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Methodenartikel

Effektive und sichere Genabgabe an die Mausniere durch langsame retrograde Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren in das Nierenbecken

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DOI:

10.3791/67716

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1. August 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt die lokalisierte Injektionsmethode von AAV-Vektoren über das Nierenbecken für einen effektiven und sicheren Gentransfer in die Mausniere.

Zusammenfassung

Die Entwicklung wirksamer In-vivo-Werkzeuge und -Methoden für den Gentransfer in die Niere ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Nierengrundlagenforschung und der Gentherapie bei Nierenerkrankungen. Darüber hinaus unterstreicht das wachsende Bewusstsein für monogene Nierenerkrankungen, das durch fortschrittliche Gentests vorangetrieben wird, das Potenzial der Gentherapie, schwer zu behandelnde genetische Nierenerkrankungen zu behandeln und sogar zu heilen. In diesem Zusammenhang haben Adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV) als robuste Plattform für die In-vivo-Genübertragung zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Die effektivste und sicherste Methode für die AAV-Vektor-vermittelte Genabgabe an jeden therapeutisch relevanten Zelltyp in der Niere ist jedoch noch nicht vollständig etabliert. Hier wird die Methode der langsamen retrograden Injektion von AAV-Vektoren in das Nierenbecken (RP) detailliert beschrieben und ihr hohes Potenzial zur Transduktion von Mausnieren demonstriert, wenn sie mit entsprechend ausgewählten AAV-Kapsiden verwendet wird. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass diese Methode nicht nur mit den standardmäßigen Cäsiumchlorid-ultrazentrifugationsgereinigten AAV (CsCl AAV)-Vektoren wirksam ist, sondern auch mit zentrifugal ultrafiltrierten AAV (CU AAV) Vektor-Minipreps, die schnell und einfach mit Techniken hergestellt werden können, die keine spezielle AAV-Vektor-Expertise erfordern. Als Beispiel zeigt diese Studie, dass eine langsame RP-Injektion sowohl von CsCl- als auch von CU AAV-KP3-Vektoren zu einer robusten Transduktion von proximalen Tubuli in der Mausniere ohne offensichtliche Gewebeschädigung führt, im Gegensatz zu zuvor berichteten hydrodynamischen Ansätzen, die unweigerlich zu Gewebeschäden führen. Daher unterstreicht diese Studie, dass die langsame retrograde RP-Injektion ausgewählter AAV-Kapsid-abgeleiteter Vektoren eine effektive und sichere Methode für die Genabgabe in die Niere ist. Diese Methode wird auf ein breites Spektrum der Nierenforschung anwendbar sein, einschließlich Gentherapie-Studien. Der Einsatz von CU AAV-Vektor-Minipreps wird den Durchsatz erheblich erhöhen und die Zeit- und Kosteneffizienz verbessern, die für die Generierung vorläufiger Daten und die Gewinnung wichtiger Erkenntnisse erforderlich ist.

Einleitung

Effektive und sichere Methoden für den Gentransfer in die Niere bei kleinen und großen Versuchstieren bieten entscheidende Möglichkeiten, die Grundlagenforschung an der Niere voranzutreiben und innovative Therapieansätze zu erforschen. Die Etablierung solcher Methoden ist insbesondere für die Gentherapie bei verschiedenen Nierenerkrankungen relevant. Jüngste Fortschritte bei klinischen Gentests haben gezeigt, dass monogene Nierenerkrankungen häufiger auftreten als bisher angenommen, von denen etwa 30 % der Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen (CKDs) betroffen sind1. Die CKD ist gekennzeichnet durch eine fortschreitende Nierenschädigung, die letztlich zu Nierenversagen führt, ohne dass es wirklich wirksame krankheitsmodifizierende Therapien gibt. Hämodialyse und Nierentransplantation sind derzeit verfügbare Behandlungen; Sie weisen jedoch Einschränkungen auf, die die Lebensqualität von Patienten mit CKD2 erheblich beeinträchtigen. Daher hat die Gentherapie, ein klinisch erprobter, wirksamer Ansatz zur Behandlung genetischer Krankheiten, in den letzten Jahren als neuartiger Weg zur wirksamen Behandlung von genetischen Nierenerkrankungen, die zu CKD führen, große Aufmerksamkeit erregt 3,4,5,6. Dieser Ansatz kann direkt an den Ursachen der Krankheiten ansetzen und möglicherweise eine Heilung bieten.

Trotz der stetigen Fortschritte auf diesem Gebiet bleibt die Verabreichung von Genen an die Niere sowohl in der Forschung als auch in der Therapie eine große Herausforderung. Aufgrund der komplexen Struktur des Organs und der einzigartigen physiologischen Barrieren, einschließlich der glomerulären Filtrationsbarriere, die aus glomerulären Endothelzellen, der glomerulären Basalmembran und den Podozytenfußfortsätzen besteht, ist es schwierig, Nierenzellen effizient mit therapeutischen Genen zu versorgen. Es wurden verschiedene Strategien für die nierengezielte Genabgabe untersucht, einschließlich der direkten Injektion der Nierenrinde (RC) 7,8, der Injektion der Nierenarterie (RA) 9,10,11, der Injektion der Nierenvene (RV) 12,13,14, der Injektion des Nierenbeckens (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 und intravenöse (IV) Injektion 19,26,27,28,29,30 von viralen oder nicht-viralen Genverabreichungsvektoren sowie Ultraschall und Mikroblasen-vermittelte Nukleinsäureabgabe 31,32. Diese Ansätze zeigten variable Transduktionseffizienzen oder funktionale Ergebnisse, die oft zu inkonsistenten Ergebnissen führten, die schwer miteinander in Einklang zu bringen sind (überprüft in den Referenzen 3,33,34,35). Die Verabreichung von Genen an die Niere ist noch unterentwickelt, was direkte Vergleiche zwischen Vektorsystemen und Methoden schwierig macht. Lokalisierte Verabreichungsmethoden, die die Verabreichung hochkonzentrierter Wirkstoffe direkt in die Niere ermöglichen, haben jedoch im Allgemeinen bessere Ergebnisse erzielt als die systemische intravenöse Verabreichung. Darüber hinaus wurden Adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV) mit ihren robusten Sicherheitsprofilen und ihrer nachgewiesenen Erfolgsbilanz bei der klinischen Translation36,37 am besten untersucht und gelten als die erste Wahl für den renalen Gentransfer.

