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Methodenartikel

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

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DOI:

10.3791/67733

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24. Juni 2025

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1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Zusammenfassung

γ-Sekretase ist ein in die Zellmembran eingebetteter Proteasekomplex, der aus den katalytischen Presenilin-Untereinheiten (PS1 oder PS2) und drei weiteren Co-Faktoren besteht: Nicastrin, Aph-1 und Pen2. Es spaltet die Transmembrandomänen von Typ-I-Transmembranproteinen, wie z. B. dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und Notch. Bei der Spaltung von APP entstehen die Amyloid-β-Peptide (Aβ), die sich bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit anreichern. Trotz umfangreicher Forschung ist der genaue Mechanismus dieser einzigartigen Proteolyse, die innerhalb der Lipiddoppelschichten abläuft, immer noch nicht vollständig verstanden. Um die enzymatischen Eigenschaften der γ-Sekretase zu untersuchen, haben wir ein Hefe-Reportersystem etabliert, das künstliche γ-Sekretase-Substrate verwendet, die APP- oder Notch-Fragmente enthalten, die mit dem Transkriptionsaktivator Gal4 fusioniert sind. Die γ-Sekretase-Aktivität wurde durch transkriptionelle Aktivierung von Reportergenen nach Freisetzung von Gal4 aus den membrangebundenen Substraten bewertet, wie sie durch das Wachstum der Hefe- oder β-Galactosidase-Aktivität beurteilt wurde. Darüber hinaus haben wir einen in vitro Assay entwickelt, um die verschiedenen Formen von Aβ zu identifizieren, die aus Hefemikrosomen hergestellt werden. Diese Hefemodelle bieten eine Plattform zum Screening von Mutationen, Genen und Verbindungen, die die Funktion der γ-Sekretase beeinflussen. Durch die Untersuchung des Verlusts der Funktionseigenschaften von PS1-Mutanten der familiären Alzheimer-Krankheit (FAD) ist es möglich, neben γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs) auch nach FAD-Suppressormutationen und γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen. In diesem Bericht beschreiben wir die genetischen und biochemischen Methoden, die zur Untersuchung der γ-Sekretase-Aktivität im Hefesystem verwendet werden, mit den wesentlichen Schritten des Protokolls für das Video.

Einleitung

γ-Sekretase ist für die Intramembranspaltung von über 150 Typ-I-Transmembranproteinen verantwortlich, darunter das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und Notch1. Die Bedeutung der Intramembranspaltung umfasst nicht nur den Proteinumsatz, sondern auch die Signaltransduktion durch die erzeugten Fragmente. Zum Beispiel entstehen bei der Verarbeitung von APP kleine Amyloid-β-Peptide (Aβ). Obwohl Aβ als Abbauprodukt entfernt werden sollte, reichert es sich bei der Alzheimer-Krankheit im Gehirn an und bildet senile Plaques2. Auf der anderen Seite ist die Verarbeitung von Notch essentiell für die NOTCH-Signalübertragung3, die für die Entwicklung entscheidend ist. γ-Sekretase besteht aus vier Transmembranproteinen: Presenilin (PS1 oder PS2), Nicastrin (NCT), vorderer Pharynx-1 (Aph-1a oder 1b) und Presenilin Enhancer 2 (Pen2)4. Diese Proteine haben insgesamt 19 Transmembrandomänen: Es gibt neun in PS, sieben in Aph1, zwei in Pen2 und eine in NCT. PS dient als katalytische Untereinheit und enthält zwei Asparaginsäurereste, die sich in den Transmembrandomänen TM6 und TM75 befinden. Während der Reifung des Komplexes erfährt PS innerhalb seiner hydrophilen Schleife HL6 eine endoproteolytische Spaltung, die zur Bildung von aminoterminalen und carboxylterminalen Fragmentenführt 4. Mutationen, die mit der familiären Alzheimer-Krankheit (FAD) assoziiert sind, finden sich sowohl im APP- als auch im PS-Gen2. Diese pathogenen Missense-Mutationen wirken sich nachteilig auf die Aktivität der γ-Sekretase aus und verringern ihre Fähigkeit, APP effektiv zu verarbeiten. Dies führt zu einer erhöhten Produktion der aggregationsanfälligen Aβ42-Formen anstelle der üblichen Aβ406. Die genauen Mechanismen, durch die diese Mutationen die Spaltung stören, sind noch unklar. γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs), die das Verhältnis von Aβ42 zu anderen Aβ-Formen verändern können, erweisen sich als vielversprechende potenzielle Therapeutika für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit, indem sie den Aβ42-Spiegel senken7.

Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae dient seit langem als Modellorganismus, um Schlüsselfunktionen in eukaryotischen Zellen wie Zellteilung, Proteintransport und Autophagie zu untersuchen. Forscher haben funktionelle Komplementierung eingesetzt, um menschliche Homologe zu untersuchen, einschließlich des Zellteilungszyklus (CDC), der Sekretion (SEC) und der Autophagie-bezogenen (ATG) Gene. Die Transformation von Hefemutanten mit menschlichen Genen ermöglicht es Forschern, zelluläre Prozesse aus funktioneller Sicht zu analysieren. Von den fünf bekannten Familien der Intramembranproteasen besitzt die Hefe nur drei: die Signalpeptidpeptidase (Ypf1), die Rhomboide (Pcp1 und Rbd2) und das Ras-konvertierende Enzym (Rce1). Es gibt jedoch keine Homologe der γ-Sekretase oder der Site-2-Protease in Hefe8, so dass der Komplementationsansatz nicht geeignet ist. Trotz des Fehlens von Hefe-Gegenstücken für diese Proteasen bleibt S. cerevisiae wertvoll für die Erforschung menschlicher Proteine. Techniken wie Hefe-Ein-Hybrid-, Zwei-Hybrid- und Drei-Hybrid-Assays, die den Hefe-Transkriptionsaktivator Gal4 verwenden, werden eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen DNA, Transkriptionsfaktoren, Proteinen oder RNA9 nachzuweisen. Wir haben das Gal4-System modifiziert, um die Intramembranproteolyse zu überwachen, die durch γ-Sekretase vermittelt wird.

Wir haben die γ-Sekretase-Spaltreaktion in Hefe erfolgreich rekonstituiert, indem wir humane γ-Sekretase zusammen mit künstlichen Substraten, die mit Gal4 fusioniert sind, eingeführt haben (Abbildung 1)10. Die Spaltungsreaktion wurde durch das Gal-Reportersystem verfolgt, entweder durch Überwachung des Hefewachstums oder Messung der β-Galactosidase-Aktivität. Darüber hinaus haben wir verschiedene Aβ-Formen (Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ43 und Aβ45) identifiziert, die in Hefemikrosomen durch Immunblotting freigesetzt werden (Abbildung 1)11.

Wenn FAD-bezogene PS1- oder APP-Mutanten in dieses System eingeführt wurden, wurden unterschiedliche Grade der Funktionsverlustaktivität beobachtet12. Wir führten ein wachstumsbasiertes Screening durch, um Suppressormutationen zu identifizieren, die die beeinträchtigte Funktion dieser FAD-Mutanten wiederherstellen (Abbildung 2). Diese Suppressoren retteten nicht nur den Defekt, sondern verstärkten auch unabhängig voneinander die Trimmaktivität der γ-Sekretase. Insbesondere reduzierten sie die Spiegel längerer Formen von Aβ, insbesondere von Aβ42, in ähnlicher Weise wie Aβ42-senkende γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs). Das Hefe-Rekonstitutionssystem ermöglicht das Screening von Mutationen, Genen und Verbindungen, die die Aktivität regulieren, einschließlich γ-Sekretase-Hemmer (GSI) und Modulator (GSM)13.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zwei Hauptziele zu erreichen: i) ein hefebasiertes γ-Sekretase-Screening-System zu etablieren und ii) ein Beispiel für Rekonstitutionstechniken für humane enzymatische Reaktionen in Hefe zu liefern, wobei das Wesentliche der Rekonstitutionsmethoden hervorgehoben wird. Wir skizzieren die Methoden in drei Schlüsselverfahren mit den folgenden wesentlichen Schritten: 1) Rekonstitution der γ-Sekretase in Hefe, 2) Durchführung eines in vitro γ-Sekretase-Assays mit Hefemikrosomen und 3-5) Screening γ-Sekretase-Mutationen und chemischen Regulatoren in Hefe.

