Methodenartikel

Bestimmung von vier Komponenten in einem Lipid-Nanopartikel-RNA-Verabreichungssystem durch Flüssigchromatographie in Kombination mit einem Verdunstungslichtstreudetektor

DOI:

10.3791/67711

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30. Mai 2025

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier etablieren wir eine quantitative Analysemethode für vier Komponenten in einem Lipid-Nanopartikel (LNP) RNA-Verabreichungssystem unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit einem Verdunstungslichtstreudetektor (ELSD). Das Verfahren zeichnet sich durch eine gute Trennung, eine hohe Empfindlichkeit und einen hohen Wirkungsgrad aus.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird eine Methode zur Analyse von Lipid-Nanopartikeln (LNP)-Komponenten vorgestellt. LNP, das als zentraler Vektor für RNA-basierte Medikamente dient, besteht hauptsächlich aus Cholesterin, PEG mit Modifikationen, ionisierbaren Lipiden und Helferlipiden. Diese Komponenten weisen eine schwache Polarität auf, was zu einer starken Retention und Schwierigkeiten bei der Trennung mittels Umkehrphasenchromatographie führt, sowie einen Mangel an ausgeprägten ultravioletten Absorptionseigenschaften. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde ein Flüssigkeitschromatographiesystem mit einem Verdunstungslichtstreudetektor (ELSD) gekoppelt. Durch die systematische Anpassung des Typs der chromatographischen Säule und die Optimierung des Gradientenelutionsprogramms der mobilen Phase wurde eine schnelle und vollständige Baseline-Trennung der vier kritischen Komponenten erreicht. Durch den Einsatz der neuesten ELSD-Technologie wurde die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbessert und der lineare Bereich der Methode erweitert. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die vier Komponenten von LNP in einem Konzentrationsbereich von 5 μg/ml bis 250 μg/ml eine ausgezeichnete Linearität mit Korrelationskoeffizienten von jeweils mehr als 0,999 aufwiesen, und die Genauigkeit reichte von 94,2 % bis 108,0 %. In Präzisionsexperimenten lagen die relativen Standardabweichungen sowohl der Retentionszeit als auch der Peakfläche für eine 10 μg/ml-Standardlösung unter 0,1 % bzw. 2 %. Bei der Analyse verschiedener LNP-Proben mit dieser Methode werden alle Komponenten erfolgreich getrennt und ihre jeweiligen Inhaltsstoffe genau quantifiziert, was die robuste Anpassungsfähigkeit dieses analytischen Ansatzes unterstreicht.

Einleitung

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Lipid-Nanopartikel (LNP) sind eines der fortschrittlichsten nicht-viralen Gentransfersysteme, das hauptsächlich für die Verabreichung von Nukleinsäure-Medikamenten wie Antisense-Oligonukleotiden, kleinen interferierenden Nukleotiden, mRNA usw. verwendet wird 1,2,3. LNP besteht im Allgemeinen aus vier Komponenten: ionisierbaren Lipiden, Polyethylenglykol (PEG)-modifizierten Lipiden, Phospholipiden und Cholesterin. Die Schlüsselkomponente sind ionisierbare Lipide, die der entscheidende Faktor für die Effizienz der Nukleinsäure-Wirkstoffabgabe sind. Die anderen drei Komponenten können die Stabilität von LNP erhöhen und die Erkennung des Immunsystems verringern 4,5,6.

Die unterschiedlichen Verhältnisse der vier Komponenten in LNP können den Selbstorganisationsprozess der Nanopartikel erheblich beeinflussen und Eigenschaften wie die Verkapselungseffizienz des pharmazeutischen Wirkstoffs (API), seine Verabreichungseffizienz und die Freisetzungsrate in vivo beeinflussen 7,8,9. Daher ist es wesentlich, ein quantitatives Analyseverfahren für LNP-Komponenten zu etablieren, um dadurch die Synthese eines optimalen LNP-Zuführsystemszu erleichtern 10,11.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine moderne Analysetechnik, die in der pharmazeutischen Analytik weit verbreitet ist und für ihre hohe Effizienz, Empfindlichkeit und Automatisierungsfähigkeit geschätzt wird. Die HPLC umfasst verschiedene Detektoren, darunter konventionelle Ultraviolett (UV)-Detektoren, aber auch Allzweckdetektoren wie Brechungsindex-Detektoren (RID), Verdunstungslichtstreudetektoren (ELSD), Detektoren für geladene Aerosole (CAD) und hochselektive Hochfrequenz-Detektoren (RF), um nur einige zu nennen12.

Bei der Analyse der vier Komponenten von LNP, die keine ausgeprägten UV-absorbierenden Gruppen aufweisen und daher bei UV-Detektoren keine Reaktion hervorrufen, wurde der Einsatz von Allzweckdetektoren in Betracht gezogen. Obwohl RID eine solche Option ist, ist es nicht für die Gradientenanalyse geeignet und bietet im Vergleich zu den beiden anderen Allzweckdetektoren eine relativ geringere Empfindlichkeit. daher wurde es nichtgewählt 12. Darüber hinaus zeichnen sich CAD-Detektoren zwar durch eine hohe Empfindlichkeit aus, sind aber aufgrund ihrer unerschwinglichen Kosten weniger attraktiv12.

