Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Verbesserte Methodik zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation in einem murinen Knochenmarkverletzungsmodell

1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/67727

⸱

7. Februar 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das murine Knochenmarkverletzungsmodell ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation. Dieses vereinfachte chirurgische Protokoll beschreibt das Verfahren der Knochenmarkablation zur nachgelagerten Beurteilung der Knochenneubildung und der zellulären Reaktionen nach einer Verletzung.

Zusammenfassung

Verletzungen des langen Knochens heilen entweder über endochondrale oder intramembranöse Knochenbildungswege. Im Gegensatz zum endochondralen Signalweg, der eine Knorpelschablone erfordert, beinhaltet der Prozess der intramembranösen Ossifikation die direkte Umwandlung von skelettalen Stamm- und Vorläuferzellen (SSPCs) in knochenbildende Osteoblasten. Es gibt nur begrenzte chirurgische Methoden, um diesen Prozess an Versuchsmäusen zu modellieren. In dieser Arbeit haben wir ein Knochenmarkverletzungsmodell in Mäusen verbessert, um die Untersuchung der Knochenreparatur durch intramembranöse Ossifikation zu erleichtern und postnatale Regulatoren der Osteogenese zu bewerten. Diese Methode ist hochgradig reproduzierbar und benutzerfreundlich und ermöglicht die zeitliche Beurteilung der Knochenneubildung in einem kurzen Zeitraum (3-7 Tage nach der Verletzung) mittels Mikrocomputertomographie (μCT) und Schnellschnitt-Histologie. Darüber hinaus können die Beiträge von SSPCs und reifen Osteoblasten mit einer Kombination aus fluoreszierenden Reportermäusen und diesem intramembranösen Knochenmarkverletzungsmodell leicht bewertet werden. Im klinischen Kontext ist die intramembranöse Knochenbildung relevant für die Heilung von Defekten kritischer Größe, stabilisierten Frakturen, kortikalen Defekten, Traumata aus Tumorresektionen und Gelenkersatz.

Einleitung

Verletzungen des langen Knochens heilen über den endochondralen oder intramembranösen Knochenbildungsweg. Im Gegensatz zum endochondralen Signalweg, der einen Knorpelvorläuferschritt erfordert, beinhaltet die Knochenreparatur durch intramembranöse Ossifikation die direkte Umwandlung von skelettalen Stamm- und Vorläuferzellen (SSPCS) in knochenbildende Osteoblasten1. Klinisch ist dieser Prozess für die Knochenheilung in einer Vielzahl von Kontexten relevant, einschließlich Defekten kritischer Größe, stabilisierten Frakturen, kortikalen Defekten, Distraktionsosteogenese, Traumata aus Tumorresektionen und Osseointegration von Gelenkersatzimplantaten 2,3. Interessanterweise hatten in Studien mit Patienten mit Frakturen des langen Knochens 66%-82% dislozierte Frakturen, die Fixationsvorrichtungen zur Stabilisierung des Knochens erforderten 4,5. Diese starr stabilisierten Knochen heilen primär durch intramembranöse Ossifikation, da die gebrochenen Knochenenden in direkten Kontakt miteinander kommen 6,7. Dennoch ist die mechanistische Regulation der intramembranösen Knochenregeneration im Vergleich zur Knochenbildung über die endochondralen Signalwege noch relativ wenig untersucht. Von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Therapien zur Verbesserung der Knochenheilung werden durch eine begrenzte klinische Wirksamkeit und hohe Kosten behindert und sind mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden8.