Gängige AAV-Serotypen und manipulierte Kapside haben eine effektive Transduktion von mesangialen und mesenchymalen Zellen in der Niere nach intravenöser Injektion bei Mäusen gezeigt 28,30,38. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die intravenöse Verabreichung von AAV9 in Mausmodellen des nephrotischen Syndroms und des Alport-Syndroms effektiv Podozyten transduzieren kann, obwohl dieser Effekt bei gesunden Nieren nicht beobachtet wird38,39, und dass die intravenöse Verabreichung eines manipulierten AAV2-Kapsids ausschließlich auf glomeruläre Endothelzellen sowohl in gesunden als auch in entzündeten Nieren bei Mäusen abzielenkann 40. In der Vergangenheit war es schwierig, Nierentubuli über den intravenösen Weg zu transduzieren. Es wurde jedoch kürzlich entdeckt, dass die RP-Injektion ausgewählter AAV-Kapside, wie z. B. AAV-KP141, eine Transduktion von proximalen Tubuli auf einem Niveau erreichen kann, das mehr als eine Größenordnung höher ist als mit dem Benchmark-AAV9-Kapsid38. Obwohl weitere Verbesserungen erforderlich sind, eröffnen diese Fortschritte neue Wege für die Grundlagenforschung und die Gentherapie und bieten Möglichkeiten, die bisher unerreichbar waren.

In diesem Artikel wird die langsame retrograde RP-Injektion von AAV-Vektoren als effektive und sichere Methode für die Genabgabe an die Mausnierebeschrieben 38. Als repräsentatives Beispiel für diese Technik wurde AAV-KP3 als beispielhaftes Kapsid ausgewählt, basierend auf der Entdeckung, dass es eines der sechs Kapside (d.h. AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 und AAV2.7m844) ist, die im Vergleich zu AAV9 nach RP-Injektion bei Mäusen eine erhöhte renale Transduktion zeigten38. Bemerkenswert ist, dass langsames retrogrades RP-injiziertes Nierengewebe im Gegensatz zu denen, die mit hydrodynamischen Ansätzen behandelt wurden, keine offensichtliche Gewebeschädigung aufwiesen, über die zuvor berichtet wurde23,24. Darüber hinaus erreichten AAV-Miniprep-Vektoren45, die durch schnelle und einfache zentrifugale Ultrafiltration grob gereinigt wurden (d. h. CU-AAV-Vektoren), renale Transduktionswerte, die etwa 70 % derjenigen erreichen können, die durch AAV-Vektorpräparate erreicht werden können, die durch die Standard-Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt wurden (d. h. CsCl-AAV-Vektoren), wenn sie bei demselben Vektorgenomtiter verabreicht wurden. Daher stellen die hier vorgestellte Methode und die Beobachtungen eine wertvolle und praktische Ressource für Forscher dar, die versuchen, die Genübertragung an die Niere bei Mäusen und potenziell größeren Tieren zu verbessern.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health & Science University (OHSU) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Tierhaltung an der OHSU durchgeführt. In dieser Studie wurden acht Wochen alte männliche Mäuse des Typs C57BL/6J verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von AAV-Vektoren durch eine Adenovirus-freie Plasmidtransfektion

  1. Kultivieren Sie 293 Zellen der menschlichen embryonalen Niere (HEK) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-hoher Glukose (4,5 g/l), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin- und Streptomycin-Mix und 1 mM L-Glutamin in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
  2. An Tag -2 (48 h vor der Transfektion) Platte 4 x 106 HEK 293 Zellen pro T225-Kolben in 40 ml des Kulturmediums, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Dies erreicht ~95% Konfluenz an Tag 0.
    HINWEIS: Die Kulturskala kann je nach Anwendung angepasst werden. Bereiten Sie für ein AAV-Miniprep (Schritt 2) eine angemessene Anzahl von Kolben basierend auf dem Zieltiter und der Vektorkonzentration vor, wobei zu berücksichtigen ist, dass der Reinigungsprozess in der Regel zu einem Materialverlust von etwa 50 % führt. Um >6 x 1012 vg/ml AAV9- und AAV-KP3-Vektoren für die RP-Injektion bei Mäusen bei einer Dosis von 3 x 1011 vg/Maus in einer 50 μl Vektorlösung zu erreichen, werden mindestens 2 Kolben empfohlen. Für die Herstellung von AAV-Vektoren in größerem Maßstab, wie z. B. für CsCl-Dichtegradienten-gereinigte AAV-Vektoren (CsCl-AAVs), werden typischerweise 25 oder mehr Kolben verwendet.
  3. Tag 0: Plasmid-DNA-Transfektion
    1. Vorbereitung auf die Transfektion
      1. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine Konfluenz von ~95 % erreicht haben.
      2. Erwärmen Sie DMEM supplementiert mit 1% Penicillin und Streptomycin Mix und 1 mM L-Glutamin, jedoch ohne FBS (d.h. serumfreies Medium) in einem 37 °C Wasserbad.
      3. Lassen Sie die lineare Polyethylenimin-Lösung (PEI) Raumtemperatur erreichen.
    2. Herstellung einer Plasmid-DNA-Mischung
      1. Mischen Sie die Plasmide (je 15 μg pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap und pHelper) in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne CaCl2 oder MgCl2 in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die Gesamtmenge an DNA beträgt 45 μg/Kolben.
        HINWEIS: Volumina von Plasmid-DNA-Lösungen können ignoriert werden, wenn sie minimal sind. Eine Volumenanpassung wird jedoch empfohlen, wenn das Gesamtlösungsvolumen ≥225 μl beträgt. Die Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Plasmide sind in der Zusatzdatei 1 verfügbar.
    3. PEI-Transfektion
      1. 90 μl PEI-Lösung (1 mg/ml) zu dem 1 ml PBS geben und mit dem PBS-Plasmid-DNA-Mix (wie oben vorbereitet) in einem 50-ml-Polypropylenröhrchen mischen. Das endgültige Volumen beträgt ca. 2 mL (5 % des Volumens des Kulturmediums).
      2. Wirbeln Sie die Röhrchen 5 s lang und drehen Sie die Röhrchen kurz mit einer Zentrifuge, um die Flüssigkeit am Boden der Röhrchen zu sammeln.
    4. 15 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, um Plasmid-DNA-PEI-Komplexe zu bilden.
    5. Sobald die 15-minütige Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie die 40 ml vorgewärmtes serumfreies Medium, das in Schritt 1.3.1.2 hergestellt wurde, zu den Plasmid-DNA-PEI-Komplexen. Das Volumen beträgt ca. 42 ml.
    6. Das Kulturmedium des T225-Kolbens wird durch Plasmid-DNA-PEI-Komplexe ersetzt, die das in Schritt 1.3.4 beschriebene serumfreie Medium enthalten.
    7. Bewahren Sie die Zellen bis zur Ernte am 5. Tag in diesem Transfektionsmedium auf (es ist kein Medienwechsel erforderlich).
    8. Beobachten Sie an Tag 2 Zellen, die mit den Plasmid-exprimierenden fluoreszierenden Proteinen (z. B. pAAV-CAG-tdTomato) transfiziert wurden, unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz der Plasmidtransfektion zu beurteilen.
      HINWEIS: Die oben beschriebenen Bedingungen führen in der Regel zu einer Transfektionseffizienz von mehr als 70 %. Einige morphologische Veränderungen (z. B. Zellverlängerung) können beobachtet werden, wahrscheinlich aufgrund der serumfreien Umgebung.
    9. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen an den Tagen 3 bis 5 in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
    10. Sammeln Sie an Tag 5 sowohl die Zellen als auch das virushaltige Medium in ein 50-ml-Polypropylenröhrchen.
    11. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.