Daher wurde der ELSD-Detektor ausgewählt. Dieser Detektor verfügt über eine spezielle Verstärkungsmodus-Option - den "Wide"-Modus -, der die gleichzeitige Analyse von hochkonzentrierten und Spurenkomponenten ermöglicht, die Empfindlichkeit erhöht und den linearen Bereich erweitert.

In diesem Artikel wird ein HPLC-System verwendet, das mit ELSD gekoppelt ist, wodurch eine effiziente Trennung und quantitative Analyse der vier Komponenten von LNP durch Optimierung der chromatographischen Säulen, der Gradientenelution mobiler Phasen und anderer Bedingungen erreichtwird 13.

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Protokoll

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1. Vorbereitung des Instruments

  1. Einrichtung des Instruments
    1. Richten Sie ein HPLC-System ein, das mit einem ELSD gekoppelt ist.
  2. Installation der Säule
    1. Installieren Sie die chromatographische Säule (C4-300; 150 mm × 4,6 mm Innendurchmesser, 5 μm) in Pfeilrichtung auf der Säule, wobei ein Ende mit dem Auslass des Autosamplers und das andere mit dem ELSD-Eingang verbunden ist.
  3. Vorbereitung der mobilen Phase
    1. Bereiten Sie die mobilen Phasen vor: A-Phase, eine wässrige Lösung von 10 mM TEAA (pH = 7,0), und B-Phase, eine 10 mM TEAA-Methanollösung (pH = 7,0).
    2. Zur Vorbereitung der A-Phase 1,01 g Triethylamin genau wiegen, in 1000 ml Wasser auflösen, gut mischen und den pH-Wert mit Essigsäure auf 7,0 einstellen.
    3. Zur Vorbereitung der B-Phase 1,01 g Triethylamin in 1000 ml Methanol auflösen, mischen und den pH-Wert auf 7,0 mit Essigsäure einstellen.
  4. Bearbeitung der Methode
    1. Schalten Sie die Netzschalter für jedes Modul des LC-ELSD ein und starten Sie die LabSolutions-Software . Öffnen Sie dann das Fenster Echtzeitanalyse .
    2. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Neu, um eine neue Methodendatei zu erstellen. Ändern Sie die LC-Stoppzeit in der Methode auf 15, und klicken Sie auf Auf alle Erfassungszeit anwenden.
    3. Klicken Sie dann auf Pumpe , um die Pumpenparameter zu ändern. Wählen Sie den Analysemodus als Binärer Hochdruckgradient (B.GE) und stellen Sie die Durchflussrate auf 1,0 mL/min ein.
    4. Stellen Sie dann die anfängliche Konzentration von Pumpe B (%B) auf 80 % ein und ändern Sie den Gradienten der mobilen Phase: Bei 3 min beträgt %B 80 %, bei 4 min beträgt %B 85 % von 5,5 min auf 12 min, %B ist 100 %, bei 12,1 min kehrt %B zu 80 % zurück.
    5. Klicken Sie anschließend auf Säulenofen und stellen Sie die Ofentemperatur auf 55 °C ein. Klicken Sie abschließend auf ELSD , um die Temperatur des Treibrohrs auf 40 °C zu ändern. Speichern Sie die Methode.
      HINWEIS: Die Zusammenfassung der Parameter ist in Tabelle 1 dargestellt.
  5. Starten Sie das Instrument und äquilibrieren Sie es.
    1. Klicken Sie auf Download und Start, um das Gerät zu starten und auszugleichen.

2. Vorbereitung von Standardlösungen und Proben

  1. Vorbereitung von Standardlösungen
    1. Wiegen Sie 10,0 mg der vier LNP-Komponenten-Standardsubstanzen separat, lösen Sie sie in 1 mL Methanol auf und wirbeln Sie sie auf, bis sie vollständig aufgelöst sind, um Stammlösungen mit einer Konzentration von 10 mg/ml für jede Komponente zu erhalten.
    2. Übertragen Sie mit einer Pipette genau 100 μl jeder der vier Stammlösungen in ein Probengefäß und fügen Sie dann 600 μl Methanol hinzu. Gründlich mischen, um eine gemischte Zwischenlösung 1 mit einer Konzentration von 1000 μg/ml herzustellen.
    3. Übertragen Sie 20 μl jeder der vier Stammlösungen genau in ein Probengefäß und fügen Sie dann 920 μl Methanol hinzu. Gründlich mischen, um eine gemischte Zwischenlösung 2 mit einer Konzentration von 200 μg/ml herzustellen.
    4. Als nächstes bereiten Sie eine Reihe von Standardlösungen in Konzentrationen von 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml und 250 μg/ml durch serielle Verdünnung gemäß Tabelle 2 vor.
  2. Vorbereitung der Proben
    1. Übertragen Sie mit einer Pipette genau 100 μl der Probe in ein Probenfläschchen, fügen Sie dann 900 μl Methanol hinzu und mischen Sie es gut. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die LNP-Konzentration in der Probe um das 10-fache verdünnt und das LNP vom Nukleinsäure-Medikament dissoziiert wird.

