Laminopathie-Störungen führen oft zu Veränderungen der Kernhülle, die zu Kernblasen und Leckagen führen können. Diese Studie stellt eine Immunfluoreszenzmethode vor, um die Kernlamina zusammen mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) sichtbar zu machen, die ein Mittel zur Beurteilung der Kernstruktur und -integrität in Säugetierzellen bietet.
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Methodenartikel
Nachweis von nukleärem Bläschen und DNA-Leckage in Säugetierzellen durch Immunfluoreszenz
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kernlamina ist ein Netzwerk von Filamenten, das der Kernmembran zugrunde liegt und aus Laminen und laminassoziierten Proteinen besteht. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Kernarchitektur, der Positionierung der Kernporen, der Regulation der Genexpression, der Chromatinorganisation, der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur. Mutationen in Genen, die an der Expression oder posttranslationalen Verarbeitung von Laminproteinen beteiligt sind, führen zu genetischen Störungen, die als Laminopathien bekannt sind. Insbesondere können Mutationen in den Genen LMNA oder ZMPSTE24 zur Akkumulation unvollständig prozessierter Formen von Lamin A führen, die Farnesyl- und Methylgruppen enthalten, die in vollständig prozessiertem Lamin A fehlen. Diese unvollständig prozessierten Lamin-A-Proteine lokalisieren sich in der inneren Kernmembran statt in der Kernlamina, wo sich reifes Lamin A befindet. Falsch lokalisierte Laminproteine stören die Kernfunktion und -struktur tiefgreifend, was oft zu Kernblebbing führt. In schweren Fällen kann es zu einer Kernruptur kommen, die zu einem Verlust der Kompartimentierung und einem Austritt von genomischer DNA in das Zytosol führt. Eine abnormale Kernstruktur und ein Kompartimentierungsverlust können durch indirekte Immunfluoreszenz (IF) auf fixierten Zellen identifiziert werden. Diese Studie skizziert eine solche Methode, bei der spezifische Antikörper gegen ein Lamin-Protein und doppelsträngige DNA (dsDNA) verwendet werden, um gleichzeitig die Kernhülle und die DNA sichtbar zu machen. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle Beurteilung der nuklearen strukturellen Integrität und des möglichen Austretens von Kern-DNA in das Zytosol.
Einleitung
Die Kernlamina ist ein Netzwerk von Filamenten, das der Kernmembran zugrunde liegt und aus Proteinen besteht, die als Lamine bezeichnet werden. Die Kernlamina spielt eine wesentliche Rolle in der Kernarchitektur, der Positionierung der Kernporen, der Regulation der Genexpression, der Chromatinorganisation, der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur 1,2,3. Mutationen in Genen, die eine Rolle bei der Expression der Laminproteine spielen, führen zu genetischen Störungen, die als Laminopathien bezeichnetwerden 3.
Die restriktive Dermopathie (RD) ist eine schwere laminopathische Erkrankung, die hauptsächlich durch compound-heterozygote Mutationen verursacht wird, die vorzeitige Terminationscodons im ZMPSTE24 Gen4 erzeugen, was zu einem Fehlen der Metalloprotease ZMPSTE24 führt. Diese Laminopathie ist gekennzeichnet durch intrauterine Wachstumsverzögerung, straffe, starre Haut, kleinen Mund, dünnes Haar und Knochenmineralisationsdefekte1. RD-Patienten leben aufgrund der Lungeninsuffizienz1 in der Regel nicht über die erste Lebenswoche hinaus. Zwei weitere Laminopathie-Erkrankungen, die als atypisches Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom (AT-HGPS) und mandibuloakakrale Dysplasie Typ B (MAD-B) bekannt sind, beinhalten eine verminderte ZMPSTE24 Expression und sind mit einer verkürzten Lebensdauer verbunden und weisen Ähnlichkeiten mit vorzeitigen Alterungsstörungen auf5. Die ZMPSTE24 Protease, die bei diesen Laminopathien betroffen ist, ist für die posttranslationale Modifikation von Lamin A, einer kritischen Komponente der Kernlamina, von entscheidender Bedeutung. ZMPSTE24 Mangel führt zur Akkumulation einer unvollständig verarbeiteten farnesylierten Form von Lamin A, die als Prelamin A2 bekannt ist.
