. HIOs enthalten Epithel und Mesenchym, aber es fehlen andere wichtige Bestandteile des funktionellen Darms wie das enterische Nervensystem (ENS), Immunzellen, das Gefäßsystem und das Mikrobiom. Zwei unabhängige Forschungsgruppen haben unterschiedliche Methoden veröffentlicht, um HIOs mit einem ENS zu innervieren. Hier diskutieren wir eine einzigartige Methode zum Einbau des ENS in einen HIO-abgeleiteten biotechnologisch hergestellten Dünndarm, die Komponenten dieser früheren Berichte verwendet, um die Identität der Vorläuferzellen sowie den Entwicklungszeitpunkt zu optimieren.

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) werden differenziert, um unabhängig voneinander HIOs und enterische Neuralleistenzellen (ENCCs) zu erzeugen, indem Differenzierungsmarker über einen Zeitraum von mehreren Tagen gemäß veröffentlichten Protokollen zeitlich reguliert werden. Sobald die HIOs das Sphäroidstadium im mittleren Hinterdarm erreichen (etwa Tag 8), werden die ENCC-Sphäroide der Tage 15-21 dissoziiert, mit HIOs co-kultiviert und in klaren dreidimensionalen (3D) Basalmembran-Matrix-Tröpfchen suspendiert. HIO + ENCC-Co-Kulturen werden in vitro 28-40 Tage lang aufbewahrt, bevor sie in >9 Wochen alte immundefiziente Mäuse zur weiteren Entwicklung und Reifung transplantiert werden. Transplantierte HIOs (tHIOs) mit ENS können 4-20 Wochen später geerntet werden. Diese Methode integriert Elemente aus zwei zuvor veröffentlichten Techniken, indem sie ENCCs verwendet, die aus hPSCs generiert wurden, und sie in einem frühen Entwicklungsstadium mit HIOs co-kultiviert, um die Exposition gegenüber frühen Entwicklungshinweisen zu maximieren, die wahrscheinlich zur Bildung einer reiferen Darmmorphologie beitragen.

Einleitung

Der menschliche Dünndarm ist ein komplexes, vielschichtiges Organ, das zahlreiche essentielle Funktionen wie Verdauung, Nährstoffaufnahme, Flüssigkeitsregulation, Immunbarrierefunktion und Beweglichkeit ausführt. Zahlreiche klinische Erkrankungen, wie z.B. das Kurzdarmsyndrom, Enteropathien oder Motilitätsstörungen, sind gekennzeichnet durch eine kritische Verringerung der Darmmasse oder Störungen der normalen Physiologie, die zu einer signifikanten Morbidität und Mortalität führen 1,2,3,4. Zu den derzeitigen Behandlungsoptionen gehört häufig eine Operation zur Entfernung des dysfunktionalen Darms auf Kosten einer verringerten Darmlänge und damit der Funktionsfähigkeit des verbleibenden Darms5. Es besteht ein Bedarf an regenerativen Therapien, die additiver Natur sind, die funktionelle Darmkapazität erhöhen und die Darmfunktion auf eine Weise wiederherstellen, die mit den derzeitigen therapeutischen Paradigmen nicht erreicht werden kann.

Der biotechnologisch hergestellte Dünndarm ist eine vielversprechende Lösung für diese Herausforderungen. Humane Darmorganoide (HIOs), die aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) gewonnen werden, sind ein Ausgangsmaterial für den biotechnologisch hergestellten Dünndarm. Im Jahr 2011 berichteten Spence et al. erstmals über die erfolgreiche Herstellung moderner HIOs aus hPS-Linien, einschließlich H1- und H9-Linien aus humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und mehreren humanen induzierten pluripotenten Stammzelllinien (hiPSC) 6,7. Ihr Protokoll umfasste eine sorgfältig abgestimmte Reihe von Inkubationen mit spezifischen Wachstumsfaktoren, um die Darmentwicklung des menschlichen Fötus nachzuahmen. Activin A, ein TGFβ-Signalmolekül, treibt die hPSC-Differenzierung in Richtung endodermales Schicksal, gefolgt von einer gerichteten posterioren Musterbildung mit Wnt/FGF. Unter diesen Bedingungen organisieren sich hPSCs selbst, um Darmsphäroide zu bilden, die polarisiertes Epithel und Mesenchym enthalten. Die 3D-Kultur innerhalb einer Basalmembranmatrix ermöglicht eine zusätzliche Entwicklung, die zu Organoiden mit einem inneren Lumen, zottenartigen Involutionen des Epithels und selbstregenerierenden Vorläuferzellnischen in kryptenartigen Strukturen führt.