2. Reinigung von AAV-Vektoren durch zentrifugale Ultrafiltration (CU) (AAV miniprep)

  1. Die gefrorene Probe aus Schritt 1.3.11 wird in einem 37 °C heißen Wasserbad aufgetaut.
  2. Halten Sie 1 ml Rohlysat für den DNA-Dot-Blot-Assay beiseite (wird als Fraktion 1 verwendet).
  3. 80 μl 1M Magnesiumchlorid (MgCl2, Endkonzentration von 2 mM), 160 μl 0,1 M Natriumhydroxid (NaOH, Endkonzentration von 0,4 mM) und 16 μl Serratia marcescens Endonuklease (Endkonzentration von 100 Einheiten/ml) in ein 50 ml-Röhrchen geben. Bei 37 °C 1 h inkubieren. Wirbeln Sie die Probe während der Inkubation alle 15 Minuten vortexen.
  4. Sammeln Sie die mit Serratia marcescens Endonuklease behandelte Probe in eine 250-ml-Zentrifugenflasche und zentrifugieren Sie sie bei 10.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten.
  5. Übertragen Sie den Überstand mit einer serologischen 50-ml-Pipette auf ein 50-ml-Polypropylenröhrchen.
  6. Filtrieren Sie den Überstand, um Schmutz mit einem 0,45 μm PVDF-Spritzenvorsatzfilter zu entfernen. Halten Sie 1 ml der 0,45 μm filtrierten Probe für den DNA-Dot-Blot-Assay (wird als Fraktion 2 verwendet) beiseite.
  7. Geben Sie 10 ml Wasser in molekularer Qualität in ein 100 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugal-Ultrafiltrationsröhrchen (MWCO) und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 2.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Durchfluss.
  8. Geben Sie 15 ml 5%iges Sorbit in PBS in das Zentrifugal-Ultrafiltrationsröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 2.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Durchfluss.
  9. Bis zu 15 ml 0,45 μm filtrierte Probe wie in Schritt 2.6 beschrieben zugeben und bei 2.000 x g bei 4 °C für 15 min zentrifugieren, bis das Zielvolumen von ca. 500 μl erreicht ist. Halten Sie 1 ml Durchfluss für den DNA-Dot-Blot-Assay beiseite (wird als Fraktion 3 verwendet).
    HINWEIS: Vor jeder Zentrifugation das Retentat mit einer Pipette resuspendieren, um den Konzentrationsgradienten zu unterbrechen. Berühren Sie die Membran nicht mit der Pipettenspitze. Wenn das Zielvolumen nach einer 15-minütigen Zentrifugation nicht erreicht wird, verlängern Sie die Zentrifugation nach Bedarf, indem Sie die Dauer basierend auf dem verbleibenden Volumen im Röhrchen anpassen.
  10. Wiederholen Sie Schritt 2.9, bis die gesamte Probe filtriert ist und das Zielvolumen von ca. 500 μl erreicht ist. Lassen Sie 1 ml des Durchflusses aus der ersten und zweiten Iteration von Schritt 2.10 für den DNA-Dot-Blot-Assay (verwendet als Fraktion 4 und Fraktion 5) beiseite.
    HINWEIS: Ein einzelnes Zentrifugal-Ultrafiltrationsröhrchen kann verwendet werden, um Proben zu verarbeiten, die aus zwei oder mehr Kolben gewonnen werden.
  11. 15 ml 5%iges Sorbit in PBS zugeben und 15 min bei 2.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, bis das Zielvolumen von ca. 500 μl erreicht ist. Halten Sie 1 ml Durchfluss für den DNA-Dot-Blot-Assay beiseite (wird als Fraktion 6 verwendet).
  12. Wiederholen Sie Schritt 2.11 (wird als Bruch 7 verwendet).
    HINWEIS: Wenn für nachgeschaltete Experimente höhere AAV-Titer erforderlich sind, kann das endgültige Zielvolumen weiter auf 150 μl reduziert werden.
  13. Übertragen Sie den ultrafiltrierten AAV-Vektor auf ein 2-ml-Schraubverschlussröhrchen mit O-Ring. Halten Sie 10 μl des ultrafiltrierten AAV-Vektors für den DNA-Dot-Blot-Assay beiseite (wird als Fraktion 8 verwendet).
  14. Bestimmung der AAV-Titer mittels DNA-Dot-Blot-Assay wie zuvor beschrieben46.
    HINWEIS: CU-gereinigte Vektoren (CU AAV) enthalten im Vergleich zu CsCl-gereinigten Vektoren (CsCl AAV) einen höheren Gehalt an Kontamination durch leere Kapside und von Wirtszellen abgeleitete Verunreinigungen. Diese Faktoren können sich auf die Transduktionseffizienz und die Immunreaktionen auswirken und erfordern eine sorgfältige Berücksichtigung bei der Dateninterpretation.