Abbildung 1: Lamin A-Verarbeitung in normaler vs. RD-Zellen. Lamin A-Prozessierungsweg in normalen Zellen (links) und veränderte Lamin-A-Prozessierung in RD- oder ZMPSTE-defizienten Zellen (rechts). Farnesyl (Fa) und Methyl (Me) Gruppen sind angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, wird bei normaler Lamin-A-Verarbeitung eine Farnesylgruppe (Lipid) an einen Cysteinrest in der Nähe des C-Terminus gebunden, gefolgt von einer proteolytischen Spaltung von drei C-terminalen Aminosäuren 3,6. Der Cysteinrest wird dann methyliert. Diese beiden Modifikationen ermöglichen es, Prelamin A auf die innere Kernmembran2 zu richten. ZMPSTE24 führt dann eine Spaltungsreaktion durch, bei der die letzten 15 C-terminalen Aminosäuren zusammen mit der Farnesyl- und der Methylgruppe entfernt werden, um reifes Lamin A-Protein zu erzeugen, das an die Kernlamina 6,7,8 abgegeben wird. Bei RD, AT-HGPS und MAD-B erfolgt der letzte Schritt der Verarbeitung nicht effektiv, da die ZMPSTE24 Metalloproteinase fehlt oder nicht voll funktionsfähigist 8,9. Dies führt zur Akkumulation von Prelamin A, das dauerhaft farnesyliert und methyliertbleibt 9. Diese letzteren Gruppen führen dazu, dass das Prälamin A an der inneren Kernmembran haftet, anstatt sich an der Kernlamina zu lokalisieren, wo sich das reife Lamin A letztendlich befinden sollte, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Somit hat der ZMPSTE-Mangel tiefgreifende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Kernfunktionen, zusammen mit der Kernstruktur 10,11,12,13,14,15. Diese Veränderungen der Kernstruktur können Kernblasen und sogar Kernbrüche umfassen, die zum Austreten von DNA in das Zytosol sowie zum Eindringen von Zytosol in den Zellkern führen können. Fehlerhaft geformte Zellkerne sind in der Tat ein Kennzeichen von Laminopathie-Erkrankungen, zusammen mit zahlreichen anderen Phänotypen, die durch eine fehlerhafte Prälamin-A-Verarbeitung verursacht werden16,17. Defekte in der Kernlamina führen zu einer Vielzahl von nachteiligen Auswirkungen, einschließlich der Fehllokalisierung der Qualitätskontrolle von Kernproteinen und DNA-Reparaturproteinen im Nukleoplasma, was wiederum zu zahlreichen Defekten in der Kernfunktion führt18. Es ist wichtig, eine einfache Technik zu haben, die helfen kann, diese Kennzeichen von Laminopathien zu identifizieren und zu überwachen, um die Forschung zur Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Verbesserung der Laminopathie-Phänotypen zu erleichtern. Bei Mäusen mit Laminopathien konnte gezeigt werden, dass die Eliminierung des nukleären Blabbings mit der generalisierten Eliminierung der Laminopathie-Phänotypen korreliert16. Eine Technik, die die Überwachung der nuklearen Integrität in menschlichen Zellen ermöglicht, könnte die Erforschung potenzieller Behandlungen zur Eliminierung oder signifikanten Verbesserung von Krankheitsphänotypen verbessern.
Die indirekte Immunfluoreszenz (IF) ist eine empfindliche und weit verbreitete Technik, bei der sowohl ein primärer unmarkierter Antikörper als auch ein Fluorophor-markierter Sekundärantikörper verwendet werden, der den primären Antikörper erkennt, um ein Ziel von Interesse zu erkennen19. IF-Methoden können ein leistungsfähiges Mittel zur Visualisierung spezifischer intrazellulärer Komponenten und Strukturen darstellen. Es ist auch möglich, dass mehr als ein sekundäres Antikörpermolekül mit dem primären Antikörper interagiert, was zu einer Verstärkung des Signalsführt 19. Die indirekte IF ist eine vielseitige Technik, die auch den Nachweis mehrerer Primärantikörper mit einer relativ kleinen Anzahl von Sekundärantikörpern ermöglicht, da Sekundärantikörper gegen die Fc-Domäne des Primärantikörpers erhoben werden, die in Spezies19 konserviert ist.