Während HIOs, die mit diesem ursprünglichen Protokoll von 2011 erzeugt wurden, strukturell dem nativen Darm ähneln, fehlt ihnen die Fähigkeit, die Neuronen oder Gliazellen des enterischen Nervensystems (ENS) zu erzeugen. Im Jahr 2017 wurden in zwei großen Arbeiten ähnliche, aber unterschiedliche Methoden zur Innervation von HIOs beschrieben. ENS-Vorläuferzellen (enterische Neuralleistenzellen, ENCCs) können aus hPSCs abgeleitet werden. In Kultur bilden ENCCs 3D-Neurosphären, die sich unter geeigneten Bedingungen in enterische Neuronen und Gliazellen differenzieren können. Workman und Mahe et al. modifizierten ein bestehendes Protokoll, um ENCCs aus hPSCs abzuleiten und behandelten sie mit FGF-angereicherten Medien, gefolgt von Retinsäure für 2 Tage zur Posteriorisierung und Förderung des vagalen Schicksals 8,9. Neurosphären am Tag 6 wurden weitere 4 Tage ohne RA inkubiert, und dann wurden migrierte Zellen nach enzymatischer Ablösung gesammelt. Ungefähr 20.000-50.000 ENCCs wurden mit frühen Sphäroiden des mittleren Hinterdarms aggregiert und diese ENCC-gesäten Darmsphäroide wurden in vitro in einer klaren 3D-Basalmembranmatrix für 28 Tage gezüchtet, bis sie in vivo für 6-10 Wochen in die Nierenkapsel von immundefizienten Mäusen transplantiert wurden. Das resultierende HIO + ENS zeigte eine signifikante Reifung der epithelialen und mesenchymalen Komponenten sowie der neuroglialen Strukturen, die den Ganglien ähneln, wenn auch mit geringerer Zellkörperdichte als der native Darm, das Fehlen bestimmter klinisch relevanter neuronaler Subtypen (d.h. CHAT-positive Neuronen in HIO + ENS nach der Transplantation) und insgesamt fetale Merkmale.

Im selben Jahr veröffentlichten Schlieve et al. eine alternative Methode, bei der eine Mischung aus 40-60 intakten ENCC-Neurosphären am Tag 15 mit reiferen HIOs zum Zeitpunkt der In-vivo-Transplantation in das Omentum von immundefizienten Mäusen für 3 Monate ohne vorherige In-vitro-Co-Kultur verwendetwurde 10. Ihre Konstrukte, genannt ENCC-HIO-TESI (Tissue-Engineering Small Intestinal ), schienen einen reiferen ENS-Phänotyp zu enthalten als der von Workman und Mahes HIO + ENS mit einer größeren Diversität der neuronalen Subtypen und neuroepithelialen synaptischen Verbindungen, die bei HIO + ENS nicht zu finden sind. Wichtig ist, dass die in Schlieves Experimenten verwendeten ENCCs mit einer anderen Methode abgeleitet wurden, wie zuvor von Fattahi et al.11 beschrieben. Kurz gesagt, hPSCs (sowohl hESCs als auch hiPSCs) wurden in FGF2-angereicherten Medien einer Neuralleisteninduktion unterzogen. Diese Zellen wurden ebenfalls mit RA behandelt, um ein enterisches Vagusschicksal festzustellen, jedoch für 5 Tage (Tage 6-11), eine Zunahme gegenüber den 2 Tagen von Workman und Mahe (Tag 4-5). Im Jahr 2019 veröffentlichten Barber et al. eine überarbeitete Version des Fattahi-Protokolls, die eine gründlichere Beschreibung der Kulturbedingungen und einen Übergang zu definierten Basalmedien enthielt, um Inkonsistenzen zu reduzieren und die sich ändernden Zellkulturpräferenzen zu diesem Zeitpunkt widerzuspiegeln12.

Unsere Methode zur Innervation von HIOs, die im Folgenden ausführlich beschrieben wird, enthält Elemente sowohl des Workman/Mahe- als auch des Schlieve-Protokolls. Während das ENS in Schlieves ENCC-HIO-TESI mit größerer neuronaler Diversität und neuroglialer Integration reifer erschien, integrierten beide Methoden erfolgreich ein funktionelles ENS in die HIOs, wobei Veränderungen in der gastrointestinalen transkriptionellen Expression nachgewiesen wurden. HIO + ENS von Workman und Mahe induzierte eine erhöhte Expression mehrerer Gene, die mit intestinalen Stammzellen und der Entwicklung von Epithelzellen in Verbindung stehen, die in ENCC-HIO-TESI nicht verändert waren. Eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede sind die unterschiedlichen Zeitpunkte, zu denen ENCCs und HIOs zwischen den Protokollen kombiniert wurden. Unser Labor hat beobachtet, dass eine frühe Kokultur zu einer erhöhten Expression mehrerer Gene führt, die an der epithelialen und mesenchymalen Differenzierung beteiligt sind, und dass der Zeitpunkt der Kokultur die Diversität der Epithelzellen beeinflusst (unveröffentlichte Daten). Es ist möglich, dass eine frühere Exposition von ENS-Vorläufern gegenüber sich entwickelnden HIOs und umgekehrt Zeit für noch undefinierte Signalübertragungen bietet, die die epitheliale Diversität und andere frühe Entwicklungsprozesse fördern.

