Quantifizierung des Grooming-Verhaltens von Drosophila melanogaster zur Bewertung exzessiver Grooming-Phänotypen

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Verfahren beinhaltet die manuelle Annotation von Filmmaterial, das von Drosophila melanogaster für spezifisches Pflegeverhalten aufgenommen wurde. Es ermöglicht die Quantifizierung sowohl der Anzahl der Grooming-Anfälle als auch der Gesamtzeit, die mit der Fellpflege verbracht wird, um atypische Selbstpflege-Phänotypen zu bewerten.

Zusammenfassung

Beobachtbare Veränderungen in der stereotypen Fellpflege werden translational in Modellorganismen angewendet. Diese Veränderungen sind repräsentativ für Pathologien, die ähnliche Abweichungen im menschlichen Verhalten hervorrufen; Zum Beispiel fungiert übermäßiges Grooming als Stellvertreter für obsessives und zwanghaftes Verhalten, das bei Erkrankungen wie dem Tourette-Syndrom oder der Zwangsstörung auftritt. Der vorgestellte Grooming-Assay ermöglicht die Beurteilung abnormaler Selbstpflege-Phänotypen bei Drosophila melanogaster. Fliegen werden für einen Zeitraum von 10 Minuten aufgezeichnet, und diese Aufzeichnungen werden blind beobachtet und für zuvor definierte Fellpflegeverhaltensweisen annotiert. Quantitative Messungen sowohl der Häufigkeit der Fellpflege als auch der Zeit, die mit der Selbstpflege verbracht wird, können durch manuelles Kommentieren des Filmmaterials erhalten werden. Der Assay ist relativ kostengünstig, erfordert nur wenige Materialien, die nicht bereits in Laborumgebungen verfügbar sind, und lässt sich leicht an die spezifischen Anforderungen jeder Studie anpassen, die auf die Beobachtung von Grooming abzielt. Darüber hinaus ist das Protokoll aufgrund der geringen Kenntnisse, die für die Durchführung des Assays erforderlich sind, im Vergleich zu computerwissenschaftlichen automatisierten Methoden gut für kleine Labore und Studenten geeignet. Wir besprechen im Detail die Schritte, die zur Durchführung dieses Assays erforderlich sind, und seine derzeitigen Einschränkungen.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist ein gut etablierter Modellorganismus in verhaltenswissenschaftlichen und neurobiologischen Studien, der Einblicke in die Mechanismen gibt, die analoge menschliche Verhaltensweisen antreiben. Selbstpflege ist in diesem Organismus ein stark reguliertes und klar definiertes Verhalten, das stereotypen Mustern folgt, die leicht voneinander zu unterscheiden^{sind 1}. Das separate Fellpflegeverhalten der Fliege kann im Allgemeinen nach anatomischer Region² klassifiziert werden, die am einfachsten als posterior oder anterior definiert werden kann. Die Fellpflege von Drosophila konzentriert sich zunächst auf den Frontzahnbereich und geht anschließend in den hinteren Bereich über³. Unter typischen Bedingungen zeigen Fliegen ein Pflegeverhalten, um die Sauberkeit zu wahren (z. B. durch Entfernen von Staub) und treten als Reaktion auf die Exposition gegenüber potenziell schädlichen äußeren Reizen wie pathogenen Mikroben^{auf 4}.