Dieser Artikel beschreibt eine indirekte (IF) Methode zur Beurteilung von Kernblebbing und DNA-Leckage in Zellen mit ZMPSTE24-Mangel, wobei Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) und Lamin B1 zum Nachweis der DNA bzw. der Kernlamina verwendet werden. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurde das Verfahren auf eine HeLa-Zelllinie mit Knocked-out-ZMPSTE24-Expression sowie auf eine HeLa-Zelllinie, die ZMPSTE24 exprimiert, angewendet und die Ergebnisse für die beiden Zelllinien verglichen.
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Protokoll
Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Materialien
- Autoklavieren Sie mindestens zehn 22 mm x 22 mm große quadratische Glasdeckgläser und Pinzetten, bevor Sie Zellen auf die Deckgläser aufpolieren.
2. Vorbereitung der Lösungen
- Supplementierte Medien: Bereiten Sie 500 ml Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin vor.
- Antikörperverdünnungspuffer (ADB): 2 g Rinderserumalbumin (BSA) und 1 g Fischgelatine in 80 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen. Mit PBS auf 100 ml bringen, sobald BSA und Fischgelatine aufgelöst sind.
- 1x PBS-Tween (PBS-T): Bereiten Sie 500 mL PBS und 0,5 mL Tween vor. In ein 37 °C heißes Wasserbad stellen, bis sich der Tween leicht in die Lösung mischen lässt.
3. Züchten der gewünschten Zellen
HINWEIS: HeLa-Zellen wurden in diesem Protokoll in einem T75-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet.
- Sprühen Sie sechs Deckgläser mit 70 % Ethanol ein und lassen Sie sie auf einem fusselfreien Tuch an der Luft trocknen. Legen Sie Deckgläser mit einer Pinzette in eine sterile 6-Well-Platte, ein Deckglas pro Well.
- Geben Sie 2 ml supplementiertes DMEM in jede Vertiefung in der 6-Well-Platte.
- Das Medium wird aus den Zellen aspiriert und die Zellen werden gewaschen, indem 15 ml PBS in den Kolben gegeben und vorsichtig geschwenkt werden. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA (Trypsin) hinzu.
- Die Zellen werden mit Trypsin bestreicht und der Kolben für 2 Minuten wieder in einen 37 °C und 5 % CO2 -befeuchteten Inkubator gestellt, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können.
- Geben Sie 8 ml supplementiertes DMEM in den Kolben, um die trypsinisierten Zellen zu sammeln. Pipettieren Sie ein paar Mal auf und ab, um die verklumpenden Zellen zu trennen. Die Zellsuspension wird im Kolben aufgefangen und in ein 15-ml-Polystyrolröhrchen gegeben.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Geben Sie 500.000 Zellen Tropfen für Tropfen direkt auf jedes der Deckgläser in der 6-Well-Platte. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator wachsen.
4. Zellfixierung und Permeabilisierung
- Bereiten Sie die 4%ige Formaldehydlösung vor Gebrauch frisch vor: Geben Sie 2 ml 37,5%ige Formaldehydlösung in 18 ml PBS. Gründlich mischen.
- Bereiten Sie die Permeabilisierungslösung vor Gebrauch frisch vor: Geben Sie 100 μl Triton-X in 20 ml PBS. In einem 37 °C warmen Wasserbad einige Minuten inkubieren lassen, bis sich der Triton-X in der Lösung aufgelöst hat. Gründlich mischen.
- Saugen Sie das Medium in den Vertiefungen der Platte an. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL PBS. Saugen Sie alle PBS aus den Vertiefungen an.
- Geben Sie 2 ml 4%ige Formaldehydlösung in jede Vertiefung. 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ziehen lassen. Aspirieren Sie 4% Formaldehyd vollständig aus den Vertiefungen.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 2 mL PBS. Entfernen Sie PBS nach jedem Waschen vollständig aus den Vertiefungen.
- Geben Sie 2 ml Permeabilisierungslösung in jede Vertiefung. Lassen Sie es 10 Minuten bei RT einwirken. Aspirieren Sie die Permeabilisierungslösung vollständig.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie PBS nach den ersten beiden Wäschen vollständig und belassen Sie das PBS nach dem dritten Waschen in den Vertiefungen.