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Protokoll

Die humane embryonale Stammzelllinie (hESC) H9 wurde von WiCell (Madison, WI) bezogen und alle Experimente mit hES-Zellen wurden vom UTHealth Houston Stem Cell Research Oversight (SCRO) Committee genehmigt (Protokoll #SCRO-23-01). Für dieses Protokoll beziehen sich alle Verweise auf beschichtete Platten oder Vertiefungen auf solche, die mit hESC-qualifizierter 3D-Basalmembranmatrix hergestellt wurden.

1. Vorbereitung der Zellkultur

HINWEIS: Unser Labor verwendet H9 hESCs, aber mehrere hPSC-Linien wurden von anderen Laboren erfolgreich zur Erzeugung von HIOs und ENCCs verwendet, darunter H9 hESCs 9,10,12, H1 hESCs9, hESC-Leitung UCSF412 und mehrere hiPSC-Linien wie WTC1112, WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9, WTC10 9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9 und WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)9.

  1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie jede gewünschte Vertiefung mit einer 3D-Basalmembranmatrix beschichten, die in einem geeigneten Zellkulturmedium verdünnt ist (Verdünnungsfaktor und Anweisungen zur Vorbereitung finden Sie im Materialdatenblatt). Beschichten Sie jede gewünschte Vertiefung mit 1 mL pro Vertiefung und inkubieren Sie sie mindestens 1 Stunde lang oder über Nacht, um vor dem Plattieren der Zellen fest zu werden.
    HINWEIS: Dieses Protokoll kann mit Zellen aus nur einer Vertiefung vervollständigt oder bei Bedarf hochskaliert werden. Wir empfehlen, mindestens drei Vertiefungen zu beschichten, um die zusätzliche Passage und Wartung von undifferenzierten hPSCs zu erleichtern.
    Es ist wichtig, die Basalmembranmatrix während der Arbeit kalt zu halten, da die meisten Matrices bei Raumtemperatur zu polymerisieren beginnen. Beschichtete Vertiefungen sind bei Lagerung bei 37 °C bis zu 2-3 Wochen haltbar. Mit einem ausreichenden Verdünnungsmittel aufbewahren, um die gesamte Vertiefung abzudecken, damit die Beschichtung nicht austrocknet.
  2. Tauen Sie hPSCs (idealerweise eine niedrige Durchgangszahl) auf, indem Sie sie kurz in einem warmen Wasserbad schwenken. Unter einer Laminar-Flow-Haube wird ein Fläschchen mit Zellen in 2 ml Stammzellmedium resuspendiert (Tabelle 1). Aspirieren Sie das Verdünnungsmittel aus einer zuvor beschichteten Vertiefung in einer 6-Well-Schale unmittelbar vor dem Plattieren der Zellen und übertragen Sie dann die gesamten 2 ml der resuspendierten Zellen in die beschichtete Vertiefung. Zur Erhaltung von undifferenzierten hPS-Zellen (als Erhaltungsplatten bezeichnet) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren und das Medium jeden zweiten Tag mit 2 ml Stammzellmedium pro Vertiefung wechseln.
  3. Durchgang der Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 70-80 % erreichen. Saugen Sie das Medium von der Seite der Vertiefung an, ohne die Zellen zu stören. Geben Sie 1 ml Dissoziationsreagenz für Stammzellen bei Raumtemperatur in die Vertiefung und aspirieren Sie es innerhalb von 1 min, wobei Sie einen dünnen Flüssigkeitsfilm über den Zellen hinterlassen. Inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C.
    HINWEIS: Wenn Sie warten, bis die Zellen mehr als 80 % Konfluenz zur Passage erreicht haben, kann dies zu Problemen mit vorzeitiger Differenzierung führen, was die Ausbeute bei nachfolgenden Schritten verringert.
  4. Fügen Sie 1 ml warmes Stammzellmedium pro Vertiefung hinzu und klopfen Sie auf die Seite der Platte, um die Kolonien zu entfernen. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig mit einer P1000-Mikropipette mit einer Weithalspipettenspitze (siehe Materialtabelle), um die Kolonien aufzubrechen und gleichzeitig die Zellschäden zu minimieren.
    HINWEIS: Beim Verreiben der Zellsuspension wird empfohlen, große Zellklumpen aufzubrechen, kleinere Cluster jedoch intakt zu lassen. Es wird nicht empfohlen, eine einzellige Suspension zu erreichen, sondern weniger, kleinere Kolonien anzustreben, die gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind.
  5. Aspirieren Sie das Verdünnungsmittel aus einer zuvor beschichteten Vertiefung in einer 6-Well-Schale und fügen Sie 2 ml warmes Stammzellmedium hinzu. Übertragen Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension in diese Vertiefung, um die hPSC-Kolonien zu erhalten, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag mit 2 ml Stammzellmedium pro Vertiefung.
    HINWEIS: Unser Labor überträgt in der Regel Volumina zwischen 50 und 150 μl, um die Passage von hPSC-Erhaltungsplatten einmal pro Woche zu ermöglichen. Dieses Volumen kann je nach hPSC-Leitung und Durchgangsnummer variieren und muss daher möglicherweise angepasst werden. Verwenden Sie die verbleibenden Zellen, um die ENCC-Generierung (Abschnitt 2) oder die HIO-Generierung (Abschnitt 3) zu starten. Neu aufgetaute hPSCs sollten mindestens zweimal durchgelassen werden, bevor sie entweder zur ENCC-Erzeugung oder zur HIO-Erzeugung übergehen.