Anomalien im Grooming-Verhalten, insbesondere im spontanen Obsessive Grooming, wurden in verschiedenen Modellsystemen als Indikator für obsessives und/oder zwanghaftes Verhalten verwendet. Translationale Befunde zur Beobachtung von obsessivem Pflegeverhalten bei Organismen wie Nagetieren, Vögeln und Hunden haben Einblicke in Bedingungen gegeben, die beim Menschen ähnliches zwanghaftes Verhalten hervorrufen⁵. Dazu gehören Erkrankungen wie Trichotillomanie, Zwangsstörung und Tourette-Syndrom⁶. Exzessives Pflegeverhalten wurde auch als Benchmark bei der Bewertung von Verhaltensphänotypen in Modellen ähnlicher neurologischer Entwicklungsbedingungen bei Drosophila melanogaster verwendet. Obsessives Pflegeverhalten wurde in Fliegenmodellen des Fragile-X-Syndroms (FSX) und der damit verbundenen Autismus-Spektrum-Störung (ASS) beobachtet. Übermäßiges spontanes Grooming tritt unter Mutationen von dfmr1 auf, dem Ortholog zum ASD- und FSX-assoziierten Gen FMR1⁷. Darüber hinaus gibt es bei diesen Mutanten eine bemerkenswerte Veränderung in der Pflegeverteilung zwischen den hinteren und vorderen Enden⁸. Diese Veränderungen werden als Reflexion von obsessiven und zwanghaften körperorientierten Verhaltensweisen interpretiert, die von einigen Patienten mit diesen Erkrankungen gezeigt werden. Unter Verwendung des hier beschriebenen Grooming-Assays beobachteten wir das Grooming-Verhalten bei Fliegen nach einem RNAi-vermittelten Knockdown des Drosophila-Gens Atg8a, das von kommerziell erhältlichen GAL4-Treibern und UAS-RNAi-Linien produziert wurde⁹.

Bei dieser Methode handelt es sich um die manuelle Annotation von Aufnahmen, die von Fliegen für bestimmte Pflegeverhaltensweisen aufgenommen wurden. Frühere Studien, die darauf abzielten, das Fellpflegeverhalten zu bewerten, wie z. B. solche, die indirekte Methoden wie Farbstoffe verwendeten, ermöglichten zwar eine effektive Quantifizierung der Wirksamkeit der Fellpflege, aber keine Messung der Fellpflegedauer oder -häufigkeit¹⁰. Dieser Assay ermöglicht jedoch die Quantifizierung der Häufigkeit und Dauer der Fellpflege von Drosophila , sowohl allgemein als auch nach anatomischer Region. Die hier beschriebene Methode bietet einige Vorteile gegenüber den derzeitigen automatisierten Methoden, da sie leicht modifiziert werden kann und von Personen ohne rechnerischen Hintergrund durchgeführt werden kann. Da die erforderliche Ausrüstung in den meisten Labors leicht verfügbar ist, bieten wir eine kosteneffiziente Methode zur Bewertung des Vorhandenseins eines übermäßigen Selbstpflege-Phänotyps an (siehe Materialtabelle). Dadurch ist die Methode vor allem für Einrichtungen im Grundstudium leicht zugänglich und leicht an Ausbildungsumgebungen oder Lehrlabore anpassbar.

Protokoll

HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung der Dreharbeiten

1. Stellen Sie vier Drei-Well-Schalen nebeneinander auf eine weiße Oberfläche und bedecken Sie sie jeweils mit einem Objektträger.
2. Positionieren Sie eine Kamera (hier ein Raspberry Pi-System, aber jede Kamera, die hochauflösende Videos aufnehmen kann) über den Schüsseln.
   1. Vergewissern Sie sich, dass sich alle Gerichte im Bild und scharf befinden.
   2. Vergewissern Sie sich, dass die Objektträger nicht blendbar sind, die die Sichtbarkeit von Fliegen in der Schale einschränken. Beseitigen Sie die Blendung, indem Sie die Position der Platte anpassen oder die Beleuchtung im Aufnahmeraum dimmen.
   3. Verwenden Sie eine hohe Auflösung (mindestens 1920 x 1080 Pixel), um Fliegengliedmaßen genau zu visualisieren.
3. Markieren Sie die Position der Schüssel und der Kamera auf der Bank, auf der die Aufnahme stattfindet.
   HINWEIS: Dadurch wird der Zeitaufwand für Schritt 2 bei der zukünftigen Verwendung des Geräts begrenzt. Wenn Sie die Assays zur gleichen Zeit und im selben Raum durchführen, wird die Variabilität des Verhaltens auf der Grundlage von Faktoren begrenzt, die über die beabsichtigten Manipulationen hinausgehen.
4. Betäuben Sie die 4-9 Tage alten Fliegen leicht mit Kälte auf einem mit Parafilm bedeckten Eisblock und einem Papiertuch (die CO₂ -Betäubung hat einen erheblichen Einfluss auf das Verhalten).
   1. Klopfen Sie die Fliegen auf den Block und bringen Sie die Fliegen nach dem Betäuben so schnell wie möglich mit einem Pinsel in die Beobachtungskammern.
      HINWEIS: Diese Übertragung sollte so schnell wie möglich erfolgen, da sich eine übermäßige Exposition gegenüber Betäubungen jeglicher Art negativ auf die Fliegen auswirken kann.
5. Platzieren Sie eine einzelne Fliege in jeder Vertiefung.
6. Lassen Sie die Dateien sich 30 Minuten nach der Anästhesie an ihre neue Umgebung gewöhnen. Berühren oder stören Sie die Brunnen mit Fliegen nach diesem Zeitpunkt nicht mehr, da zusätzliche Stressfaktoren das Verhalten beeinflussen.