HINWEIS: Die Zellen können in der letzten PBS-Wäsche einige Wochen nach diesem Schritt bei 4 °C gelagert werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Platte mit Paraffinfilm versiegelt ist, um eine Verdunstung der Flüssigkeit zu vermeiden. Wenn der Vorgang fortgesetzt werden kann, kann dieser Schritt übersprungen werden.
5. Immunfluoreszenz-Färbung
- Entfernen Sie alle PBS aus den Vertiefungen. Blockieren Sie die Zellen, indem Sie 2 mL ADB in jede Vertiefung geben und bei RT inkubieren, wobei Sie 30 Minuten lang schaukeln.
- Gegen Ende der 30-minütigen Blockierungszeit mischen Sie die primäre Antikörperverdünnung in ADB (1:1.000 Verdünnung für Lamin B1- und dsDNA-Antikörper, Tabelle 1). Für jedes Deckglas werden 75 μl benötigt, daher sollten 600 μl ADB, 0,6 μl Lamin B-Primärantikörper und 0,6 μl dsDNA-Antikörper für sechs Deckgläser gemischt werden. Gründlich vortexen.
- Entfernen Sie ADB aus den Vertiefungen. Kleben Sie auf einer ebenen Fläche ein Stück Paraffinfolie fest, das groß genug ist, um alle Deckgläser abzulegen, die verarbeitet werden.
- Geben Sie für jedes Deckglas 75 μl Primärantikörperverdünnung auf den Paraffinfilm, um sicherzustellen, dass keine Blasen in der ADB pipettiert werden. Legen Sie dann die Deckgläser mit der Zellseite nach unten mit einer Pinzette auf das Tröpfchen ADB.
- Decken Sie die Inkubationsgläser mit dem Deckel der Well-Platte ab und lassen Sie sie 1 h bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette von der Paraffinfolie und legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben zurück in die 6-Well-Platte.
- Waschen Sie die Deckgläser 3 Mal mit 2 mL PBS-T und wiegen Sie sie jedes Mal 3-5 Minuten lang. Entfernen Sie nach jedem Waschen alle PBS-T aus den Vertiefungen.
- Bereiten Sie während der letzten Wäsche die Sekundärantikörperverdünnung vor (1:1.000 für beide jeweiligen Sekundärantikörper, Tabelle 1). Für jedes Deckglas werden 75 μl benötigt, daher sollten 600 μl ADB und 0,6 μl der beiden sekundären Alexa Fluor-markierten Antikörper für sechs Deckgläser gemischt werden. Gründlich vortexen. Decken Sie die Verdünnung des Sekundärantikörpers so weit wie möglich vor Licht ab.
| Antikörper | Quelle | Firma | Referenz | ||
| dsDNA-Marker-Antikörper (HYB331-01) | Maus monoklonal | Santa Cruz | SC-58749 | ||
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 488 | Ziege | ThermoFisher | Nr. A32723 | ||
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 405 | Ziege | Invitrogen | Nr. A31553 | ||
| Lamin B1 Polyklonaler Antikörper | Kaninchen | Proteintech-Technologie | Artikel-Nr.: 12987-1-AP | ||
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 | Ziege | Invitrogen | Nr. A11037 | ||
Tabelle 1: Antikörper. Liste aller Antikörper, die in diesem Protokoll verwendet werden.
- Entfernen Sie alle PBS-T aus der letzten Wäsche. Inkubieren Sie die Deckgläser in der sekundären Antikörperverdünnung auf Paraffinfilm, wie in Schritt 5, für 30 min bei RT. In diesem Schritt und in allen weiteren Schritten vor Licht schützen. Ein kleiner Kasten kann verwendet werden, um das Licht abzuschirmen. Stellen Sie sicher, dass Sie bei Bedarf schnell arbeiten, um Lösungen hinzuzufügen oder aus den Vertiefungen zu entfernen.
- Entfernen Sie Deckgläser mit einer Pinzette von der Paraffinfolie und legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben wieder in die 6-Well-Platte.
- Waschen Sie die Deckgläser 3 Mal mit 2 mL PBS-T. Entfernen Sie nach jedem Waschen alle PBS-T aus den Vertiefungen.
- Dehydrieren Sie die Objektträger mit einer Ethanolserie (70%, 90%, 100%). Beginnen Sie damit, 2 ml 70%iges Ethanol in jede Vertiefung zu geben. Lassen Sie es 1-2 Minuten ruhen und entfernen Sie das gesamte Ethanol aus den Vertiefungen. Wiederholen Sie den Vorgang mit den restlichen Ethanolanteilen.