2. ENCC-Generierung

HINWEIS: Unsere Methode zur ENCC-Generierung lehnt sich eng an die vom Fattahi-Labor beschriebene und von Schlieve et al.10 verwendete Methode an. Wir verwenden eine leicht modifizierte Version der Protokolloption B durch die Abschnitte "Enteric Neural Crest (ENC) Induction (Days 0-12)" und "ENCC Spheroid Formation (Day 12-15)" in Barber et al.10,12.

  1. Aspirieren Sie das Verdünnungsmittel aus einer zuvor beschichteten Vertiefung in einer neuen 6-Well-Schale und fügen Sie 2 ml warmes Stammzellmedium hinzu. Übertragen Sie 850 μl hPSC-Zellsuspension aus Schritt 1,5 in dieselbe Vertiefung (typischerweise ein Übergabeverhältnis von 5:6).
  2. Halten Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag mit 2 ml Stammzellmedium pro Vertiefung, bis die Konfluenz 60-80 % erreicht. Dann ist die Platte bereit, mit der ENC-Induktion zu beginnen.
  3. ENC-Induktion
    1. Tag 0. Aspirieren Sie das Medium von der Seite der Vertiefung und fügen Sie 2 ml warmes Cocktail A-Medium hinzu (Tabelle 1). Rückkehr in den Inkubator für 48 Stunden.
    2. Tag 2. Aspirieren Sie das Medium Cocktail A an der Seite der Vertiefung und ersetzen Sie es durch 2 mL warmes Medium Cocktail B (Tabelle 1). Rückkehr in den Inkubator für 48 Stunden.
    3. Tag 4. Aspirieren Sie das Cocktail-B-Medium an der Seite der Vertiefung und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches, warmes Cocktail-B-Medium. Rückkehr in den Inkubator für 48 Stunden.
    4. Tage 6-12. Aspirieren Sie das Cocktail-B-Medium von der Seite der Vertiefung und ersetzen Sie es durch 2 mL warmes Cocktail-C-Medium (Tabelle 1). Kehren Sie in den Inkubator zurück und ersetzen Sie das Medium alle 48 Stunden durch 2 ml frischen, warmen Cocktail C, bis die ENC-Induktion an Tag 12 abgeschlossen ist.
      HINWEIS: In diesem Stadium können ENC-Linien durch Genexpressionsanalyse bestätigt werden, wie von Barber et al.12 beschrieben.
  4. ENCC-Sphäroidbildung
    1. Tag 13. Aspirieren Sie das Medium Cocktail C von der Seite des Bohrlochs. 1 ml eines warmen Reagenzes zur enzymatischen Zellablösung zugeben und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Klopfen Sie auf die Seite der Platte, um Zellen zu entfernen, und übertragen Sie die Zellsuspension mit einer Weithalspipettenspitze in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefung mit 1 ml Neuralleistenzell-Medium (NCC) (Tabelle 1) und geben Sie die Spülungen in das konische 15-ml-Röhrchen.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension im konischen 15-ml-Röhrchen bei 300 × g für 1 min. Aspirieren Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 mL warmem NCC-Medium.
    3. Die resuspendierten Zellen werden in eine neue, unbeschichtete Vertiefung einer Platte mit extrem niedriger Bindung gegeben und 48 h lang bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert.
    4. Tag 15-21. Überwachen Sie das Wachstum der ENCC-Sphäroide und ersetzen Sie das Medium alle 48 Stunden durch 2 ml frisches, warmes NCC-Medium.
      HINWEIS: Medienwechsel sollten mit Vorsicht durchgeführt werden, um eine Beschädigung oder Aspiration der ENCC-Sphäroide zu vermeiden. Dies wird am besten erreicht, indem die Platte in einer kreisförmigen Bewegung geschwenkt wird, um die Sphäroide in der Mitte der Vertiefung zu fokussieren, und dann das Medium vom Rand der Vertiefung abgesaugt wird.
      Die ENCC-Sphäroidbildung ist in der Regel am 15. Tag abgeschlossen, obwohl es akzeptabel ist, sie bis zum 21. Tag zu kultivieren, um den idealen Zeitpunkt der Kokultur mit Sphäroiden im mittleren Hinterdarm zu ermöglichen.