3. CsCl-Dichtegradientenaufreinigung von AAV-Vektoren

  1. Die gefrorene Probe aus Schritt 1.3.11 wird in einem 37 °C heißen Wasserbad aufgetaut.
  2. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten, um die Zelltrümmer zu entfernen.
  3. Sammeln Sie den Überstand und fällen Sie AAV-Vektoren im Überstand durch Zugabe von Polyethylenglykol 8000 (PEG, Endkonzentration von 8 %) und Natriumchlorid (Endkonzentration von 500 mM).
  4. 3 Stunden auf Eis inkubieren.
  5. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g bei 4 °C für 30 min, um die AAV-haltigen Pellets zu erhalten.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 10 ml Sarkosyl-haltigem Resuspensionspuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 % Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Füllen Sie die Pelletsuspension in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen und halten Sie es über Nacht bei 4 °C.
  8. Am nächsten Tag wird die Pelletsuspension mit Serratia marcescens Endonuklease (Endkonzentration von 200 Einheiten/ml) und MgCl2 (Endkonzentration von 2 mM) behandelt.
  9. 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
  10. Bei 10.000 x g bei 4 °C 30 min zentrifugieren.
  11. Den Überstand auffangen und Cäsiumchlorid (CsCl, Endkonzentration des Brechungsindex (RI) = 1,3710 +/- 0,0005) und EDTA (Endkonzentration von 20 mM) zugeben.
  12. Laden Sie die Probe in ein 29,9-ml-Ultrazentrifugenröhrchen und fügen Sie Topping-Lösung (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) hinzu, bis sie voll ist.
  13. Zentrifugieren bei 41.000 x g bei 12 °C für 22 h.
  14. Stanzen Sie Löcher in den Boden und die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens, um insgesamt 15 Fraktionen zu je 2 mL zu sammeln.
  15. Verwenden Sie 10 μl jeder Fraktion, um die RI zu überprüfen, und führen Sie den DNA-Dot-Blot-Assay46 durch.
  16. Bestimmen Sie basierend auf den Ergebnissen des RI- und DNA-Dot-Blot-Assays die besten 5 Fraktionen, die AAV-Vektoren enthalten.
  17. Kombinieren Sie die besten 5 Fraktionen (insgesamt ca. 10 ml) und stellen Sie den RI auf 1,3710 +/- 0,0005 ein.
  18. Laden Sie die Probe in ein 11,2-ml-Ultrazentrifugenröhrchen und fügen Sie die Topping-Lösung hinzu, bis sie voll ist.
  19. Zentrifugieren bei 65.000 x g bei 12 °C für 12 h.
  20. Stanzen Sie Löcher in den Boden und die Seite des 11,2-ml-Ultrazentrifugenröhrchens, um insgesamt 18 Fraktionen zu je 0,5 mL zu sammeln.
  21. Verwenden Sie 10 μl jeder Fraktion, um die RI zu überprüfen, und führen Sie den DNA-Dot-Blot-Assay46 durch.
  22. Bestimmen Sie basierend auf den Ergebnissen des RI- und DNA-Dot-Blot-Assays die besten 6 Fraktionen, die AAV-Vektoren enthalten.
  23. Kombinieren Sie die besten 6 Fraktionen (insgesamt ca. 3 mL) und laden Sie sie in eine Dialysekassette.
  24. Schwimmen Sie die Dialysekassette in 1,3 l Dialysepuffer (PBS-Puffer ergänzt mit 0,001 % nichtionischem Tensid) mit einem Rührstab für 2 Stunden, um das CsCl zu entfernen.
  25. Wiederholen Sie den Schritt 3.24 zweimal (insgesamt 6 Stunden Dialyse).
  26. Übertragen Sie die Kassette auf 500 mL 5 % Sorbit in PBS-Puffer, ergänzt mit 0,001 % Tensid für 2 Stunden für den Pufferaustausch.
  27. Entnehmen Sie die Probe mit einer Spritze aus der Dialysekassette und filtern Sie die entnommene Probe mit einem 0,22 μm PVDF-Spritzenvorsatzfilter.
  28. Bestimmung der AAV-Titer durch einen quantitativen Dot-Blot-Assay46.

4. Qualitätsbewertung von AAV-Vektorpräparaten mittels SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung

  1. Vektorpräparationen, 1 x 1010 vg für CsCl AAV-Vektoren und 1 x 109 und 1 x 1010 vg für CU AAV-Vektoren, mit 6x Laemmli Puffer in insgesamt 18 μL (Vektorpräparation: 6x Laemmli = 15:3) mischen und bei 100 °C für 5 min erhitzen.
  2. Laden Sie die wärmebehandelten AAV-Vektorpräparate auf ein 7,5%iges SDS-PAGE-Gel und elektrophoresieren Sie die Proben bei 20 mA unter Verwendung eines Tris-Glycin-SDS-Gel-Laufpuffers.
  3. Nehmen Sie das Gel aus der Gelkassette, spülen Sie es mit Reinstwasser ab und färben Sie es mit einem Silberfärbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Inkubieren Sie das mit CsCl AAV-Vektoren beladene Gel 7 Minuten lang in der Entwicklerlösung, während Sie das mit CU AAV-Vektoren beladene Gel 2 Minuten lang inkubieren, um eine Signalsättigung zu vermeiden.
    HINWEIS: CU AAV-Vektorpräparate enthalten im Vergleich zu CsCl AAV-Vektoren einen höheren Anteil an Proteinverunreinigungen. Daher wurden Gele, die mit CsCl AAV- und CU AAV-Vektoren beladen waren, nach dem Gleiten des Gels getrennt und separat silbergefärbt, um eine Signalsättigung aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Färbemethode zu verhindern.

5. Identifizierung von AAV VP Proteinen in CU AAV Vektorpräparaten mittels Western Blot

  1. 1 x 109 vg CU AAV Vektorpräparate mit 6x Laemmli Puffer in insgesamt 18 μL (Vektorpräparation: 6x Laemmli = 15:3) mischen und bei 100 °C für 5 min erhitzen.
  2. Laden Sie die wärmebehandelten AAV-Vektorpräparate auf ein 7,5%iges SDS-PAGE-Gel und elektrophoresieren Sie die Proben bei 20 mA unter Verwendung eines Tris-Glycin-SDS-Gel-Laufpuffers.
  3. Elektrotransfer von Proteinen im Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran, die in Methanol aktiviert wird, unter Verwendung eines halbtrockenen Transfersystems.
  4. Blockieren Sie die Membran mit 5% Magermilch in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) bei Raumtemperatur für 1 h.
  5. Die blockierte Membran wird über Nacht mit einer primären Antikörperlösung (polyklonaler Kaninchen-Anti-VP-Antikörper, verdünnt auf 1:1000 mit 5 % Magermilch in 1x TBST) bei 4 °C inkubiert.
  6. Waschen Sie die Membran mit 1x TBST für 10 min, 3 Mal.
  7. Inkubieren Sie die Membran mit einer Sekundärantikörperlösung (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, verdünnt auf 1:5000 mit 5% Magermilch in 1x TBST) bei Raumtemperatur für 1 h.
  8. Waschen Sie die Membran mit 1x TBST für 10 min, 3 Mal.
  9. Visualisieren Sie Signale auf der Membran mit einem Western-Blot-Bildgebungssystem.

