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Methodenartikel

Optimierte Methode zur Kultivierung und mikrobiellen Bioaugmentation von Typha latifolia (Rohrkolben)

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DOI:

10.3791/67729

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25. Juli 2025

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Typha latifolia, die sich hauptsächlich asexuell über Rhizome vermehrt, stellt aufgrund ihres ausgedehnten Wurzelsystems eine Herausforderung für das Sammeln dar. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Züchtung von T. latifolia aus Samen vorgestellt, die den Anbau im Labor erleichtert und das Potenzial für steriles Pflanzenwachstum und frühe mikrobielle Bioaugmentation bietet.

Zusammenfassung

Typha latifolia, besser bekannt als Breitblättriger Rohrkolben oder Rohrkolben, hat ein weltweites Verbreitungsgebiet und dominiert die Ökosysteme der Feuchtgebiete in Nordamerika. Während in Nordamerika verschiedene Rohrkolbenarten oft als invasiv angesehen werden, gilt T. latifolia als die einheimische Art in der Region und ist auf dem gesamten Kontinent als dominierende Typha-Art zu finden. In der Vergangenheit hat Typha verschiedene Funktionen erfüllt, von Nahrungsquellen bis hin zu Baumaterialien. In jüngerer Zeit hat sich T. latifolia zu einer prominenten Art entwickelt, um die Bioremediation zu unterstützen. Mit zunehmendem Interesse an der Entwicklung von Pflanzenkläranlagen (CWTS) für die Sanierung von Schadstoffen sind reproduzierbare Techniken für den Anbau von Rohrkolben in einer Laborumgebung erforderlich. In der hier vorgestellten Arbeit wurden verschiedene Wachstumsparameter für die erfolgreiche Kultivierung von T. latifolia aus Samen untersucht und getestet. Für eine erfolgreiche Keimung von Typha-Arten ist die Vertikutierung (Bruch der Samenschale) erforderlich, die mit mechanischen Techniken für die Großproduktion erreicht wurde. Es zeigte sich, dass eine frühe Etablierung des Saatguts in der ersten Woche nährstoffarme Wachstumsbedingungen begünstigte, gefolgt von der Einführung von Dünger in den folgenden Wochen, um das Überleben nach der Transplantation zu verbessern. Für die mikrobielle Bioaugmentation des Pflanzensystems zeigten die Ergebnisse, dass das Einweichen der Samen in das Inokulum zu einer ausgedehnteren Besiedlung des Wurzelgewebes und einer langfristigen bakteriellen Persistenz führt. Eine optimierte Saatgutsterilisationstechnik mit einer Kombination aus Bleichmittel und Reinigungsmittel wurde verwendet, um den Erfolg der Besiedlung von Mikroorganismen zu verbessern. Die in dieser Studie entworfenen sterilen und unsterilen Wachstumsgefäße unterstützen das langfristige Wachstum von T. latifolia unter verschiedenen Bedingungen.

Einleitung

Als kosten- und energieeffiziente Technologie haben Pflanzenkläranlagen (CWTS) bei der Sanierung von Umweltschadstoffen 1,2,3 an Popularität gewonnen. CWTS verwendet physikalische, chemische und biologische Prozesse, um Verunreinigungen zu entfernen, umzuwandeln oder zu stabilisieren. Während die physikalischen und chemischen Prozesse, die am chemischen Umschlag beteiligt sind, seit der Entstehung von CWTS gut charakterisiert sind, blieb der Einfluss der Vegetation weitgehend rätselhaft2. In den letzten Jahren wurde verstärkt auf das Verständnis der Mechanismen geachtet, durch die Pflanzen organische und anorganische Schadstoffe in Abwässern umwandeln, die potenziell bedenklich sind 2,4,5. Mechanistische Studien wie diese beruhen jedoch auf der Fähigkeit, eine große Anzahl von Makrophyten zu kultivieren und das Wachstum aus Samen zu fördern, um sicherzustellen, dass sich jede Pflanze im gleichen Wachstums- und Entwicklungsstadium befindet.