Die mechanische Knochenmarkablation stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung der intramembranösen Knochenbildung dar. Dieses einfache Verletzungsmodell ermöglicht es, die Knochenregeneration im Knochenmark zu untersuchen, ohne den kortikalen Knochen zu stören. Nach der BM-Ablation verläuft der Heilungsprozess in unterschiedlichen, sich jedoch überschneidenden Phasen. Die Anfangsphase findet in den ersten 1 bis 5 Tagen statt und beinhaltet die Bildung von Blutgerinnseln und Entzündungen, bei denen Entzündungszellen und Zytokine die Heilung einleiten. Von Tag 3 bis 14 ist die zweite Phase durch Regeneration gekennzeichnet, einschließlich Neovaskularisation, Migration und Proliferation mesenchymaler Stammzellen (MSC), osteoblastischer Differenzierung und Bildung gewebter Knochen. Die letzte Umbauphase beginnt etwa 10 Tage nach der Operation, wobei das Knochengewebe reift und umstrukturiert wird, bis das Knochenmark am Tag 569 vollständig wiederhergestellt ist. Diese schnelle Heilungszeit macht das BM-Ablationsmodell ideal für die Untersuchung früher Knochenreparaturreaktionen, insbesondere während der kritischen Phasen der Entzündung, der Rekrutierung von Vorläuferzellen und der Osteoblastendifferenzierung. Mit Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie und quantitativer μCT-Analyse können zelluläre Reaktionen und Knochenbildung in frühen Reparaturstadien bewertet werden. Unter Verwendung der oben genannten Techniken kann das BM-Ablationsmodell Einblicke in die Mechanismen der intramembranösen Knochenregeneration geben und bei der Identifizierung wichtiger therapeutischer Ziele zur Verbesserung der Knochenheilung helfen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die folgenden Verfahren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Gesundheitszentrums der University of Connecticut durchgeführt. Alle Operationen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wie sie in den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) festgelegt sind. Schmerzen und Infektionsrisiken wurden mit geeigneten Analgetika und Antiseptika behandelt, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten.

1. Vorbereitung des Operationsfeldes und der Instrumente

  1. Bereiten Sie den Operationssaal vor, indem Sie die Arbeitsflächen mit einem Desinfektionsreiniger in klinischer Qualität desinfizieren.
    HINWEIS: Der Chirurg sollte eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich steriler Einweghandschuhe, Haarhaube, Kittel und Maske.
  2. Bereiten Sie ein Heizkissen vor, das mit einem sterilen OP-Pad bedeckt ist. Sammeln und ordnen Sie alle sterilen Instrumente und Reagenzien (Materialtabelle) mit bequemem Zugriff an.

2. Präoperative Anästhesie

  1. Wiegen Sie alle Mäuse vor der Operation. Berechnen Sie die zu verwendenden Mengen des Analgetikums auf der Grundlage der verfügbaren Formulierung von Buprenorphin.
  2. Montieren Sie eine Tieranästhesieeinheit innerhalb des sterilen Arbeitsraums, die eine Induktionskammer und eine Nasen-Konus-Baugruppe umfasst. Stellen Sie die Sauerstoffleistung je nach Alter und Gewicht der Maus auf 2 l min-1 und Isofluran auf 1,5-3 % (v/v) ein.
  3. Sobald die Maus sediert ist, nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und legen Sie es in Rückenlage auf eine sterile chirurgische Unterlage. Tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf. Setze den Nasenkegel über den Kopf. Überprüfen Sie, ob die Maus ausreichend betäubt ist, indem Sie den Zeh vorsichtig einklemmen. Stellen Sie sicher, dass es keine Reflexreaktion der Hintergliedmaßen gibt, bevor Sie fortfahren.
  4. Entfernen Sie die Maus vor der Operation kurz aus dem Nasenkegel, um die Gesamtdosis von Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung subkutan zu injizieren. Die Gesamtdosis beträgt 3,25 mg/kg.

3. Beschreibung des chirurgischen Verfahrens

HINWEIS: Bei diesem chirurgischen Eingriff werden männliche und weibliche Mäuse von C57BL/6 im Alter von 10 Wochen bis 24 Wochen verwendet. Das Verfahren kann an Mäusen im Alter von 6 Wochen bis 33 Wochen und an verschiedenen Inzuchtstämmen durchgeführt werden, wie andere zeigen10,11. Jüngere Mäuse benötigen möglicherweise kürzere Nadellängen, während ältere oder größere Mäuse eine längere Nadel benötigen.