6. Injektion des Nierenbeckens (RP)

  1. Präoperative Einrichtung und Anästhesie
    1. Messen Sie das Körpergewicht jeder Maus in einem Plastikbecherglas auf einer Gewichtswaage, die auf 0,1 g genau ist.
    2. Meloxicam (5 mg/kg) subkutan basierend auf dem Körpergewicht verabreichen, um eine präoperative Analgesie bereitzustellen.
    3. Verdünnen Sie die AAV-Vektorlösung auf eine Konzentration von 6,0 x 1012 vg/ml mit 5 % Sorbit in PBS und halten Sie sie auf Eis.
      HINWEIS: Bereiten Sie 40 μl mehr AAV-Lösung als das gesamte Injektionsvolumen (50 μl x Anzahl der zu injizierenden Mäuse) vor, um den Totraum in einer gasdichten Glasspritze und einem PE-10-Polyethylenröhrchen zu berücksichtigen.
    4. Biegen und brechen Sie von einer 30 G Nadel mit einem Nadelhalter nur die Nadelspitze ab.
    5. Verbinden Sie unter einem Stereomikroskop die 30-G-Nadelspitze, 15 cm PE-10-Röhrchen, eine 30-G-Nadel und eine gasdichte Glasspritze in dieser Reihenfolge von der Spitze (Abbildung 1D).
    6. Setzen Sie die angeschlossene gasdichte Glasspritze auf eine Infusionsspritzenpumpe.
    7. 90 μl der in Schritt 6.1.3 hergestellten AAV-Vektorlösung mit einer Infusionsspritzenpumpe in die gasdichte Glasspritze aspirieren.
    8. Stellen Sie den Infusionsmodus der Spritzenpumpe wie folgt ein: das Zielvolumen von 50 μl und eine Flussrate von 50 μl/min.
    9. Setzen Sie eine Maus in eine Kunststoffkammer, die mit 4 % Isofluran gefüllt ist, das in 100 % Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 1,5 bis 3,0 l/min abgegeben wird, bis sie vollständig anästhesiert ist.
    10. Platzieren Sie die Schnauze der Maus in einem Nasenkegel mit 1,5 % bis 3,0 % Isofluranfluss. Überwachen Sie die Narkosetiefe durch Zehenkneifreflex während des gesamten chirurgischen Eingriffs.
    11. Bedecken Sie die Augen mit einer Augensalbe mit einem Applikator mit Wattespitze, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
    12. Entfernen Sie das Fell von der linken Rückseite der Maus mit einem Enthaarungsmittel und einem Applikator mit Wattespitze.
      HINWEIS: Die Enthaarungscreme muss durch Spülen vollständig entfernt werden, um Hautreizungen zu vermeiden.
    13. Platzieren Sie die Maus in einer seitlichen Position auf einem Heizkissen mit geschlossenem Regelkreis, das mit einer Wärmetherapiepumpe verbunden ist, um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten (es muss nicht mit Klebeband gesichert werden).
    14. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit drei abwechselnden Anwendungen von Povidon-Jod und 70 % Ethanol mit einem Applikator mit Wattespitze in kreisenden Bewegungen, beginnend an der Inzisionsstelle.
    15. Decken Sie die Maus mit einem sterilen OP-Tuch ab.
  2. RP-Injektion in die linke Niere
    1. Kneifen Sie die Haut mit einer Gewebszange zusammen und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ca. 1 cm in die Hautschicht in Höhe des Kostenübertebrawinkels an der Stelle der linken Niere.
    2. Nachdem Sie einen Hautschnitt gemacht haben, schneiden Sie die Muskelschicht auf der gleichen Länge ein.
      HINWEIS: Wenn die Schnittlänge zu kurz ist, kann die Niere nicht freigelegt werden, und stattdessen kann die Milz, die kleiner ist, versehentlich freigelegt werden. Ist die Schnittlänge hingegen zu lang, wird die Niere durch den Schnitt selbst nicht an Ort und Stelle gehalten und rutscht durch den Schnitt immer wieder in den Bauch zurück.
    3. Drücken Sie mit den Fingern sanft auf den Bauch, ohne die Niere direkt zu berühren, so dass die Niere durch die Inzisionsstelle freigelegt wird (Abbildung 1A).
    4. Entfernen Sie das umliegende Fett minimal, so dass das Nierenbecken als kleine weiße Fläche sichtbar ist.
    5. Klemmen Sie zuerst den Harnleiter mit einem geraden Mikrogefäßclip und dann die Nierenarterie und die Nierenvene mit einem gebogenen Mikrogefäßclip zusammen.
      HINWEIS: Die Nierenfarbe färbt sich dunkelrot, was die erfolgreiche Blockade des Blutflusses in und aus der Niere bestätigt (Abbildung 1B).
    6. Führen Sie die 30-G-Nadel, die mit der Spritzenpumpe verbunden ist, mit einer gekrümmten Pinzette etwa 3 mm in die Beckenhöhle ein und beginnen Sie mit einer Injektion von 50 μl AAV-Vektorlösung mit einer Infusionsspritzenpumpe bei einer Flussrate von 50 μl/min über 1 min (Abbildung 1C).
    7. Halten Sie die Nadel und die Klemme 5 Minuten lang, um die Exposition der injizierten Niere gegenüber dem AAV-Vektor zu erhöhen.
      HINWEIS: Die angemessene Verweildauer kann variieren und hängt von den AAV-Kapsiden ab. Es hat sich gezeigt, dass eine Verweilzeit von 5 min für eine Transduktion mit AAV-KP1 oder AAV-KP3 Vektor ausreichend ist.
    8. Sobald die 5-minütige Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Klammern.
      HINWEIS: Die Nierenfarbe ändert sich sofort von dunkelrot zu blutrot, was die Wiederherstellung des Blutflusses in der Niere bestätigt.
    9. Ziehen Sie die Injektionsnadel vorsichtig und langsam zurück und platzieren Sie gleichzeitig einen Applikator mit Wattespitze mit Druck über die Injektionsstelle. Stellen Sie sicher, dass keine Blutungen aus der Injektionsstelle vorhanden sind. Das Auftragen eines hämostatischen Pflasters ist nicht erforderlich.
    10. Setzen Sie die Niere vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein.
    11. Vernähen Sie die Muskelschicht mit einem resorbierbaren Nahtmaterial von 6-0 und die Haut mit einem monofilen Nahtmaterial von 5-0.
    12. Verabreichen Sie 1 ml Kochsalzlösung subkutan in den Rücken von Mäusen zur Unterstützung der Flüssigkeit.
    13. Ersetzen Sie die gebrauchte 30-G-Nadelspitze durch eine neu vorbereitete, entsorgen Sie die gebrauchte 30-G-Nadel gemäß den Richtlinien der Institution für die Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle und laden Sie 50 μl der AAV-Vektorlösung mit einer Infusionsspritzenpumpe zur Verabreichung an die nächste Maus.
    14. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.12 bis 6.2.13 für alle Mäuse in der Gruppe, mit Ausnahme der letzten, für die Schritt 6.2.13 nicht erforderlich ist.
    15. Entsorgen Sie nach Abschluss aller geplanten Injektionen die kontaminierten Nadeln und Polyethylenröhrchen gemäß den Richtlinien der Institution für die Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
  3. Postoperative Überwachung und Pflege
    1. Verabreichen Sie Meloxicam (5 mg/kg) subkutan in den Rücken von Mäusen zur postoperativen Analgesie 24 h und 48 h nach der RP-Injektion.
    2. Verabreichen Sie 24 Stunden nach der RP-Injektion 1 ml Kochsalzlösung subkutan in den Rücken von Mäusen zur Flüssigkeitsunterstützung.
    3. Überwachen Sie das Körpergewicht und das allgemeine Erscheinungsbild der injizierten Mäuse täglich für 1 Woche postoperativ. Wenn ein Körpergewichtsverlust von 10 % auftritt, verabreichen Sie Mäusen eine Woche lang dreimal pro Woche 1 ml Kochsalzlösung subkutan in den Rücken. Wenn keine Besserung beobachtet wird, werden betroffene Mäuse eingeschläfert.