CWTS werden in Nordamerika häufig unter Verwendung von Vegetation etabliert, die in natürlichen Feuchtgebieten in der Region heimisch ist, wie z. B. Typha-, Scirpus-, Juncus- und Phragmites-Arten 6,7. Die Wahl der Vegetation hängt auch von der genutzten Pflanzenkläranlage ab, die in der Tiefe, der Wasserströmung, der Substratbeschaffung und der Wasserbeschaffung (mit oder ohne Rezirkulation) variieren kann2. Schließlich beeinflusst das Klima auch die Vegetation von Feuchtgebieten, wobei kühlere Klimazonen Unterwasserpflanzen aufgrund ihrer erhöhten Anpassungsfähigkeit begünstigen8. Typhaarten sind aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Umwelt schnell zu besiedeln und sich an unterschiedliche Umweltbedingungen anzupassen, von besonderem Interesse in tiefen, oberflächengebundenen Pflanzenkläranlagen 9,10.

Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung der Ergebnisse ergab, dass von 87 Phytotoxizitätstests mit Typha-Arten nur 15 Studien die Testpflanzen aus Samen starteten, und von diesen untersuchte nur eine Studie das Wachstum bei reifen Pflanzen11. Diese Unterrepräsentation von Rohrkolbenexperimenten aus Saatgut deutet auf eine Lücke in der Literatur hin, die sich auf Protokolle bezieht, die darauf abzielen, den Anbau von Rohrkolben für Laborstudien zu beschreiben. Die hier skizzierten Protokolle zielen darauf ab, diese Lücke zu schließen, indem sie ein detailliertes Protokoll für das Wachstum von Typha latifolia vom Samen bis zur reifen Pflanze unter sterilen und unsterilen Bedingungen vorstellen. Darüber hinaus wird in diesem Artikel eine Technik zur bakteriellen Bioaugmentation von Rohrkolbenarten im Samenstadium diskutiert, bei der eine frühzeitige Inokulation dazu beitragen kann, die langfristige Persistenz eingeschleppter Rhizo- und endophytischer Mikroben zu erhalten.

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Protokoll

1. Vertikutieren von Saatgut

  1. Rohrkolbensamen wurden im Herbst 2023 (51,11312° N, 114,39381° W) aus einem Feuchtgebiet in Calgary, AB, Kanada, bezogen. Sammeln Sie Rohrkolbenblütenstände im Herbst und bewahren Sie sie bis zur Verwendung im Dunkeln in einer Papiertüte auf. Wenn sie sich noch am Stiel befinden, sammeln Sie den Blütenstand im Frühjahr, aber die Samenausbeute wird verringert.
  2. Schneiden Sie mit einer Gartenschere den Pflanzenstiel ~2 cm von der Basis des Blütenstandes ab. Ziehen Sie die Samen aus dem Blütenstand und geben Sie sie in einen Labormixer, bis das Volumen des Mixers etwa zu einem Viertel gefüllt ist. Dies sind etwa 250 ml nicht verdichtete Samen.
  3. Füllen Sie den Mixer mit 500 ml Leitungswasser. Halten Sie einen Kopfabstand von 10 cm im Mixer. Bei mittlerer bis niedriger Geschwindigkeit 20 s lang mixen und sofort in ein großes 1-Liter-Becherglas geben. Die resultierende Lösung sollte viskos sein.
  4. Füllen Sie ca. 100 mL dieses Samenwasserschlamms zurück in den Mixer und füllen Sie den Mixer mit 400-600 mL frischem Leitungswasser. Bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit 20 s lang mixen und sofort in ein frisches 1-Liter-Becherglas geben.
  5. Füllen Sie das Becherglas mit Leitungswasser bis 800 mL und lassen Sie es mindestens 60 s ruhen. Vertikutierte und lebensfähige Rohrkolbensamen sinken auf den Boden des Becherglases, und der Federbusch und der Schnabel (siehe Abbildung 1 für eine Beschreibung der Rohrkolbensamenstruktur) schwimmen nach oben. Schöpfen Sie den Schlamm oben im Becherglas ab und gießen Sie das Wasser langsam aus dem Becher, ohne die Kerne am Boden zu stören. Übertragen Sie die Samen in ein 100-ml-Becherglas.
  6. Wiederholen Sie den Mischvorgang für den restlichen Rohrkolbenschlamm aus Schritt 1.5.
  7. Den Becher mit den Kernen auf eine Rührplatte legen und bei mittlerer Geschwindigkeit 1 h schleudern. Nach 1 Stunde das oben am Becher schwimmende Pflanzenmaterial abschöpfen.
  8. Gießen Sie die Samen in einen Büchner-Trichter mit Filterpapier, das an einem Vakuum befestigt ist, um die Samen über Nacht zu trocknen. Trockene Samen können bei -20 °C in konischen 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen gelagert werden.