  1. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze, die mit einer 26-g-Nadel ausgestattet ist, mit steriler Kochsalzlösung. Legen Sie diesen zur Seite.
  2. Entfernen Sie das Fell von der Hintergliedmaße, an der der Eingriff mit einer elektrischen oder batteriebetriebenen Schermaschine (#40 Klinge) durchgeführt wird, und entfernen Sie loses Fell aus dem Operationsfeld. Behandeln Sie die Operationsstelle mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze mit einem Peeling auf Jodbasis (10 % Povidon-Jod), gefolgt von 70 % Isopropylalkohol. Schrubben Sie die Operationsstelle, beginnend in der Mitte des Knies, und machen Sie einen kreisförmigen Strich nach außen. Lassen Sie die Baustelle trocknen. Wiederholen Sie die Schritte zum Schrubben 3 Mal.
  3. Legen Sie die Maus auf den Rücken und beugen Sie das Knie des operierenden Beins. Halten Sie das Bein der Maus in der nicht-dominanten Hand so, dass das Knie über den Mittelfinger gebeugt ist, der zweite Finger auf dem Oberschenkelknochen und der Daumen auf dem Schienbein ruht.
  4. Machen Sie mit einem Skalpell einen kleinen, flachen horizontalen Schnitt direkt unter der Patella.
    HINWEIS: Dieser Schritt verbessert die Visualisierung der Einfügestelle. Mit etwas Erfahrung kann dieser Schritt übersprungen werden.
  5. Lokalisieren Sie den Gelenkspalt, indem Sie die Nadel horizontal über das gebeugte Knie legen und den Raum zwischen Femur und Tibia abtasten. Nehmen Sie diese anatomische Stelle als Führung, nehmen Sie eine 25-G-Nadel und bohren Sie manuell (durch Drehen der Nadel und gleichzeitiges Ausüben von mäßigem Druck auf die Nadel) vom Knie zur proximalen Seite in den distalen Femur. Führen Sie die Nadel durch oder um die Patella herum ein.
  6. Röntgen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass die Nadel so nah wie möglich an der Mitte in der Markhöhle platziert wurde (Abbildung 1).
  7. Entfernen Sie die 25 G Nadel und stechen Sie sofort eine 26 G Nadel in das gleiche Loch in der Markhöhle. Reiben Sie die Seiten der Markhöhle in kreisenden Bewegungen mindestens 5 Mal auf, bis sie sich glatt anfühlt. Halten Sie die Anzahl der Reibbewegungen zwischen den einzelnen Mausen konstant.
    HINWEIS: Die Schritte 3.5 und 3.7 können bei unvorsichtiger Handhabung zu Nadelstichverletzungen beim Chirurgen führen.
  8. Entfernen Sie die 26-G-Nadel und setzen Sie die 26-G-Nadel wieder ein, die mit der Kochsalzspritze verbunden ist. Spülen Sie den Hohlraum, bis der Rückfluss frei ist. Dies erfordert in der Regel 1,5-2 ml Kochsalzlösung. Entfernen Sie die Spritze und die Nadel und entsorgen Sie sie sicher in einem scharfen Behälter.
    HINWEIS: Beim Drücken der Flüssigkeit sollte kein Widerstand vorhanden sein. Wenn dies der Fall ist, führen Sie die Nadel erneut ein, um sicherzustellen, dass sie sich in der Kavität befindet. Es kann notwendig sein, die Nadel halb herauszuziehen.
  9. Verschließen Sie die Hautwunde mit einer topischen Klebenaht.

4. Nachsorge

  1. Unmittelbar nach der Operation ist die verbleibende halbe Dosis Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung in der Dosierung aus Schritt 2.4 zu verabreichen.
    HINWEIS: Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung bietet eine Schmerzlinderung von bis zu 72 Stunden.
  2. Überwachen Sie die Tiere auf dem Heizkissen auf Anzeichen einer normalen, ungehinderten Atmung, bis sie von der Operation erwachen. Sobald sie gehfähig sind, bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück.
  3. Überwachen Sie die Mäuse 3 Tage lang nach der Operation einmal täglich, um sicherzustellen, dass sie richtig heilen und volle Beweglichkeit haben, und achten Sie auf Anzeichen von Schmerzen.

5. Verarbeitung von Knochen für das Scannen und Analysieren von μCT

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse gemäß der humanen Euthanasiemethode, die von der IACUC oder einer anderen anwendbaren institutionellen Richtlinie reguliert und genehmigt wurde. Hier wurde die primäre Euthanasiemethode der CO2 -Inhalation angewendet, gefolgt von einer sekundären Methode der Zervixluxation.
  2. Entnehmen Sie die Oberschenkelknochen, indem Sie die Haut um die Hintergliedmaßen abziehen und die gesamte Gliedmaße am Hüftgelenk entfernen.
  3. Stecken Sie jedes Glied zwischen zwei Schwämmen in eine Einbettkassette. Übertragen Sie die Knochen in ihren Kassetten in eine 10%ige Formalinlösung und fixieren Sie sie 5-7 Tage lang bei 4 °C, unter Berücksichtigung des Alters und der Größe der Maus.
    HINWEIS: Sowohl eine Überfixation als auch eine Unterfixierung führen zu einer schlechten Knochenmarkauflösung.
  4. Waschen Sie die Kassetten nach der Fixierung 3 Mal 5 min lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  5. Entfernen Sie die Gliedmaßen aus den Kassetten und schneiden Sie bei Bedarf mit einem Skalpell Muskeln ab.
    HINWEIS: Abhängig von den nachgelagerten Anwendungen kann eine grobe Handhabung die Periostschicht des Knochens stören.
  6. Trennen Sie den Oberschenkelknochen am Knie, indem Sie die Bänder vorsichtig mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einem Skalpell durchschneiden.
    HINWEIS: Die Tibias können für andere Anwendungen verwendet oder verworfen werden.
  7. Übertragen Sie die Oberschenkelknochen in konische 1,7-ml- oder 15-ml-Röhrchen in eine 70%ige Ethanollösung. Die Knochen können in 70 % Ethanol bei 4 °C verbleiben, bis sie für die μCT-Untersuchung bereit sind.
  8. Scannen und beurteilen Sie die Femure auf trabekuläre Parameter, um qualitative und quantitative Daten zu erhalten.