2. Aufzeichnen der Fliegen

1. Nach der 30-minütigen Eingewöhnung nehmen Sie die Fliegen mit einer Kamera auf.
2. Verwenden Sie eine Raspberry Pi-Kamera, die über PiSpy¹¹ läuft, um Verhaltensdaten zu sammeln.
   HINWEIS: Die Software ist kostenlos und auf GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy) verfügbar, und ein Pi-System kann problemlos für unter 300 US-Dollar eingerichtet werden. Auch andere Kameras, sofern bereits vorhanden, reichen für die Aufnahme von Filmmaterial aus
3. Starten Sie eine Aufzeichnung mit Pi mit dem folgenden Befehlsablauf.
   1. Öffnen Sie das Terminal und geben Sie cd PiSpy ein. Geben Sie dann python3 PiSpy.py ein, geben Sie die gewünschte Aufnahmelänge und die gewünschte Bildrate ein. Wählen Sie die gewünschte Auflösung aus und klicken Sie auf Quick Capture.
   2. Verwenden Sie die Kameravorschau-Funktion , um sicherzustellen, dass die Fliegen scharf und ausreichend sichtbar sind.
4. Nehmen Sie die Fliegen 10 Minuten lang mit einer empfohlenen Bildrate von 24 fps auf und speichern Sie die Datei (PiSpy speichert automatisch im Videoordner).

3. Videoanalyse (Abbildung 2)

1. Um das Video zu analysieren, importieren Sie die Datei in die Elan 6.8 Software¹².
   HINWEIS: Diese Software wurde ursprünglich für psycholinguistische Tallows für die detaillierte Annotation von Videos und eine eingehende Analyse des Pflegeverhaltens entwickelt
2. Weisen Sie jede Zeile wie unten dargestellt zu, um das Filmmaterial von Personen manuell mit Anmerkungen zu versehen.
   1. Führen Sie dazu den folgenden Befehlsablauf aus: Tier > Add New Tier > Geben Sie location in der Dish auf Tier Name > Add ein.
3. Je nach den Anforderungen einer Studie können Sie verschiedene spezifische Verhaltensweisen (vordere und hintere Fellpflege, Gehen, Schlafen und Stehen) notieren und quantifizieren.
   1. Erstellen Sie Anmerkungen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Doppelklicken Sie auf die Ebene, die mit Anmerkungen versehen werden soll. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und ziehen Sie den Cursor entlang der ausgewählten Ebene für einen Zeitraum, in dem eine einzelne Pflegephase ausgestellt ist. Klicken Sie mit der linken Maustaste, wählen Sie Neue Anmerkung , und doppelklicken Sie auf den neu markierten Zeitraum. Geben Sie die Abkürzung für das Verhalten ein, das zu diesem Zeitpunkt gezeigt wurde.
   2. Beobachten Sie die Videos langsam, wischen Sie sie mit der Maus durch und kommentieren Sie. Vergrößern Sie während der Annotation ein einzelnes Fly-Well, um eine falsche Identifizierung von Verhaltensweisen zu verhindern. Dazu gehören das Klopfen auf den Rand des Glases mit dem Hosenschlitz oder das Verschieben der Beine, was zunächst wie eine Fellpflege aussehen könnte.
4. Sobald das Video vollständig mit Anmerkungen versehen ist, erhalten Sie eine Aufschlüsselung der einzelnen Verhaltensweisen. Stellen Sie sicher, dass in den Videos dieselbe Abkürzung oder Anmerkung verwendet wird, um diese Funktion zu verwenden.
   HINWEIS: Elan 6.8 gibt an, wie oft ein Verhalten auftritt, die Gesamtdauer des Verhaltens und die durchschnittliche Zeit, die für jedes Verhalten aufgewendet wurde.
   1. Definieren Sie Grooming-Anfälle als 2 s ununterbrochene Fellpflege. Identifizieren Sie jedes beobachtete Verhalten wie folgt. Definieren Sie die Parameter für anatomische Regionen vor der Durchführung des Assays.
      1. Vordere Fellpflege: Identifizieren Sie die Fellpflege im vorderen Bereich des Fliegenkörpers als vordere Fellpflege.
         HINWEIS: Dieses Verhalten beinhaltet fast immer eine Reibbewegung an einem vorderen Teil, wie dem Kopf oder Rüssel, mit den vorderen beiden Beinen der Fliege.
      2. Hintere Fellpflege: Identifizieren Sie die Fellpflege am vorderen und hinteren Ende des Fliegenkörpers als hintere Fellpflege.
         HINWEIS: Zusätzlich wurden der Einfachheit halber Flügel im hinteren Bereich eingefügt. Dieses Verhalten beinhaltet fast immer eine Reibbewegung mit dem mittleren und hintersten Beinsatz im laufenden Betrieb. Ein guter Indikator für eine Fellpflege ist, dass die Fliege auf den ersten Blick so aussieht, als würden ihr die hintersten Beine fehlen, wie in Abbildung 2D dargestellt.