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Protokoll

1. Messung der γ-Sekretase-Aktivität mit einem Hefe-Reportersystem

  1. Die Plasmide (Tabelle 1) werden unter Verwendung der Standard-Lithiumacetat-Methode in den Hefestamm PJ-69-4A (Tabelle 2) transformiert, um γ-Sekretase und ihr Substrat14 zu exprimieren. Um die Spaltungsreaktion zu rekonstituieren, transformieren Sie drei Plasmide: zwei für die γ-Sekretase und eines für das Substrat. Ausgewählte Transformanten auf SC-Agar-Medium ohne Leu, Trp und Ura (SC-LWU).
  2. Um die Substratspaltung durch Wachstum zu beurteilen, werden Streifenhefestämme auf SC-LWU-Medium aufgestreift, dem ebenfalls Histidin und Adenin (SC-LWHUAde) fehlen, und 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert.
  3. Verwenden Sie die Koloniegröße, um die Expressionsniveaus von HIS3 und ADE2 zu beurteilen. Die Koloniegröße wird wie folgt bewertet: +++ steht für Wildtyp-Wachstum mit Kolonien, die größer als 1 mm sind, - steht für kein Wachstum und ++ oder + steht für teilweises Wachstum mit Kolonien, die größer als 0,5 mm bzw. kleiner als 0,5 mm sind. Die Expression dieser Gene ist ein indirektes Maß für die γ-Sekretase-Aktivität (Abbildung 1).
  4. Um die Substratspaltung anhand der β-Galactosidase-Aktivität, d. h. des Expressionsniveaus von lacZ (Abbildung 1), zu beurteilen, züchten Sie Stämme in SC-LWU-Medium bei 30 °C, bis die Kultur eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml erreicht, was einem OD600 von 0,8-1,0 entspricht.
    1. Zellen aus einer 1,5 mL Kultur durch Zentrifugation in einem 1,5 mL Röhrchen bei 21.100 x g für 3 min bei 4 °C ernten, mit 100 μl eiskaltem Wasser waschen und in 30 μL D-Puffer (20 mM Tris/Cl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% Glycerin) mit 1 mM Dithiothreitol (DTT) und Proteasehemmer-Cocktails PIs/Wasser (1000x Lösung: 1 M p-Aminobenzamidin (pABA), 1 mg/ml Antischmerzmittel, 1 mg/ml Aprotinin, 1 mg/ml Leupeptin) und PIs/DMSO (1000x Lösung: 1 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 M N-p-Tosl-L-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK), 1 mg/ml Chymostatin, 1 mg/ml Pepstatin).
    2. Fügen Sie eine mit Säure gewaschene Glasperle direkt unter der Oberfläche der Lösung hinzu und lysieren Sie die Zellen, indem Sie die Mischung 1 Minute lang 10x bei maximaler Geschwindigkeit vortexen, während Sie sie in Abständen von 1 Minute auf Eis legen.
    3. Zentrifugieren Sie lysierte Zellen bei 21.100 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand als Rohlysat.
    4. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch mit 5-10 μl Rohlysat und 0,4 mL Z-Puffer (40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4) vor. Beginnen Sie die Reaktion mit der Zugabe von 80 μl 0,4%iger o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG)-Lösung und inkubieren Sie dann bei 37 °C, bis die Lösung aufgrund der Bildung von Nitrophenol blassgelb wird.
    5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 0,2 mL 1 M Na2CO3 -Lösung hinzufügen und die Extinktion bei 420 nm messen, um die β-Galactosidase-Aktivität zu berechnen.