- Entfernen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette aus den Vertiefungen und lassen Sie sie auf einem fusselfreien Tuch lichtgeschützt an der Luft trocknen.
- Montieren Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf Glasobjektträger mit 20 μl Eindeckmedium pro Deckglas. Über Nacht lichtgeschützt trocknen lassen.
6. Bilderfassung
- Beschichten Sie die Ränder von Deckgläsern vor der Bildgebung mit einer dünnen Schicht Klarlack (jede Marke oder Art reicht aus). An der Luft lichtgeschützt trocknen lassen.
HINWEIS: Die Anweisungen für die Verwendung eines Mikroskops zum Abbilden variieren je nach verwendetem Mikroskop. Die Auflösung der Kamera am hier verwendeten Mikroskop beträgt 1280 x 960 Pixel. Eine ähnliche oder bessere Auflösung ist ausreichend. - Bevor ein Objektträger auf den Mikroskoptisch gelegt wird, müssen die Einstellungen zum Speichern von Dateien angepasst werden. Schalten Sie das Mikroskop ein und schließen Sie ein USB-Laufwerk an. Passen Sie die Speichereinstellungen in den Mikroskopeinstellungen an und stellen Sie sicher, dass alle Kanäle (GFP und RFP) separat gespeichert werden und dass die Bilder an den richtigen Ort auf dem USB-Laufwerk gesendet werden.
HINWEIS: Erstellen Sie einen Ordner auf dem USB-Laufwerk und geben Sie jedem Deckglas einen eigenen Namen, damit Sie später darauf zurückgreifen können. - Sprühen Sie vor der Bildgebung ein fusselfreies Tuch mit 70 % Ethanol und reinigen Sie die Rückseite der Objektträger vorsichtig. Reinigen Sie die Vorderseite der Objektträger vorsichtig und stellen Sie sicher, dass nur ein sehr geringer Druck ausgeübt wird.
- Legen Sie einen sauberen Objektträger mit den Deckgläsern nach unten auf das Mikroskop. Mit der Lichtschutzbox abdecken.
- Verwenden Sie eine 40-fach-Objektivlinse, um den entsprechenden Kanal (RFP für den hier verwendeten Lamin-B1-Antikörper) zu lokalisieren, um die Zellkerne auf dem Mikroskopbildschirm zu lokalisieren. Stellen Sie die Lichtintensität zu Beginn auf etwa 50 % ein.
- Um nach übersättigten Bereichen zu suchen, wählen Sie die Option Farbe aus und stellen Sie sicher, dass keine Bereiche auf dem Deckglas ein rotes Signal in der Schwarz-Weiß-Einstellung haben. Wenn viel rotes Signal vorhanden ist, verringern Sie die Lichtintensität, bis das minimale rote Signal angezeigt wird.
HINWEIS: Ein rotes Signal zeigt eine Übersättigung an. Wenn die Kerne kaum sichtbar erscheinen, erhöhen Sie die Intensität in Schritten von 10 %, bis eine angemessene Intensität ohne Übersättigung erreicht ist. - Überprüfen Sie alle anderen Deckgläser mit der gleichen Intensität, um sicherzustellen, dass sie nicht übersättigt sind. Prüfen Sie alle Deckgläser mit dem anderen Kanal nach dem gleichen Verfahren wie oben (GFP für den hier verwendeten dsDNA-Antikörper).
- Zeichnen Sie die Lichtintensität für jeden Kanal auf. Stellen Sie sicher, dass alle Lichtintensitäten für jeden Kanal während des gesamten Bildgebungsprozesses konstant bleiben.
- Bilden Sie jedes Deckglas einzeln ab. Beginnen Sie mit dem ersten Kanal, fokussieren Sie die Kerne und nehmen Sie das Bild auf.
- Wechseln Sie vorsichtig die Kanäle und bringen Sie die Zellen wieder in den Fokus. Wenn es fokussiert ist, nehmen Sie das Bild auf.