7. Gewebeentnahme und Kryosektion

  1. Vorbereitung der Fixierungs- und Kryoproduktionslösung.
    1. 0,2 M Phosphatpuffer (insgesamt 1 L)
      1. 800 ml Reinstwasser in einem 1-Liter-Becherglas zubereiten.
      2. Der Lösung werden 6,4 g monobasisches Natriumphosphat (NaH2PO4) und 21,8 g zweibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4) zugesetzt.
      3. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure auf 7,4 ein.
      4. Mit Reinstwasser bis zu 1 l auffüllen.
      5. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
    2. 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung (insgesamt 40 ml)
      1. Mischen Sie 10 ml 16 % PFA, 20 ml 0,2 m Phosphatpuffer, der in Schritt 7.1.1 hergestellt wurde, und 10 ml Reinstwasser.
      2. Aliquotieren Sie 10 mL in ein 15 mL Polypropylen-Röhrchen.
        HINWEIS: Stellen Sie kurz vor der Verwendung eine 4%ige PFA-Lösung für die Perfusionsfixierung her.
    3. 30% ige Saccharoselösung (insgesamt 40 ml).
      1. Mischen Sie 30 ml PBS mit 12 g Saccharose.
      2. Nach vollständigem Auflösen mit PBS auf 40 mL füllen.
  2. Perfusionsfixierung und Gewebeentnahme.
    ACHTUNG: Die Perfusionsfixierung sollte in einem Abzug durchgeführt werden, da 4%ige PFA-Lösung beim Einatmen eine starke schädliche Chemikalie ist.
    1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran, bringen Sie sie in Rückenlage und bestätigen Sie die völlige Abwesenheit von Reaktionsfähigkeit, indem Sie die Extremitäten vorsichtig zusammendrücken.
    2. Sobald die Maus betäubt ist, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt vom Schwanzbauch zum Xiphoid. Machen Sie dann zwei seitliche Schnitte entlang beider Seiten des Brustbeins und ziehen Sie die Brustwand nach vorne zurück, um das Herz und die großen Gefäße freizulegen.
    3. Öffnen Sie den rechten Vorhof durch eine scharfe Dissektion, um das Kreislaufsystem zu dekomprimieren. Führen Sie eine 25-G-Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel ein und infundieren Sie 50 ml PBS mit einer Geschwindigkeit von ca. 10 ml/min, wobei Sie den Fluss in Richtung der aufsteigenden Aorta richten.
      HINWEIS: Das Exsanguinieren ist wichtig, um qualitativ hochwertige Immunfluoreszenzbilder (IF) zu erhalten, da Blut eine Autofluoreszenz aufweist. Um eine vollständige Entfernung des Blutes zu gewährleisten, wurden in dieser Studie 50 ml PBS verwendet, obwohl üblicherweise 20-30 ml verwendet werden.
    4. 20 ml 4%ige PFA-Lösung, die in Schritt 7.1.2 hergestellt wurde, werden mit der gleichen Geschwindigkeit infundiert, wobei darauf zu achten ist, dass während des Wechsels der Lösungen keine Luft zugeführt wird.
    5. Entnehmen Sie das Gewebe und bewahren Sie es über Nacht bei 4 °C in einem 15-ml-Polypropylenröhrchen auf, das mit 4%iger PFA-Lösung für die Nachfixierung gefüllt ist. Wenn fluoreszierendes Protein im gesammelten Gewebe exprimiert wird, decken Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um es vor Licht zu schützen.
  3. Kryoeinbettung
    1. Übertragen Sie das Gewebe in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen, das mit 30%iger Saccharoselösung gefüllt ist, die in Schritt 7.1.3 zur Kryoprotektion hergestellt wurde.
    2. Bei 4 °C halten, bis das Taschentuch vollständig auf den Boden der Röhrchen sinkt.
    3. Übertragen Sie das Gewebe mit einer Standardmusterzange in ein plastisches Kryomold.
    4. Platzieren Sie die OCT-Verbindung auf dem Gewebe und stellen Sie sicher, dass das Gewebe korrekt ausgerichtet und bündig mit dem Boden des Kryomolds abschließt.
    5. Füllen Sie die Oberseite mit OCT-Masse. Entfernen Sie alle Blasen mit einer Pipettenspitze.
    6. Legen Sie das Kryomold aus Kunststoff in ein kryogenes Bad, das 2-Methylbutan enthält und mit zerstoßenem Trockeneis in einem Eiskübel gekühlt wird, bis die OCT-Verbindung vollständig gefroren ist (die OCT-Verbindung wird weiß).
    7. Lagern Sie die Gewebeblöcke bis zur Verwendung bei -80 °C.
  4. Kryosektion
    1. Übertragen Sie die gefrorenen Gewebeblöcke vor dem Schnitt auf ein Kryostat-Mikrotom bei -20 °C und lassen Sie die Temperatur der gefrorenen Gewebeblöcke ausgleichen.
    2. Schneiden Sie jeden gefrorenen Gewebeblock mit dem Kryostat-Mikrotom in eine gewünschte Dicke (typischerweise 5 μm). Legen Sie die Gewebeschnitte für die Immunfluoreszenzfärbung auf einen Objektträger mit Mikroskop.
    3. Die Sektionen können bei -80 °C für eine spätere Verwendung gelagert werden.

8. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Trocknen Sie gefrorene Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  2. Isolieren Sie den Schnitt mit einem Flüssigblocker und trocknen Sie ihn 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Rehydrieren Sie die Schnitte mit 150 μl PBS für 10 min.
  4. Legen Sie die Objektträger auf eine ebene Fläche und geben Sie 150 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt mit PBS, pro Schnitt auf die Objektträger. Zum Blockieren 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. 150 μl Primärantikörperlösung (Anti-Wilms Tumor 1 (WT1)-Antikörper, verdünnt auf 1:100 mit 1 % BSA; Anti-Na-K-2Cl-Cotransporter 2 (NKCC2)-Antikörper, verdünnt auf 1:100 mit 1 % BSA; oder Anti-Aquaporin 2 (AQP2)-Antikörper, verdünnt auf 1:100 mit 1 % BSA) zugeben und über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
  6. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal 3 Mal bei Raumtemperatur mit PBS.
  7. 150 μl Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper Alexa Fluor 647, verdünnt auf 1:500 mit 1 % BSA) und Lotus-Tetragonolobus-Lektin (LTL)-fluorescein (verdünnt auf 1:200 mit 1 % BSA) zugeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Waschen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur.
  9. Legen Sie die Objektträger auf eine ebene Fläche und fügen Sie 150 μl Hoechst 33342 (verdünnt auf 1:10.000 mit PBS) für die Kernfärbung hinzu. 10 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
  10. Waschen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur.
  11. Montieren Sie die Objektträger mit 20 μL des Eindeckmediums und einem Deckglas. Bewahren Sie die Objektträger bis zur Bildgebung im Dunkeln bei 4 °C auf.

9. DNA-Extraktion aus Gewebe

  1. DNA-Extraktion aus Geweben mit einem kommerziell erhältlichen Kit (siehe Materialtabelle).
    1. Übertragen Sie das Gewebe in ein Keramikperlenröhrchen und fügen Sie 400 μl DNA-Extraktionspuffer hinzu (100 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1 % SDS und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 m/s für 20 s in 3 Zyklen.
    3. Bei 2.000 x g bei Raumtemperatur 2 min zentrifugieren.
    4. Sammeln Sie 200 μl des Überstands mit einer P200-Pipette und fügen Sie 10 μl Proteinase K-Lösung (Endkonzentration von 1 mg/ml) hinzu.
    5. 15 s vortexen und 1 h bei 55 °C inkubieren.
    6. Fügen Sie 200 μl Lysepuffer aus dem DNA-Extraktionskit hinzu.
    7. 15 s vortexen lassen und 15 min bei 55 °C inkubieren.
    8. Fügen Sie 250 μl 100%iges Ethanol hinzu.
    9. 15 s vortexen lassen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    10. Tragen Sie das Lysat auf die Spin-Säule der DNA-Extraktion auf.
    11. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min.
    12. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein. Fügen Sie 500 μl des ersten Waschpuffers aus dem DNA-Extraktionskit hinzu.
    13. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min.
    14. Setzen Sie die Schleudersäule in ein neues Auffangröhrchen ein. Fügen Sie 500 μl des zweiten Waschpuffers aus dem DNA-Extraktionskit hinzu.
    15. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min.
    16. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein. 500 μl 100%iges Ethanol hinzufügen.
    17. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min.
    18. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 20.000 x g bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt eine vollständige Trocknung der Spin-Säulenmembran sicher, da die Verschleppung von Ethanol in das Eluat nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigen kann.
    19. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Geben Sie 35 μl Elutionspuffer aus dem DNA-Extraktionskit in die Spin-Säule.
      HINWEIS: Das Volumen des zurückgewonnenen Eluats ist in der Regel etwa 5 μl geringer als das Volumen des Elutionspuffers, das ursprünglich auf die Säule aufgetragen wurde.
    20. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    21. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min.
    22. Messen Sie die DNA-Konzentration.
  2. Quantifizierung der Kopienzahl des Vektorgenoms durch quantitative PCR (qPCR)
    1. Die in Schritt 9.1 hergestellte extrahierte DNA wird auf eine Konzentration von 25 ng/μl mit molekularem Wasser verdünnt.
    2. Entwerfen Sie ein qPCR-Primerpaar für die Quantifizierung des Vektorgenoms (tdTomato wurde in dieser Studie verwendet) und ein qPCR-Primerpaar für das Maus-Referenzgen, das zur Quantifizierung der diploiden Genome in den extrahierten DNA-Proben verwendet wird (das Maus-Agouti-Gen wurde in dieser Studie verwendet).
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen lauten wie folgt:
      tdTomate vorne: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomate Rückseite: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      Maus nach vorne: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      Maus auf dem Rückwärtstrend: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Für eine 25-μl-qPCR-Reaktion werden 4 μl verdünnte DNA-Probe in Schritt 9.2.1 (insgesamt 100 ng DNA in einem 25-μl-Reaktionsgemisch), 12,5 μl 2x qPCR-Reaktionspuffer, 0,5 μl der in Schritt 9.2.2 hergestellten 20-μM-Vorwärts- und Rückwärtsprimen gemischt (Endkonzentration von 400 nM jedes Primers), und 7,5 μl Wasser in molekularer Qualität.
    4. Messen Sie viermal die DNA-Konzentration von Plasmidstandards für die qPCR und bestimmen Sie den Durchschnittswert der DNA-Konzentration.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden supercoiled circular pAAV-CAG-tdTomato-Plasmid und ein supercoiled circular Plasmid, das die PCR-Zielsequenz enthält, die vom Agouti-Gen der Maus abgeleitet ist, für die Quantifizierung bzw. Normalisierung des Vektorgenoms verwendet.
    5. Bereiten Sie eine Reihe von seriellen Verdünnungen von Plasmid-DNA-Standards im Verhältnis 1:10 vor, die einen dynamischen Bereich von 10bis 6 abdecken.
      HINWEIS: Jede Probe und jeder Standard sollte mindestens in zweifacher Ausfertigung analysiert werden.
    6. Die qPCR wird unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: ein erster Schritt der Wärmeaktivierung bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Glühen/Verlängern bei 60 °C für 30 s.
    7. Nach Abschluss der qPCR-Reaktion und Erhalt der doppelsträngigen (ds) Kopienzahlwerte von Vektorgenomen und dem Maus-Referenzgen in den Proben, bestimmen Sie die Kopienzahlen des ds-Vektorgenoms pro diploidem genomischem Äquivalent (ds-vg/dge), indem Sie die Kopienzahlen des ds-Vektorgenoms auf die Referenzgenkopienzahl in jeder Probe normalisieren, basierend auf Standardkurven, die aus bekannten Konzentrationen sowohl des Vektorgenoms als auch des Referenzgens generiert wurden.
      HINWEIS: Ds-vg/dge kann auf der Grundlage der folgenden Näherung bestimmt werden, dass 100 ng genomische DNA der Maus 16.900 diploide (2N) Mauszellen darstellen (d. h. 5,92 pg DNA pro diploider Mauszelle).