    6. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in Rohlysaten unter Verwendung eines Protein-Assay-Kits, das auf der Bradford-Methode basiert und Rinderserumalbumin (BSA) als Standard verwendet. Bereiten Sie das Farbstoffreagenz vor, indem Sie 1 Teil des Farbstoffs mit 4 Teilen doppelt destilliertem deionisiertem (DDI) Wasser verdünnen.
    7. Mischen Sie 1-5 μl Lysat oder BSA-Lösung mit 100 μl verdünntem Farbstoff in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren und die Extinktion bei 595 nm messen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration anhand der BSA-Standardkurve.
      β-Galactosidase-Einheit = (1.000 x A420) / (t x c x V)
      wobei t = Inkubationszeit, c = Proteinkonzentration (mg/ml) und V = Lysatvolumen im Assay (ml) ist. Eine Einheit β-Galactosidase ist definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 μmol ONPG zu hydrolysieren, um o-Nitrophenol und D-Galactose pro Minute und mg Protein zu produzieren.
  5. Um die Expression der γ-Sekretase-Untereinheiten und der Substrate zu bestätigen, züchten Sie die Stämme in SC-LWU-Medium bei 30 °C, bis die Kultur OD600 0,8-1,0 erreicht.
    1. Zellen aus einer 10-ml-Kultur durch Zentrifugation in einem 50-ml-Röhrchen bei 2.100 x g für 10 min bei 4 °C ernten, mit 1 mL eiskaltem Wasser waschen, gefolgt von einer Zentrifugation in einem 1,5 mL Röhrchen bei 21.100 x g für 3 min bei 4 °C und resuspendieren in 100 μl B88-Puffer (20 mM Hepes/KOH (pH 6,8), 250 mM Sorbit, 150 mM KOAc, 5 mM Mg(OAc)2) mit 1 mM DTT und den Proteasehemmer-Cocktails, PIs/Wasser und PIs/DMSO.
    2. Fügen Sie Glaskügelchen direkt unter der Oberfläche der Lösung hinzu und lysieren Sie die Zelle, indem Sie 10x bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute vortexen, während Sie die Mischung für 1 Minute auf Eis halten.
    3. Lysat bei 845 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand als Gesamtlysat, das die Membranfraktion enthält, auffangen.
    4. 100 μl Gesamtlysat mit 96 mg Harnstoff und 40 μl 6x SDS-Probenpuffer (0,4 M Tris/Cl (pH 6,8), 12 % SDS, 0,6 M DTT, 0,05 % Bromphenolblau, 50 % Glycerin) mischen und 10 min bei 65 °C inkubieren. Die Zugabe von Harnstoff ist notwendig, um die Aggregation von Presenilin zu verhindern.
    5. Analysieren Sie die Expression von γ-Sekretase und ihren Substraten durch Proben auf 12,5 % Polyacrylamid-Tris/Glycin-Gelen und Immunblotting.
    6. Nachweis der γ-Sekretase und ihrer Substrate durch Antikörper gegen Presenilin, Nicastrin, Aph1, Gal4, FLAG, HA oder Pgk1 (Belastungskontrolle) und den Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper gegen Maus-IgG (für FLAG, HA und Pgk1), Kaninchen-IgG (für Presenilin, Aph1 und Gal4) oder Meerschweinchen-IgG (für Nicastrin).
    7. Für den Chemilumineszenz-Nachweis ist Lösung A (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 1,25 mM Luminol, 0,02 mM p-Cumarsäure) unmittelbar vor der Verwendung mit Lösung B (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 0,009 % H2O2) zu mischen. Inkubieren Sie den Klecks in einem ausreichenden Volumen der Mischung für 1 min. Das benötigte Volumen hängt von der Blot-Größe ab; Für einen 10 cm x 6 cm großen Blot werden 4 mL verwendet. Entwickeln Sie den Blot und quantifizieren Sie die Signalintensität mit dem Lumineszenz-Bildanalysator.