- Nachdem Sie Bilder in den erforderlichen Kanälen (GFP und RFP) aufgenommen haben, wählen Sie Überlagerung , um das zusammengeführte Bild zu beobachten und sicherzustellen, dass sich die Folie bei der Aufnahme des Bildes nicht bewegt hat. Wenn sich die Kanäle nicht überlappen, wiederholen Sie den erforderlichen Kanal, bis die Bilder ausgerichtet sind.
- Speichern Sie das Bild, indem Sie auf das Flash-Laufwerk-Symbol klicken. Bewegen Sie sich an eine andere Stelle auf dem Deckglas, um die Bildgebung fortzusetzen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jedes Mal ein anderer Bereich des Deckglases abgebildet wird, um zu vermeiden, dass derselbe Bereich wiederholt erfasst wird. Es wird empfohlen, die Bildgebung in der oberen linken Ecke des Deckglases zu beginnen und in einem "S"-Muster zu bewegen, um eine vollständige Abdeckung ohne Duplikate zu gewährleisten.
7. Datenanalyse
- Die mit dieser Methode erhaltenen Daten sind visuell. Untersuchen Sie die Bilder auf Anzeichen von DNA-Lecks oder nuklearem Blubbing. Beispiele für Blubbing und Leckagen sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" aufgeführt.
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Ergebnisse
In dieser Arbeit wird eine IF-Methode zur Visualisierung der Kernlamina in Verbindung mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) vorgestellt. Sobald die IF durchgeführt wurde, können die aufgenommenen Bilder auf Anzeichen von nukleärem Blubbing und DNA-Leckagen untersucht werden.
Abbildung 2: Kernblebbing in HeLa CT u...
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Diskussion
Das vorgestellte Protokoll enthält mehrere kritische Schritte, von denen der wichtigste die Behandlung der fixierten Zellen mit primären und sekundären Antikörpern ist. Die Sicherstellung der Verwendung eines Primärantikörpers guter Qualität gegen das Zielmolekül von Interesse mit einem korrekten entsprechenden Sekundärantikörper mit Fluorophoren innerhalb des Bereichs des verwendeten Mikroskops führt zu optimalen Ergebnissen19. Die Qualität des Antikörpers kann d...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss des National Institute on Aging unterstützt, der der ASW R03AG064525 wurde. Wir danken Dr. Jason A. Stewart für die Hilfe bei der Technik-Betreuung und dem Hui Chen Labor für die Bereitstellung des verwendeten Mikroskops. Wir danken auch Fabio Martinon für die HeLa-Zelllinien, die in diesen Experimenten verwendet wurden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 22 mm quadratische Glasdeckgläser | Propper Manufacturing | Company M8710 | Jede Größe und Form kann verwendet werden, solange sie an einem Standard-Objektträger befestigt werden können. |
| 36,5 % Formaldehyd | Sigma Aldrich | F8775 | Fixierungsreagenz. |
| 75 cm 2 Kolben | Corning | 430725U | Für Zellkulturen. |
| Rinderserum Albinum (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | Antikörper-Verdünnungspuffer. |
| DMEM mit 1 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat | Corning | 10-014-CV | Für die Zellkultur. |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2701 | Zur Dehydrierung von Proben vor dem Einbetten, verdünnt auf mehrere Konzentrationen. |
| EVOS FL Digitales inverses Fluoreszenzmikroskop | Fisher Scientific | 12-563-460 | Bildgebung. |
| Fischgelatine | Sigma Aldrich | G7041 | Antikörper-Verdünnungspuffer. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Eindeckmedium zur Verhinderung von Photobleichung. |
| Parafilm (4 Zoll) | Fisher Scientific | 13-374-12 | Jede Größe kann ersetzt werden, solange die verwendeten Deckgläser passen. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15-140-122 | Für die Zellkultur. |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | N/A | N/A | Hergestellt und sterilisiert im Labor für Gewebekulturen und Lösungen. |
| Premium Fötales Rinderserum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Für die Zellkultur. |
| Superfrost Premium Objektträger | Fisher Scientific | 12-544-7 | Es können alle gängigen Objektträger verwendet werden. |
| Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten mit flachem Boden | Falcon | 353046 | Für die Zellkultur. |
| TritonX-100 | Thermofisher Scientific | A16046. AP | Zum Waschen. |
| Trypsin-EDTA (0,5%) | Gibco | 15-400-054 | Für Zellkulturen. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | 9005-64-5 | Reagenz für Zellpermeation. |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