6. Aufbereitung von Knochen für den Schnellschnitt und die Histologie

HINWEIS: Knochen können nach einer μCT-Untersuchung für den Schnellschnitt und die Histologie bearbeitet werden. Der Scan hat keinen Einfluss auf die Fluoreszenzmarkierung oder die anschließende Antikörperfärbung.

  1. Übertragen Sie die Knochen von 70% Ethanol auf PBS und waschen Sie sie 3 Mal, 5 Minuten pro Waschgang.
  2. Inkubieren Sie in einer Reihe von Saccharoselösungen von 10 %, 20 % bis 30 % in PBS bei 4 °C über Nacht bei jeder Konzentration. Lagern Sie die Knochen in 30%iger Saccharose bis zu 5 Tage bei 4 °C oder in dieser Lösung bei -20 °C für 6-12 Monate, bis sie zum Einbetten bereit sind.
    HINWEIS: Die Verwendung eines Saccharosegradienten führt zu einer besseren Gewebepenetration. Nach Schritt 6.1 können die Knochen über Nacht direkt in eine 30%ige Saccharoselösung gelegt werden.
  3. Betten Sie Knochen mit Kryoeinbettungsformen in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein. Bis zum Schnitt bei -80 °C lagern.
  4. Schnitte eingebetteter Knochen mit der Kryofilm-Tape-Methode mit einer Kryostatentemperatur zwischen -24 °C und -26 °C.
  5. Die Abschnitte auf dem Kryofilm mit optischem Klebstoff auf einen Objektträger kleben und mit einem ultravioletten (UV) Vernetzer bis zur Aushärtung aushärten.

7. Verarbeitung für die Durchflusszytometrie

HINWEIS: Dieses Protokoll ist mit einer Vielzahl von Antikörpern kompatibel. Für die Charakterisierung von Skelettstamm- und Vorläuferzellen wird empfohlen, 3-4 Knochen zusammenzufassen, da es sich hierbei um seltene Zellpopulationen im Knochenmark handelt.