2. Messung der Aβ-Produktion mittels in vitro Mikrosomenassay

  1. Transformieren Sie APP C55, APP C99 oder γ-Sekretase-Plasmide (Tabelle 1) in den Hefestamm PJ-69-4A pep4Δ , wie in Schritt 1.1 beschrieben. um die γ-Sekretase und ihr Substrat getrennt zu exprimieren (Tabelle 2; γ311-, γ312- und γ313-Stämme)14. Wählen Sie die Stämme C55 und C99 auf dem SC-U-Agarmedium und den γ-Sekretase-Stamm auf dem SC-LW-Agarmedium.
  2. Isolierung von Mikrosomen aus Hefestämmen, die APP C55, APP C99 oder γ-Sekretase exprimieren, gemäß dem Standardprotokoll11. Trennen Sie die Mikrosomen durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation und gewinnen Sie sie an einer 1,2 M-1,5 M Saccharosegrenzfläche mit einer Einweg-Kunststoffpipette zurück. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in Mikrosomen, indem Sie die Absorption bei 260 nm messen, nachdem sie in 0,2 % SDS solubilisiert wurden.
  3. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch mit zwei Mikrosomen vor, d. h. APPC55 oder γ-Sekretase, die jeweils 40 μg Protein und γ-Puffer (50 mM PIPES/KOH (pH 7,0), 250 mM Saccharose, 1 mM EGTA) in einem Endvolumen von 12,5 μl enthalten. Solubilizieren Sie durch Mischen mit einem gleichen Volumen (12,5 μl) von 2 % CHAPSO in γ-Puffer und inkubieren Sie 1 h lang in 1 % CHAPSO.
  4. Um die Reaktion zu starten, verdünnen Sie die Mischungen vierfach auf ein Endvolumen von 100 μl mit γ-Puffer, der 1x Proteaseinhibitor (PI)-Mischung enthält: 50 μM Diisopropylfluorphosphat (DIFP), 50 μM PMSF, 0,1 μg/ml N α-p-Tosyl-L-Lysin-Lysin-Chlormethylketon (TLCK), 0,1 μg/ml Antischmerzmittel, 0,1 μg/ml Leupeptin, 0,1 mM EGTA, 1 mM Thiolphan und 5 mM Phenanthrolin (PNT) bis 0,25 % CHAPSO mit 400 μg/ml Proteinen. Das Reaktionsgemisch wird bei 37 °C 24 h lang inkubiert. Falls erforderlich, fügen Sie 0,1 % Phosphatidylcholin (PC), 10 μM L685,458 oder DAPT (γ-Sekretase-Hemmer) hinzu.
  5. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 μl Chloroform/Methanol (2:1) gestoppt und 1 h lang mit intermittierendem Vortexen inkubiert. 900 μl Methanol hinzufügen, mischen und 15 Minuten lang mit 21.100 x g zentrifugieren, um die Aβ-Peptide im Pellet zu sammeln.
  6. Waschen Sie das Pellet mit 500 μl Chloroform/Methanol/Wasser (1:2:0,8), lassen Sie es an der Luft trocknen, suspendieren Sie es in 40 μl SDS-Probenpuffer und kochen Sie die Mischung 10 Minuten lang. Analysieren Sie die Aβ-Produktion, indem Sie Proben auf einem 16,5%igen Tris/Tricin-Polyacrylamid-Gel durchführen. Zur Identifizierung der Aβ-Formen verwenden Sie ein 10%iges Tris/Tricin-Polyacrylamid-Gel mit 8 M Harnstoff (pH 8,45).
  7. Nachweis von Aβ durch Immunblotting unter Verwendung des Anti-Antikörpers 82E1, der spezifisch für die Asp-1-Stelle von humanem Aβ ist, und des HRP-konjugierten Sekundärantikörpers gegen Maus-IgG. Für den Nachweis von Chemilumineszenz mischen Sie unmittelbar vor der Verwendung gleiche Mengen von Lösung A und B, wie in Schritt 1.5.7 beschrieben, und inkubieren Sie den Blot in einem ausreichenden Volumen der Mischung für 1 min. Das benötigte Volumen hängt von der Blot-Größe ab; Für einen 10 cm x 6 cm großen Blot werden 4 mL verwendet.
  8. Entwickeln Sie den Blot und quantifizieren Sie die Signalintensität mit dem lumineszierenden Bildanalysator.