3. HIO-Erzeugung (Sphäroidphase im mittleren Hinterdarm)

HINWEIS: Unsere Methode zur HIO-Erzeugung ist im Grunde die gleiche wie das ursprüngliche Protokoll, das von McCracken et al. und anderen aus den Labors Spence und Wells ausführlich beschriebenwurde 6,7. Der Prozess erfolgt in zwei Phasen: Die definitive Induktion des Endoderms (DE) und die Bildung von Sphäroiden im mittleren Hinterdarm.

  1. Vorbereitung für die HIO-Generierung
    1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie jede gewünschte Vertiefung mit einer 3D-Basalmembranmatrix beschichten, die in einem geeigneten Zellkulturmedium verdünnt ist (Verdünnungsfaktor und Hinweise zur Vorbereitung finden Sie im Materialdatenblatt). Jede gewünschte Vertiefung mit 500 μl pro Vertiefung beschichten und mindestens 1 h oder über Nacht bei 37 °C inkubieren, um vor dem Plattieren der Zellen auszuhärten.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Basalmembranmatrix während der Arbeit kalt zu halten, da die meisten Matrices bei Raumtemperatur zu polymerisieren beginnen. Beschichtete Vertiefungen sind bei Lagerung bei 37 °C bis zu 2-3 Wochen haltbar. Mit genügend Verdünnungsmittel aufbewahren, um die gesamte Vertiefung abzudecken, damit die Beschichtung nicht austrocknet.
      Planen Sie, 6 Vertiefungen einer 24-Well-Platte für jeweils 1 Vertiefung mit den oben beschriebenen 6-Well-hPSC-Wartungsplatten zu beschichten. Dieses Verhältnis kann beliebig skaliert werden.
    2. Aspirieren Sie das Verdünnungsmittel aus allen zuvor beschichteten Vertiefungen in einer 24-Well-Schale. Geben Sie ausreichend warmes Stammzellmedium in die hPSC-Zellsuspension aus Schritt 1.5 und verteilen Sie 500 μl in jede Vertiefung (z. B. wenn nach dem Passieren der hPSC-Erhaltungsplatte 850 μl hPSC-Zellsuspension übrig bleiben, mischen Sie für 6 Vertiefungen einer 24-Well-Platte 2.150 μl warmes Stammzellmedium mit 850 μl der hPSC-Zellsuspension aus Schritt 1.5, und 500 μl verteilt in jeder der 6 Vertiefungen).
      HINWEIS: Da wir in der Regel hPSC-Erhaltungsplatten mit einem Volumen von 50-150 μl durchlaufen, stehen uns für diesen Schritt in der Regel Volumina von 850-950 μl zur Verfügung. Somit beträgt das Volumen der hPS-Zellen pro Vertiefung in der 24-Well-Platte etwa 150 μl/Vertiefung.
      Nachdem die neu vorbereitete 24-Well-Platte in den Inkubator gelegt wurde, bewegen Sie die Platte vorsichtig hin und her (von Norden nach Süden und von Osten nach Westen), um die Zellen so gleichmäßig wie möglich über den Boden der Vertiefung zu verteilen.
    3. Halten Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag mit 500 μl Stammzellmedium pro Well, bis die Konfluenz 50-70 % erreicht. Dann ist die Platte bereit, mit der DE-Induktion zu beginnen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Zellen vor der DE-Induktion keine Konfluenz von >70 % erreichen, da eine höhere Konfluenz die Endodermdichte und die Morphogenese des Hinterdarms in den nachfolgenden Stadien negativ beeinflusst. Im Idealfall erreichen die Zellen nach 24-48 h bei den angegebenen Passageverhältnissen eine Konfluenz von etwa 50-70%.
  2. DE Induktion
    1. Tag 1. Sobald die hPS-Zellen eine Konfluenz von 50-70 % erreicht haben, aspirieren Sie die Stammzellmedien vollständig aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch 500 μl warmes Tag-1-DE-Medium (Tabelle 1) pro Vertiefung. Bei 37 °C, 5 % CO2 24 h inkubieren.
    2. Tag 2. Aspirieren Sie das Tag 1 DE und ersetzen Sie es durch 500 μl warmes Tag 2 DE (Tabelle 1) Medium pro Vertiefung. Bei 37 °C, 5 % CO2 24 h inkubieren.
    3. Tag 3. Aspirieren Sie das Tag 2 DE und ersetzen Sie es durch 500 μl warmes Tag 3 DE (Tabelle 1) Medium pro Vertiefung. Bei 37 °C, 5 % CO2 24 h inkubieren.
  3. Sphäroidbildung im mittleren Hinterdarm
    1. Tage 4-8. Saugen Sie das Medium vollständig aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie es durch 500 μl warmes Medium aus dem mittleren Hinterdarm (MHGM, Tabelle 1) pro Vertiefung. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2. Wiederholen Sie diesen Schritt täglich bis zum 8. Tag, an dem die Sphäroide im mittleren Hinterdarm für die Entnahme und Kokultur bereit sind (Abschnitt 4).