3. Datenerfassung

  1. Geben Sie die Standardlösungen und Probenlösungen in den Autosampler des Flüssigkeitschromatographen.
  2. Klicken Sie auf Realtime Batch in der Assistenten-Symbolleiste des Fensters Realtime Analysis. Klicken Sie anschließend im Menü Datei auf Neu, um eine neue Stapeltabelle zu erstellen.
  3. Geben Sie in der Chargentabelle das Fläschchen#, den Tray-Namen, die Datendatei und das Injektionsvolumen der Standard- und Probenlösung ein und wählen Sie die in Schritt 1.4 gespeicherte Methodendatei aus. Klicken Sie im Menü Datei auf Batch-Datei speichern, um die Batch-Datei zu speichern.
  4. Warten Sie, bis der Flüssigkeitschromatographendruck und die Basislinie des Chromatogramms stabil sind. Klicken Sie dann in der Symbolleiste des Assistenten auf Echtzeit-Batch starten , um die Datenerfassung zu starten.

4. Datenanalyse

  1. Erstellen von Kalibrierkurven
    1. Öffnen Sie das Browserfenster der LabSolutions-Software und ziehen Sie die Daten der Standardlösung in die quantitative Ergebnisansicht, um eine Kalibrierkurve zu erstellen. Ändern Sie anschließend die Parameter für die Datenverarbeitung. Klicken Sie in der Methodenansicht auf Bearbeiten.
    2. Ändern Sie im Fenster Integrationsparameter den Neigungswert in 10000. Ändern Sie dann in den Identifikationsparametern die Identifikationsmethode in Band , und legen Sie die Standardbandbreite auf 0,1 min fest.
    3. Ändern Sie danach die quantitativen Parameter. Ändern Sie die quantitative Methode in Externer Standard, und legen Sie # für Kalibrierstufe auf 7 fest. Wählen Sie den Kalibrierkurventyp als Exponentiell aus. Ändern Sie als Nächstes die Verbindung.
    4. Geben Sie die Namen und Standardlösungskonzentrationen der vier LNP-Komponenten ein. Doppelklicken Sie auf den Spitzenpunkt, um die Aufbewahrungszeiten zu aktualisieren. Klicken Sie abschließend auf Ansicht , um die Änderung der Datenverarbeitungsparameter abzuschließen.
    5. Ändern Sie den Stichprobentyp in der Ansicht Quantitative Ergebnisse in Standard (Berechnungspunkt). Entsprechend den Konzentrationen sind die Werte der Standardlösung von 1 bis 7 einzustellen. Sobald die Kalibrierungskurven erstellt sind, klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und speichern Sie die Methodendatei.
  2. Quantitative Analyse von Proben
    1. Ziehen Sie die Daten der Proben in die quantitative Ergebnisansicht des Browserfensters, in der die Konzentrationsergebnisse der vier LNP-Komponenten in den Proben angezeigt werden.

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Ergebnisse

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Die Analyse der LNP-Standardlösung mit dieser Methode erreichte einen Trenngrad von mehr als 1,5 für die vier Komponenten, wodurch eine Basislinientrennung realisiert wurde. Darüber hinaus wurden keine Rückstände in hochkonzentrierten Standardlösungen beobachtet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Es wurde eine Kalibrierkurve in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 250 μg/ml erstellt, die Korrelationskoeffizienten von über 0,999 aufwies, was auf einen breiten linearen Bereich und eine hervorra...

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Diskussion

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Alle vier Komponenten von LNP weisen eine relativ schwache Polarität auf. Bei der Analyse mit einer C18-Säule zeigen die Zielverbindungen eine starke Retention innerhalb der Säule, was zu einer Verbreiterung des Phospholipid-Peaks für stark zurückgehaltene Komponenten führt. Darüber hinaus sammeln sich nach der Analyse hochkonzentrierter Lösungen Rückstände am Kopf der C18-Säule an, die die Genauigkeit der Quantifizierung beeinträchtigen könnten. Das Chromatogramm ist in

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Vielen Dank an die biopharmazeutischen Unternehmen für die Bereitstellung der LNP-Proben für das Experiment und Dank an Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd für die Bereitstellung der Chromatographiesäule.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalanceShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdAP135W
SäuleShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdShimNex WP C4 (380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO., LTDELSD-LT III (228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO., LTD
LCShimadzu (China) CO., LTDLC40D XR
MethanolANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipette-100 & Mikro; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-100
Pipette-1000 & Mikro; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
ReinstwassersystemMilliporeZIQ7000T0C
Vortex-MischerANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Lipid NanopartikelLNP KomponentenanalyseGradientenelutionBasislinientrennungHochleistungsfl ssigkeitschromatographieKalibrierkurveExterner Standard Methode

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