2. Keimung mit unsteriler Technik

  1. Bereiten Sie halbstarke Murashige- und Skoog (MS)-Medienplatten mit 1 % Phytoagar12 vor.
  2. Geben Sie ca. 1 ml trockene Samen in ein konisches 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen und füllen Sie es mit 10 ml Leitungswasser. Drehen Sie auf einem Orbitalschüttler 24 Stunden lang mit niedriger Geschwindigkeit, um die Keimung zu induzieren.
  3. Entfernen Sie überschüssiges Wasser, so dass 3 mL in dem konischen 15-ml-Polypropylen-Röhrchen verbleiben.
  4. Schneiden Sie die Spitze einer 1000-μl-Pipettenspitze aus Kunststoff ab, um die Bohrung zu vergrößern, und pipettieren Sie die Samenlösung kräftig, um die Samen in der Pipettenspitze zu suspendieren.
  5. Samen und Wasser auf die halbstarken MS-Agarplatten geben. Schwenken Sie den Teller, um die Samen gleichmäßig zu verteilen.
  6. Wickeln Sie die Platten in Labor-Siegelfolie ein und legen Sie sie in eine Wachstumskammer mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16 h/8 h bei 23 °C und 70% Luftfeuchtigkeit. Inkubieren Sie die Platten 1 Woche lang (bis zu 2 Wochen), um die Keimung der Samen einzuleiten.

3. Keimung mit steriler Technik

HINWEIS: Es wurden verschiedene Saatgutsterilisationsprotokolle getestet und verglichen. Die Technik, die die höchsten Keimraten bei der Produktion von vollständig sterilisiertem Saatgut erzeugte, wurde gegenüber einem früheren Protokoll13 modifiziert und wird hier beschrieben.

  1. Bereiten Sie halbstarke MS-Medienplatten mit 1 % Phytoagar12 vor.
  2. Geben Sie ein Volumen von ca. 1 mL Samen in ein konisches 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen und füllen Sie es mit 10 mL sterilem ddH2O. Legen Sie es 10 Minuten lang bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit auf einen Orbitalschüttler.
  3. Entfernen Sie das Wasser und geben Sie 5 ml einer 0,1%igen Polysorbat-20-Lösung (hergestellt in sterilem ddH2O) in das konische 15-ml-Polypropylenröhrchen. 10 Minuten lang bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit auf einen Schwinger stellen.
  4. Entfernen Sie die Lösung und geben Sie 5 ml eines handelsüblichen Bleichmittels mit 30 % und einer Lösung aus Polysorbat 20 (hergestellt in sterilem ddH2O) in das konische 15-ml-Polypropylenröhrchen. Bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit 30 Minuten lang schütteln.
  5. Die Lösung entfernen und durch steriles ddH2O. Schütteln Sie sie 5 Minuten lang bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wasserspülungen.
  6. Füllen Sie das konische 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit sterilem ddH2O und drehen Sie es 24 h lang mit niedriger Geschwindigkeit, um die Keimung einzuleiten. Entfernen Sie nach 24 h das überschüssige Wasser, so dass 3 mL im Kunststoffröhrchen verbleiben.
  7. Schneiden Sie die Spitze einer 1000-μl-Pipettenspitze aus Kunststoff aseptisch ab und pipettieren Sie kräftig, um die Samen in der Spitze zu suspendieren.
  8. Platten Samen und Flüssigkeit auf halbstarken MS-Agarplatten. Schwenken Sie die Platte, um die Samen gleichmäßig zu verteilen.
  9. Die Platten in Labor-Siegelfolie einwickeln und in eine Wachstumskammer mit einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 16 h/8 h bei 23 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit stellen. Lassen Sie die Platten 1 Woche (bis zu 2 Wochen) stehen, damit die Keimung stattfinden kann.