Ergebnisse

Dieser Assay liefert quantitative Daten, die den Zeitpunkt und die Häufigkeit des Pflegeverhaltens aus annotiertem Filmmaterial messen. Ein repräsentatives Bild des Setups und der Definition von Verhaltensweisen ist in Abbildung 2 dargestellt. Angesichts der Subjektivität, die die Videoanalyse mit sich bringt, sollten alle Anmerkungen von Videos für den Forscher, der die Analyse durchführt, verblindet werden.

Diese Methode wurde verwendet, um die Rolle des Dro...

Diskussion

Insgesamt ermöglicht dieser leicht ausführbare und kostengünstige Assay eine robuste Charakterisierung des Pflegeverhaltens von Drosophila melanogaster . Diese Technik gibt Einblick in die Häufigkeit, die Zeit, die mit der Auseinandersetzung verbracht wird, und die anatomische Verteilung einer großen Anzahl zuvor identifizierter Pflegeverhaltensweisen. Ein guter Indikator dafür, dass die Fellpflege stattfinden wird oder im Gange ist, sind Änderungen in der Beinplatzierung, insbe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 GB Micro SD-Karte	Adafruit	1294	Zur Verwendung bei der Einführung in das Betriebssystem
Display	Adafruit	3578	Jedes Display, das über HDMI oder Flex-Kabel angeschlossen werden kann, ist ausreichend
Drosophila Atg8a-RNAi UAS-Linie	Bloomington Stock Center	34340	Zeile für repräsentative Daten
Drosophila Ok6 Treiber	N/A	N/A	Zeile für repräsentative Daten
Objektträger	Fisher Scientific	12-550-A3	Hält Fliegen im Containment
Kühlkörper	Adafruit		Verhindert eine Überhitzung des Computers
Objektiv	Adafruit	4563	Nur mit HD-Kamera
verwendet PiCamera	Adafruit	4561	wurde die HD-Version verwendet, aber eine Standardkamera kann unter Budgetbeschränkungen verwendet werden
Raspberry Pi 4	Adafruit	4292	Computer PiSpy läuft auf
Ribbion Cable	Adafruit	1648	Für den Anschluss von Kamera und Display
SB-Komponenten Gehäuse	Adafruit	4301	Schützt den Computer
Spot Plate	Fisher Scientific	S99406	Pyrex-Versionen waren bereits für unseren Einsatz verfügbar, aber auch Zellkulturschalen oder Kunststoff-Spotplatten sind ausreichend
Stativ	Best Buy	6355959	Zum Aufhängen und Positionieren der Kamera ist jedes Gerät, das dazu in der Lage ist, ausreichend
USB C Netzteil	Adafruit	1995	Versorgt den Computer mit Strom

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