  1. Bereiten Sie Färbemedien (FSM) für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor. Um 1000 ml FSM-Lösung herzustellen, kombinieren Sie: 100 ml Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS), 10 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES), 20 ml fötales Rinderserum (FBS), 870 ml dd H2O. Lassen Sie die FSM-Lösung durch einen 0,2-μm-Filter.
  2. Füllen Sie Petrischalen vor der Entnahme von Gewebe mit 4-5 mL sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium.
  3. Bereiten Sie das Aufschlussmedium vor
    1. Bereiten Sie für jeweils 4-6 Femure eine Aufschlussmischung in 10 ml PBS vor, die 0,005 g Kollagenase P und 0,02 g Hyaluronidase enthält. Mischen Sie durch sanftes Vortexen und passieren Sie die Mischung durch einen 0,22 μm Filter.
  4. Entnahme von Knochen am postoperativen Tag 3, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Entfernen Sie alle Muskeln und Bindegewebe mit einer Skalpellklinge.
  5. Füllen Sie eine Petrischale mit 5 mL Aufschlussmedium. Legen Sie 4-6 Knochen in das Verdauungsmedium. Hacken Sie jeden Knochen fein und machen Sie den ersten Schnitt in Längs- und Querrichtung.
  6. Übertragen Sie das Gewebe in ein 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden und verschließen Sie es mit Parafilm. Decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ab.
  7. Schütteln Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei 37 °C, indem Sie das Röhrchen waagerecht auf dem Schüttler halten.
  8. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Shaker. Die Zellen werden am Boden verklumpt. Sammeln Sie das aufgeschlossene Material schonend, ohne die Zellen am Boden zu stören, und leiten Sie den Aufschluss durch einen 70 μm Filter. Das Filtrat wird in einem neuen 50-ml-Röhrchen mit 10 mL kaltem FSM aufgefangen und auf Eis gelegt.
  9. Geben Sie die restlichen 5 ml der Aufschlussmischung in die Zellen. Wieder mit Parafilm versiegeln und mit Alufolie abdecken. Schütteln Sie die Tube wie oben beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 7.7-7.8.
  10. Nach der 20-minütigen Inkubation bei 37 °C wird der Aufschluss in dasselbe Röhrchen überführt, das den Aufschluss aus Schritt 7.8 enthält, und dabei einen 70-μm-Filter mit weiteren 10 ml FSM durchlaufen.
  11. Die Suspension wird bei 274 x g bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand an und sammeln Sie das Zellpellet. Lösen Sie das Pellet, indem Sie vorsichtig auf das Rohr klopfen.
    HINWEIS: Die Zentrifugalkraft (g) basiert auf einem Rotorradius von 170 mm. Bitte überprüfen Sie den Rotorradius und passen Sie die Drehzahl entsprechend an.
  12. Um die Lyse der roten Blutkörperchen durchzuführen, fügen Sie 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysingpuffer hinzu. Bewahren Sie alle Reagenzien und Zellen auf Eis auf.
  13. Inkubieren Sie die Zellen in ACK für ca. 5 min bei RT. Überschreiten Sie nicht 5 Minuten, um eine übermäßige Lyse der Zellen zu vermeiden.
  14. Fügen Sie 9 mL FSM hinzu. Bei 274 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  15. Aspirieren Sie den Überstand. Brechen Sie das Zellpellet auf, indem Sie das Röhrchen vorsichtig auf einem Röhrchengestell harken.
  16. Fügen Sie 10 ml FSM hinzu (Volumen für 4 Knochen, kann je nach Anzahl der kombinierten Knochen angepasst werden) und resuspendieren Sie.
  17. Entnehmen Sie von jeder Probe ein Aliquot und fügen Sie Propidiumiodid (PI) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Zählen Sie lebende und Gesamtzellen mit einem Zellzähler.
  18. Fahren Sie mit der Antikörperfärbung der Proben unter Verwendung der gewünschten Marker für die durchflusszytometrische Analysefort 12,13,14.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Der Erfolg des mechanischen Ablationsverfahrens des Knochenmarks (BM) wurde durch Röntgenbildgebung bestätigt, während die 26G-Nadel in die Markhöhle eingeführt wurde (Abbildung 2A). Wenn die Röntgenbildgebung zeigte, dass die Nadel in einem falschen Winkel eingeführt oder durch den Knochen eingedrungen war, wurde die Nadel im richtigen Winkel wieder eingeführt und erneut abgebildet, um die genaue Platzierung zu bestätigen. Wenn keine erfolgreiche Position erreicht werden konnte, wurde das T...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ziel war es, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der molekularen und zellulären Prozesse zu etablieren, die die Knochenreparatur steuern, wobei der Schwerpunkt auf der direkten Umwandlung von skelettalen Stamm- und Vorläuferzellen (SSPCs) in knochenablagernde Osteoblasten im Knochenmarkraum liegt. Die hier beschriebene Methode der mechanischen Knochenmarkablation ist ein optimiertes und validiertes Protokoll für die Knochenmarkablation durch mechanische Verletz...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegungen zu berichten.