4. Co-Kultur von Sphäroiden im mittleren Hinterdarm mit ENCCs

HINWEIS: Eine grafische Zusammenfassung dieses Abschnitts finden Sie in Abbildung 1.

  1. Vorbereitung der ENCC-Aussetzung
    1. Sammeln Sie ENCC-Sphäroide für Tag 15-21 aus Schritt 2.4.4. Durch vorsichtiges Entfernen des Mediums aus der Vertiefung und Vermeiden Sie das Ansaugen der Sphäroide unter Verwendung der Drallmethode, die in der Anmerkung für diesen Schritt beschrieben ist.
    2. Geben Sie 1 ml eines warmen enzymatischen Zellablösungsreagenzes in die Vertiefung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C.
    3. Klopfen Sie auf die Seite der Platte, um die Dissoziation der Sphäroide fortzusetzen, und zerreiben Sie mit einer P1000-Mikropipette mit Weithalsspitze, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um Zellklumpen aufzubrechen, bis die Mischung homogen ist.
    4. Übertragen Sie die ENCC-Suspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefung mit 1 mL warmem NCC-Medium (siehe Tabelle 1), um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und geben Sie diese in das konische 15-ml-Röhrchen.
    5. Die Zellsuspension bei 300 × g 1 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand mit einer sterilen Pipettenspitze.
    6. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Weithalspipettenspitze in 1 ml warmem NCC-Medium. Berechnen Sie die Konzentration der ENCC-Suspension mit einem Hämazytometer oder Zellzähler.
  2. Kombination der ENCC-Federung mit Sphäroiden im mittleren Hinterdarm
    1. Entnehmen Sie die Sphäroide des mittleren Hinterdarms aus allen Vertiefungen einer HIO-Platte mit einer Weithalspipettenspitze und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der Co-Culture-Wells, die in einer 24-Well-Platte verwendet werden. Ziel ist es, 10-30 Sphäroide aus dem mittleren Hinterdarm und 50.000-100.000 ENCCs pro Vertiefung für die Kokultur zu plattieren.
      HINWEIS: In der Praxis besteht oft eine Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen der Anzahl der Vertiefungen mit gesunden Sphäroiden und der endgültigen Anzahl der Vertiefungen, die für die Kokultur benötigt werden. Ein Hämozytometer kann auch verwendet werden, um die Konzentration der gesammelten Sphäroide im mittleren Hinterdarm zu berechnen.
    3. Addieren Sie das berechnete Volumen der ENCC-Suspension, um 50.000-100.000 ENCCs pro geplanter Kokulturvertiefung in das konische Röhrchen mit den Sphäroiden im mittleren Hinterdarm zu geben. Mit einer Weithalspipettenspitze vorsichtig zerreiben, um die Sphäroide und ENCCs im mittleren Hinterdarm gleichmäßig zu mischen.
    4. Bei 300 × g 1 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze absaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Weithalspipettenspitze in einem Volumen kalter, phenolfreier (klarer), Wachstumsfaktor-reduzierter Basalmembranmatrix, das 30 μl pro abschließender Kokulturvertiefung entspricht.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in der durchsichtigen Basalmembranmatrix während der Resuspension, da diese schwer zu entfernen sind, die ordnungsgemäße Aufnahme des Mediums durch die HIO+ENCC-Kokulturen behindern und die Visualisierung der HIO+ENCC-Kokulturen während des Wachstums verringern.
    5. Pipettieren Sie in die Mitte jeder Dry-Well einen 30-μl-Tropfen resuspendierter Sphäroide + ENCCs im mittleren Hinterdarm in einer klaren Basalmembranmatrix ohne umgebendes Medium. Sobald alle Tröpfchen in den Vertiefungen plattiert sind, decken Sie die Platte ab und drehen Sie sie um. Invertiert bei 37 °C, 5 % CO2 30 min inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt gibt den Sphäroiden und ENCCs im mittleren Hinterdarm Zeit, während der Polymerisation der klaren 3D-Basalmembranmatrix vom Boden der Platte abzufallen und zu suspendieren.
  3. In vitro HIO+ENS-Kokultur
    1. Tag 0: Sobald die klare Basalmembranmatrix polymerisiert ist, bedecken Sie jedes Tröpfchen mit 500 μl warmem Tag 0-3 HIO-Medium (siehe Tabelle 1).
    2. Tag 3: Saugen Sie das HIO-Medium Tag 0-3 vorsichtig von der Seite der Vertiefung an, ohne das klare Tröpfchen der Basalmembranmatrix zu stören. Ersetzen Sie das Medium durch 500 μl warmes HIO-Medium für Tag 3-14 (siehe Tabelle 1). Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Wechseln Sie zu diesem Zeitpunkt das Medium alle 3-4 Tage.
    3. Tage 7-14: Tauschen Sie die HIO-Medien an Tag 3-14 nach Bedarf alle 3-4 Tage aus und überwachen Sie das Wachstum.
  4. HIOs aufteilen
    1. Tag 14: Untersuchen Sie jede Vertiefung sorgfältig unter einem Mikroskop und beurteilen Sie, wie viele sich entwickelnde HIO + ENS in jedem klaren 3D-Basalmembran-Matrix-Tröpfchen enthalten sind.
    2. Bereiten Sie 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 μl klarer Basalmembranmatrix vor und bewahren Sie diese auf Eis auf.
    3. Entfernen Sie unter einer Laminar-Flow-Haube mit einer feinen Pinzette vorsichtig das klare Tröpfchen der 3D-Basalmembranmatrix mit dem suspendierten HIO+ENS. Ziehen Sie einzelne HIO+ENS sanft auseinander.
      HINWEIS: Chirurgische Lupen oder ein Präpariermikroskop können in diesem Stadium sehr hilfreich sein, sind aber nicht unbedingt erforderlich, da HIOs oft mit bloßem Auge sichtbar sind.
    4. Jedes isolierte HIO + ENS wird entweder mit einer Pinzette oder einer Weithalspipettenspitze in eines der vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 μl klarer Basalmembranmatrix gegeben.
      HINWEIS: Die alte klare 3D-Basalmembranmatrix muss zu diesem Zeitpunkt nicht verflüssigt oder aufgelöst werden. Vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Störung der HIOs, obwohl sie in diesem Fall in späteren Stadien noch wachsen können.
    5. Wiederholen Sie Schritt 4.2.5 für das geteilte und neu beschichtete HIO+ENS. Sobald die klaren Tröpfchen der 3D-Basalmembran polymerisiert sind, geben Sie 500 μl warmes, frisches HIO-Medium für die Tage 3-14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie über Nacht.
  5. HIO+ENS-Kokultur wird fortgesetzt
    1. Tag 15: Saugen Sie das HIO-Medium für Tag 3-14 vorsichtig von der Seite des Bohrlochs an. Ersetzen Sie das Medium durch 500 μl warmes HIO-Medium für Tag 15-28 (siehe Tabelle 1).
    2. Tag 15-40: Tauschen Sie die HIO-Medien an Tag 15-28 nach Bedarf alle 3-4 Tage aus und überwachen Sie das HIO + ENCC-Wachstum.