4. Saatgutinokulation mit ausgewählten Bakterien

  1. Um Rohrkolbensamen zu impfen, befolgen Sie zunächst das oben beschriebene sterile Saatgutkeimungsprotokoll bis Schritt 3.6, um steriles Saatgut herzustellen. Entfernen Sie die abschließende Wasserspülung aus dem konischen 15-ml-Polypropylen-Röhrchen, wie in Schritt 3.6 beschrieben.
  2. Messen Sie den OD600 unter Verwendung von über Nacht gezüchteten mikrobiellen Kulturen, die aus einem einzelnen Isolat oder einer Gemeinschaft geimpft wurden, und normalisieren Sie ihn durch Verdünnen in Kulturmedium auf einen Absorptionswert von 1,0. Inkubieren Sie Kulturen über einen längeren Zeitraum, wenn ein OD600 von 1,0 nicht erreicht wird.
    HINWEIS: Hier wurden Kulturen aus einem Luteimonas sp. etabliert, der aus Pflanzenwurzeln im Norden Albertas isoliert und konjugiert wurde, um ein DsRed-fluoreszierendes Protein für die mikroskopische Visualisierung zu exprimieren.
  3. 1 ml Kultur bei 9300 x g für 2 Minuten schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Bei 9300 x g für 2 Min. drehen.
  4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml sterilem ddH2O.
  5. In einem konischen 15-ml-Polypropylen-Röhrchen werden ca. 1 ml Samen bei niedriger Geschwindigkeit für 24 Stunden in 10 ml einer Verdünnung von 1:10 des vorbereiteten Inokulums mit 0,025 % Organosilikon-Tensid geschüttelt.
  6. Befolgen Sie den Rest des sterilen Keimungsprotokolls ab Schritt 3.8.

5. Unsteriles Rohrkolbenwachstum auf Erde

  1. Füllen Sie die Töpfe mit wenig organischer Erde Ihrer Wahl und lassen Sie 1 cm Abstand zur Oberseite des Topfes. Befeuchten Sie die Erde mit Leitungswasser und stechen Sie 1 cm große Löcher in die Erde.
  2. Entfernen Sie mit einer Pinzette die 1 Woche gekeimten Sämlinge vorsichtig von den MS-Agarplatten, die wie in Schritt 3 oben beschrieben angebaut wurden, und achten Sie darauf, die Wurzeln nicht zu beschädigen. Setze vorsichtig einen Sämling in jedes Loch in der Erde und bedecke es mit Erde.
  3. Stellen Sie die Töpfe in eine Schale und füllen Sie sie bis zur Erde mit Leitungswasser. Füge pro 10 Töpfe 100 ml 0,5% 20/20/20 NPK-Dünger hinzu.
  4. Zu jedem Satz von zehn Töpfen Dünger wie folgt hinzufügen: Woche 2 - 100 ml 0,5 % Dünger, Woche 3 - 100 ml 1,0 % Dünger, Woche 4 - 100 ml 1,0 % Dünger.
  5. Beenden Sie nach 4 Wochen die wöchentliche Düngung und düngen Sie nur einmal monatlich mit 100 ml 1,0%iger Düngerlösung. Nach 4 Wochen bei Bedarf in größere Töpfe umpflanzen. Die Pflanzen sind zu diesem Zeitpunkt weniger empfindlich gegenüber der Bodenart, also verwende eine beliebige Mischung.
  6. Setze die Rohrkolben fort, wenn sie aus ihrem Behälter herauswachsen. Entfernen Sie abgestorbenes Laub mit einer Schere. Düngen Sie Rohrkolben einmal im Monat.
  7. Für Experimente verpflanzen Sie die Sämlinge in einen kleinen Topf, der, wenn er in den Boden einer leeren Pipettenspitze gesetzt wird, an den Seiten der Schachtel verankert ist. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Flutung des Bodens und ahmt so die Bedingungen in Feuchtgebieten nach. Wenn Sie Versuche an älteren Rohrkolben durchführen, modifizieren Sie sie ähnlich, so dass der Topf fast vollständig in Wasser getaucht werden kann.