Danksagungen

Die Finanzierung erfolgte durch NIH/NIDCR R01-DE030716-01 und NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 für AS, NIH/NIAMS R01AR080131 für RG und UConn REP Convergence Grant für RG und AS.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10% Formalin-Lösung Sigma-AldrichHT501128
25 G 0,625 Zoll Air-tite EZ Flo InjektionsnadelAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Einweg-InjektionsnadelnExel International/ Fisher Scientific14-840-83; ref #26402Alle 26 G Nadeln können ersetzt werden, müssen von der Spritze abnehmbar sein 
3 mL sterile SpritzeFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Steriles PadMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755Alternativ können autoklavierbare Absorptionskissen verwendet werden 
Essigsäure, glazialeMillipore SigmaAX0073Muss verdünnt werden auf 1%
Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysing BufferGibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Wird für die Lyse roter Blutkörperchen in Vorbereitung auf die Durchflusszytometrie verwendet 
Anästhesie-Induktionskammer 2 LVetEquip941444
Betadin (Providon-Jod) Lösung Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Buprenorphin HCL Injektion 0,3 mg/ml Generika/Covetrus59122Muss eine staatliche und bundesstaatliche DEA-Lizenz für den Kauf der kontrollierten Substanz
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Kollagenase P Roche11249002001zur Verdauung
Wattestäbchen und ApplikatorenFisherbrand/ Fisher Scientific22-363-172
Kryofilm Typ II C(10), 3,5 cmSchnitt Labor, JapanCFS 105
DAPI Färbelösung Abcamab228549
Digitale GrammwaageToprime / AmazonB06X6LW4V9Kann jede Markenwaage zum Wiegen von Mäusen verwenden
PräparierzangeFisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Präparierschere Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Endure Low Profile Kryostat/Mikrotom-KlingenTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung 1,3 mg/mlEthiqa XR / Cevetrus72117Muss eine staatliche und bundesstaatliche DEA-Lizenz für den Kauf von kontrollierten Substanzen erwerben
Fast Green, 0,2%Elektronenmiscroskopie Sciences EMS50-319-57
Fötales Rinderserumhitze inaktivierterGibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Wird zur Herstellung von FACS-Färbemedien (FSM)
Fluoromount-G Einbettlösung verwendet SouthernBiotech 0100-01
GLUSEAL Topischer HautklebstoffAD Chirurgisch GLU-550
Ziege Anti-Kaninchen Alexa 647Thermo FisherA212441:300 Verdünnung
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056Wird zur Herstellung von FACS-Färbemedien (FSM) verwendetHeizkissen
(groß)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXKann Heizkissen jeder Marke verwenden, entfernen Sie die Stoffabdeckung 
HämatoxylinMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
HyaluronidaseMilliporeSigmaHX0514Wird für die Verdauung von Knochen
verwendet Isofluran TieranästhesiesystemVetEquip901810
KUBTEC Parameter 2D-Schrank RöntgensystemOncoMed SolutionsN/AJedes Röntgenschrank-Bildgebungssystem kann verwendet werden
Mikrozentrifuge TubesCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Mikroskop-Deckglas, 18 mm x 18 mm, # 1 DickeGlobe Scientific1414-10
N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Wird zur Herstellung von FACS-Färbemedien (FSM) verwendetNorland
optischer Klebstoff NO61Edmund Optical37-322Wird verwendet, um Kryofilmabschnitte auf einen Objektträger zu kleben 
Osterix Kaninchen Monoklonaler Antikörper Abcamab2094841:500 Verdünnung
Peroxigard Gebrauchsfertiges Desinfektionsmittel in einem SchrittVirox Technologies29101Kann durch ein anderes Desinfektionsmittel in klinischer/Laborqualität ersetzt werden
Propidiumiodid (PI)Invitrogen/ Thermo Fisher ScientificP1304MPNuklearer Fluoreszenzfleck zur Erkennung abgestorbener Zellen für die Viabilitätszählung
Wiederaufladbarer elektrischer TrimmerWahl/ AmazonB001FWXKUEJede Schermaschine kann verwendet werden, ein kleinerer Trimmer erleichtert die Rasur kleinerer Tiere
Nagetier NasenkegelVetEquip921609
Safranin O, 85% rein, zertifiziertFisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Quadratische FormenElektronenmiskroskopie Sciences EMS62642-01Zum Einbetten verwendet, können auch andere Einbettungsformen verwendet werden. Dieses spezielle Modell hat eine tiefere Form sowie einen Deckel, um den Block abzudichten.
SilbernitratSigma AldrichS6506Silbernitrat für von Kossa-Flecken
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023Alternativ kann frisch zubereitetes PBS verwendet werden, das filtriert und autoklaviert wurde
Sterile StandardskalpelleIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sterile StandardskalpelleIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Saccharose Pulver 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Superfrost Plus Miscroscope ObjektträgerFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Selbstklebende Objektträger
Sure-Tek Tissue Processing/ Embedding CasettesFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Tissue Plus Optimal Cutting Temperature O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
Tissue SpongesEpredia/ Fisher Scientific84-53Tissue-Schwämme schützen das Gewebe vor Überbefruchtung 
Toluidin BlueFisher ScientificAC348600050
von für Knochen

Referenzen

  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Skelettale StammzellenKnochenregenerationmurines KnochenmodellOsteoblastendifferenzierungMikrocomputertomographieGefrierschnitt-HistologieKnochenreparaturmechanismen
Verbesserte Methodik zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation in einem murinen Knochenmarkverletzungsmodell
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.