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Ergebnisse

Das ENS reguliert die wesentlichen Funktionen des reifen Dünndarms, einschließlich der Peristaltik, der Nährstoffaufnahme, des Flüssigkeitstransports und der Aufrechterhaltung der Epithelbarriere. Das Ziel der Innervation von HIOs besteht also darin, diese Konstrukte mit den Elementen zu versorgen, die sie benötigen, um ausgereiftere, übergeordnete Funktionen zu entwickeln. Zu diesem Zweck untersucht unser Labor speziell die Entwicklung des ENS innerhalb von HIOs sowie die funktionellen Ergebnisse in verschiedenen Phasen...

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Diskussion

HIOs werden seit Anfang der 2010er Jahre als Modellsystem für die Entwicklung des menschlichen Darms verwendet und sind seitdem immer komplexer geworden. Es ist nun möglich, diese Konstrukte mit einem ENS auszustatten, was neue Möglichkeiten bei der Erforschung der normalen Entwicklung eröffnet, die zum Verständnis und zur besseren Behandlung einer Reihe von klinischen gastrointestinalen Entitäten angewendet werden können.

In-vivo-Transplantation

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Vielen Dank an unsere vielen Mitarbeiter und Mentoren, darunter Noah Shroyer, Michael Helmrath, James Wells und Faranak Fattahi, die uns erlaubt haben, ihre Labore zu besuchen und uns geholfen haben, unser Protokoll im Laufe der Jahre zu verfeinern. Wir möchten uns auch bei Chris Mayhew und Amy Pitstick von der Pluripotent Stem Cell Facility und dem Center for Stem Cell & Organoid Medicine (CuSTOM) am Cincinnati Children's Hospital Medical Center für die Bereitstellung von HIO-Schulungen, Anleitungen und Ratschlägen für unser Labor bedanken. Diese Forschung wurde durch den Texas Medical Center Digestive Diseases Center Pilot/Feasibility Grant Award (teilweise finanziert von NIH/NIDDK P30DK056338) (Speer), den NIDDK (NIH 1K08DK131326-01A1) (Speer), den Men of Distinction Award (Speer) und den American Neurogastroenterology and Motility Society (ANMS) Transition Award (Speer) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)ThermoFischer Scientific11140050
15 mL konische RöhrchenThermo Scientific12565269
AccutaseSTEMCELL Technologies07920"Reagenz zur enzymatischen Zellablösung"
B-27 Supplement (50x), minus Vitamin AThermoFischer Scientific12587010für ENCC
B-27 Supplement (50x), serumfreiGibco17504044für HIO
Bright-Line HämazytometerHausser Scientific3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment MikrotiterplattenFisher Scientific07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-Well, TC-behandeltVWR29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 wellVWR29442-042
Essential 6 MediaThermo FischerA1516401
Essential 8 MediaThermo FischerA2858501Alternative Stammzellmedien, die für ENCC-Platten verwendet werden.
Pinzette mit feiner SpitzeDumont11223-20
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific50145522
Gibco Advanced DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010
Gibco HEPES 1 MThermoFischer Scientific15630-080
Gibco Neurobasales MediumThermoFischer Scientific21103-049
Glutagro, 200 mM, 100xCorning25-015-CI
GlutamaxThermoFischer Scientific35050061
H9 human ESCWicell International Stem Cell BankN/A
HyCloneTM FBS DefinedVWR16777-002
LabGard Biologische SicherheitswerkbankNuaireNu-430-400
Matrigel GFR Basalmembranmatrix, phenolrotfrei, LDEV-freiCorning356231"Klare 3D-Basalmembranmatrix"
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, LDEV-freiCorning354277"3D Basalmembranmatrix"
MikropipettenEppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0,5-10, 0,1-2,5 uL)2231300008
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850"Stammzellmedien"
Die Katalognummer enthält die 5x Ergänzung, die im Voraus in großen Mengen hinzugefügt werden muss. 