6. Steriles Wachstum der Sämlinge

  1. Design der Wachstumskammer für Sämlinge
    HINWEIS: Für die Montage jeder Sämlingswachstumskammer sind zwei Kulturboxen, eine Spritze mit Luer-Lock-Spitze, ein 0,2 μm Sterilfilter und hitzebeständiges Silikon erforderlich. In Abbildung 2 finden Sie eine visuelle Darstellung des Kammeraufbaus.
    1. Nehmen Sie die Deckel von den Kulturboxen und bohren Sie mit einem Handbohrer Löcher mit einem Durchmesser von 3,5 cm in die Mitte der Deckel. Verwenden Sie hitzebeständiges Silikon, um die Oberseiten der beiden Deckel miteinander zu verkleben.
    2. Bohren Sie ein Loch in der Größe der Spritzenspitze (~ 1 cm Durchmesser) in die untere Ecke einer der Kulturboxen. Schneiden Sie die Spitze von einer Spritze ab und entsorgen Sie den Körper der Spritze.
    3. Verwenden Sie hitzebeständiges Silikon, um die Spitze der Spritze mit dem Luer-Lock-Faden an der Außenseite der Schachtel in der Kulturbox zu befestigen.
    4. Lassen Sie das Silikon vor der Verwendung mindestens 24 h aushärten.
  2. Steriles Wachstum im Boden
    1. Befolgen Sie das in Schritt 3 beschriebene sterile Keimprotokoll für Samen, um steriles Saatgut zu erhalten.
    2. Füllen Sie die sterile Wachstumskammer mit Erde Ihrer Wahl, die mit Leitungswasser benetzt wird.
    3. Autoklavieren Sie in einem flüssigen 20-minütigen Zyklus und bedecken Sie die Köderverschlussspitze mit Aluminiumfolie. Nach 24 h autoklavieren Sie das System erneut in einem flüssigen 20-Minuten-Zyklus. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube aus.
    4. Befestigen Sie eine 0,2-μm-Filtereinheit an der Luer-Lock-Befestigung an der Wachstumskammer (Abbildung 2). Öffnen Sie die Wachstumskammer und geben Sie 500 μl filtersterilisierten 1% 20/20/20 Dünger in die Erde. Mischen Sie die Erde mit einem sterilen Spatel. Fügen Sie beim Mischen der Erde steriles ddH2O hinzu, um sicherzustellen, dass sie ausreichend mit Feuchtigkeit versorgt wird, ohne zu übersättigt.
    5. Schneide das MS-Agar mit einer sterilen Rasierklinge von Platten mit 1 Woche alten Setzlingen in Viertel. Lege das Agarstück mit einem sterilen Spatel auf die Erde.
    6. Stellen Sie die Wachstumskammereinheit in einem 16-Stunden/8-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus bei 23 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit in einen Pflanzenwachstumsinkubator.
  3. Steriles Wachstum in hydroponischer Lösung
    1. Befolgen Sie das in Schritt 3 beschriebene sterile Keimprotokoll, um steriles Saatgut zu erhalten.
    2. Autoklavieren Sie eine Pipettenspitzenbox und einen halbstarken MS-Agar in einem flüssigen 20-minütigen Zyklus. Wickeln Sie in einer Laminar-Flow-Haube die Unterseite des Spitzeneinsatzes mit steriler Labor-Siegelfolie ein. Füllen Sie jede Pipettenspitzenöffnung fast bis zum Rand mit Agar.
    3. Geben Sie den Spitzeneinsatz zurück in die Spitzendose und füllen Sie den Boden der Schachtel mit halbstarker Hoagland's Hydrokultur-Wachstumslösung (0,5 mM NH4H2PO4, 3 mM KNO3, 2 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,023 mM H3BO3, 0,005 mM MnCl2,4H 2O, 0,0004 mM ZnSO4,7H 2O, 0,0002 mM CuSO4,5H 2O, 0,00007 mM H2MoO 4,1H2O und 0,045 mM FeSO4,7H 2O, angepasst an pH 7,0).
    4. Nehmen Sie vorsichtig die Sämlinge aus den MS-Agarplatten und legen Sie sie auf den MS-Agar auf den Agar in die Pipettenöffnung im Einsatz der Tip-Box.
    5. Schließen Sie den Deckel der Tip-Box und stellen Sie ihn in einer Wachstumskammer bei einem Tag-Nacht-Zyklus von 16 h/8 h bei 23 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit in eine Wachstumskammer.
    6. Wenn die Pflanzen zu groß für die Tip-Box sind, verpflanze sie in die in Schritt 5.1 beschriebene Kulturwachstumskammer. Zum Umfüllen entfernen Sie den gesamten Agar-Pfropfen mit der Pflanze und schieben ihn in einen Schaumstoffstopfen mit radialem Schnitt. Der Schaumstoffstopfen kann zwischen den beiden Kulturboxen platziert werden, und die untere Kulturbox kann mit halbstarken Hoagland's gefüllt werden.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Darstellung eines Typha-Samens , der den Vertikutierungsprozess durchlaufen hat, zusammen mit einem unvollständig vertikutierten Samen, bei dem der Schnabel entfernt wurde, und einem nicht vertikutierten Samen. Stellen Sie sicher, dass die Mischzeit ausreicht, um hauptsächlich vollständig vertikutierte Samen zu produzieren.