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Ergebnisse

Eine kürzlich durchgeführte Studie hat eine kleine Untergruppe von AAV-Kapsiden identifiziert, die im Vergleich zu AAV9 nach RP-Injektion eine bemerkenswerte Verbesserung der renalen Transduktion aufweist38. Die identifizierte Untergruppe umfasst AAV-KP3, ein chimäres AAV-Kapsid, das durch DNA-Shufflingerzeugt wird 41. Daher wurde in dieser Studie AAV-KP3 für die RP-Injektion ausgewählt, zusammen mit AAV9 als Benchmark. Der AAV9-CAG-tdTomat...

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Diskussion

In diesem Bericht wird die langsame retrograde RP-Injektion von AAV-Vektoren als lokale Verabreichungsmethode für die Genabgabe an die Mausniere detailliert beschrieben. Ein kritischer Schritt für die sichere Durchführung der RP-Injektion ist die Anpassung der Injektionsrate von AAV-Vektoren, um eine Parenchymschädigung der injizierten Nieren zu vermeiden. In einem früheren Bericht über die hydrodynamische Injektion des Nierenbeckens wurden 100 μl Plasmid-DNA-Lösung innerhalb von nur 3 s...

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Offenlegungen

H.N. erhält eine Lizenzgebühr für AAV-bezogene Technologien, die von Takara Bio Inc. und Capsigen Inc. lizenziert wurden, fungiert als Berater für Biotech-Unternehmen, ist Mitbegründer von Capsigen Inc. und hält Aktien von Capsigen Inc. und Sphere Gene Therapeutics.

Danksagungen

Wir danken Guangping Gao und James M. Wilson für die Bereitstellung des Helferplasmids von AAV9 und Katja Pekrun und Mark A. Kay für das Helferplasmid von AAV-KP3.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 µm PVDF SpritzfilterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Fisher Scientific05-408-129
15 ml Polypropylen-RöhrchenCorning352097
16% Paraformaldehyd (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 ml ZentrifugenflascheFisher Scientific055641S24
2F SilikonschlauchSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G SchmetterlingsnadelMedex Supply26708
2-MethylbutanMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR-ReaktionspufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G NadelBecton-Dickinson & Co305106
50 ml Polypropylen-RöhrchenCorning430291
5-0 MonofilamentnahtEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbierbare NahtEthiconJ489G
7,5% Mini-PROTEAN TGX Fertiggele
Protein-Gele, 10-Well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 ml RöhrchenMillipore SigmaUFC910024
Anti-Aquaporin 2 (AQP2) AntikörperAbcamab199975Ein Marker für Sammelrohrzellen
Anti-Na-K-2Cl-Cotransporter 2
(NKCC2) Antikörper		StressMarq BiosciencesSPC-401Ein Marker für Zellen des aufsteigenden Dickenteils
Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 647
Antikörper		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms-Tumor 1 (WT1) AntikörperAbcamab89901Ein Marker für Podozyten
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylen, 29,9 ml		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovines Serumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Zentrifugales UltrafiltrationsröhrchenMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 ml
KeramikperlenröhrchenFisher Scientific15-340-154
CäsiumchloridSigma-AldrichC3032-1KG
KlammerzangeFine Science Tools00071-14
Geschlossene WärmematteStryker Medical8002-062-012
Baumwollspitzen-ApplikatorPuritan806-WC
DeckglasFisher Scientific12-541B
KryostatmikrotomTanner ScientificTN50
Gebogene ZangeFine Science Tools11052-10
Mikrogefäßklemme gekrümmter TypKleinert-Kutz65145Klammer für die Nierenarterie und die Nierenvene
DialysekassetteFisher ScientificPIA52976
DNA-ExtraktionskitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modifiziertes Eagle-Medium-
mit hohem Glukosegehalt		Corning15-013-CVDMEM-hoch Glucose (4,5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fötales Kalbsserum (FBS)VWR89510-186
Gasdichte Spritze aus GlasHamilton1710 TLL
GlutaraldehydlösungSigma-AldrichG6257
WärmetherapiepumpeKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenisatorFisher Scientific15-340-163
Menschliches embryonales Nieren- (HEK) 293
Zellen		Agilent240073
EiswanneFisher Scientific07-210-104
InfusionsspritzenpumpeHarvard Apparatus70-4507
IsofluranPiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-GlutaminFisher Scientific25030-081
Liquid Blocker PenTed Pella22309
Lotus tetragonolobus Lektin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2Ein Marker für proximale Tubuli
Magnesiumchlorid (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgetikum
Mikroskop-ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
MontiermittelSouthernBiotech0100-01
NadelhalterFine Science Tools12501-13
OCT-CompoundSakura Finetek4583
Ophthalmische SalbeBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 Polyethylen-RöhrchenBD427401Innendurchmesser: 0,28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140

Referenzen

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