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048für HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)Thermo FisherA1370701für ENCC. Etwas andere Formulierung.
Nikon DS-Fi2 TS-100 MikroskopNikonTS100
Noggin-konditioniertes MediumTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)ThermoFischer Scientific15140-122
Rekombinante humane Activin AZellleitsystemeGFH6-100
Rekombinantes humanes BMP-4Fisher Scientific314BP010
rekombinantes humanes EGF-Protein, CFThermoFisher Scientific236-EG-200
rekombinantes humanes FGF basic/FGF2 (146 aa) ProteinThermoFischer Scientific233-FB-010
Rekombinantes humanes FGF-4Peprotech100-31
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872"Stammzelldissoziationsreagenz"Retinsäure
SIGMAR2625-50MG
Rnasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 2 mLThermo ScientificAM12425
RPMI 1640 MediumThermoFischer Scientific11875093
R-Spondin konditionierte MedienTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-CoreN/A
SB 431542, Tocris BioscienceFisher Scientific16-141-0
Sorvall ST 16R ZentrifugeThermo Scientific
Standard Pipettierspitzen mit breiter ÖffnungVWR89049-166
Stemolecule Chir99021 in LösungStemgent04-0004-02
Sterilfilter-PipettenspitzenVWR (1000 μl, 200 μl, 10 μl)76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XFStem Cell Technologies7180Alternative 3D-Basalmembranmatrix, verwendet für ENCC-Platten.

Referenzen

  1. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).
  2. Spencer, A. U., et al. Pediatric short bowel syndrome: redefining predictors of success. Ann Surg. 242 (3), discussion 409-412 403-409 (2005).
  3. Goulet, O., Pigneur, B., Charbit-Henrion, F. Congenital enteropathies involving defects in enterocyte structure or differentiation. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 56-57, 101784(2022).
  4. Koglmeier, J., Lindley, K. J. Congenital diarrhoeas and enteropathies. Nutrients. 16 (17), 2971(2024).
  5. Duggan, C. P., Jaksic, T. Pediatric intestinal failure. N Engl J Med. 377 (7), 666-675 (2017).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6 (12), 1920-1928 (2011).
  8. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  9. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23 (1), 49-59 (2017).
  10. Schlieve, C. R., et al. Neural crest cell implantation restores enteric nervous system function and alters the gastrointestinal transcriptome in human tissue-engineered small intestine. Stem Cell Rep. 9 (3), 883-896 (2017).
  11. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  12. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  13. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Rep. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  14. Boyle, M. A., et al. In vivo transplantation of human intestinal organoids enhances select tight junction gene expression. J Surg Res. 259, 500-508 (2021).
  15. Finkbeiner, S. R., et al. Generation of tissue-engineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids. Biol Open. 4 (11), 1462-1472 (2015).
  16. Mahe, M. M., Brown, N. E., Poling, H. M., Helmrath, M. A. In vivo model of small intestine. Methods Mol Biol. 1597, 229-245 (2017).
  17. McNeill, E. P., Gupta, V. S., Sequeira, D. J., Shroyer, N. F., Speer, A. L. Evaluation of murine host sex as a biological variable in transplanted human intestinal organoid development. Dig Dis Sci. 67 (12), 5511-5521 (2022).
  18. Singh, A., et al. Evaluation of transplantation sites for human intestinal organoids. PLoS One. 15 (8), e0237885(2020).
  19. Watson, C. L., et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat Med. 20 (11), 1310-1314 (2014).
  20. Cortez, A. R., et al. Transplantation of human intestinal organoids into the mouse mesentery: A more physiologic and anatomic engraftment site. Surgery. 164 (4), 643-650 (2018).

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