Nach dem Vertikutieren und Trocknen der Samen sollte die Lebensfähigkeit der Samen mit der unsterilen Keimtechn...

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen detaillierten Leitfaden für das Wachstum von Rohrkolbenarten aus Saatgut für Laboranwendungen. Während Rohrkolben leicht aus Rhizomstecklingen vermehrt werden können, ermöglicht die Aufzucht von Pflanzen aus Samen eine genetische Variation innerhalb eines Probensatzes, stellt sicher, dass sich die Pflanzen in gleichen Wachstumsstadien befinden, und bietet die Möglichkeit einer frühen Besiedlung für mikrobielle Bioaugmentationsexperimente. Es i...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

AZ wurde durch einen Cgs-M Graduate Award des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) finanziert. Die Forschung zu CWTS im Muench-Labor wird von Genome Canada durch einen Zuschuss für ein Large Scale Applied Research Project (LSARP) (#18207) in Zusammenarbeit mit Genome Alberta und Genome Quebec unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.2 &Mikro; Steriler FilterVWR514-4126
3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenonPhytoTech-LaboreS7777
Kulturboxen mit Deckeln (77 mm & mal & 77 mm & mal 97 mm)Millipore Sigma V8505
Hitzebeständiges Silikondichtmittel bei hoher TemperaturKaiserliche FertigungsgruppeKK0205
LaborversiegelungsfilmMillipore Sigma P7793
Murashige und Skoog media PhytoTech-LaboreM401
Organosilikon-TensidePhytoTech-LaboreS7777
Phytoagar GoldBiotechnologieP1003 
Polysorbat 20Roche11332465001

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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