3. Screening auf γ-Sekretase- oder APP-Mutationen mit modulatorischer Wirkung

  1. Um zufällige Mutationen durch fehleranfällige PCR zu erzeugen, entwerfen Sie Primer so, dass 40 bp überlappende Regionen des interessierenden Gens am 5'-Ende jedes Primers enthalten sind.
  2. Bereiten Sie 50 μl fehleranfällige PCR-Reaktion in 1x Taq-Puffer mit 50 ng Template-DNA, 0,2 mM dGTP, 1 mM dATP/dTTP/dCTP, 3 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 1,25 U Taq-Polymerase und 400 nM Primern vor. Verwenden Sie das folgende PCR-Protokoll: 94 °C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen mit 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 120 s, endend mit 72 °C für 10 Minuten. Diese Einstellung ergibt eine ungefähre Mutationsrate von 1,9 Mutationen pro Kilobase10.
  3. Die mutagenisierten DNA-Fragmente (4 μg) mit linearisierter Plasmid-DNA (4 μg) werden in einen PJ69-4A-Hefestamm transformiert, der FAD-, APP- oder PS1-Mutationenenthält 14. Die Überlappung von 40 bp in den Primern erleichtert die homologe Rekombination zwischen den Fragmenten in der Hefe, was zur Rekonstruktion des Plasmids führt. Wählen Sie Transformatoren auf SC-LWU-Platten aus, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  4. Zählen Sie Transformanten auf SC-LWU-Platten und replizieren Sie sie mit Samt auf SC-LWHUAde-Platten. Um sie zu replizieren, drücke die Transformantenplatte auf einen mit Samt überzogenen zylindrischen Block und drücke dann eine frische SC-LWHUAde-Platte auf den Samt, um die Kolonien zu übertragen. Stämme, die APP- oder PS1-FAD-Mutanten exprimieren, wachsen schlecht auf SC-LWHUAde, während Stämme mit modulatorischen Mutationen ein robustes Wachstum aufweisen und Kolonien bilden.
  5. Um Plasmid-DNA aus positiven Klonen zu gewinnen, kultivieren Sie die Stämme über Nacht in 3 ml SC-LWU-Medium bei 30 °C bis OD600 >1,0. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen bei 2.100 x g für 10 min bei 4 °C, waschen Sie sie mit 0,8 mL eiskaltem Wasser, zentrifugieren Sie sie anschließend in einem 1,5 mL Röhrchen bei 21.100 x g für 3 min bei 4 °C und resuspendieren Sie sie dann in 0,3 mL Lyselösung (10 mM Tris/Cl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 % Triton X-100, 1 % SDS).
  6. Lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 0,3 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g Glasperlen. 10 min bei maximaler Drehzahl vortexen, dann 10 min bei Raumtemperatur bei 21.100 x g zentrifugieren.
  7. Nach der Zentrifugation trennt sich die Probe in eine obere wässrige Phase und eine untere Phenolphase. Die wässrige Phase wird zurückgewonnen und mit 30 μl 3 M Natriumacetat und 700 μl 100 % Ethanol gemischt. Vermeiden Sie die Einnahme von Materialien in der Zwischenphase.
  8. Die Lösung bei 21.100 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, das Pellet mit 70 % Ethanol waschen, an der Luft trocknen und in 15 μl TE-Puffer resuspendieren.
  9. Da die Konzentration der Plasmid-DNA für eine weitere Analyse in der Regel zu gering ist, ist es notwendig, sie in E. coli zu amplifizieren. Die Plasmid-DNA wird durch hocheffiziente Transformationsmethoden15 in E. coli DH5α umgewandelt und für die weitere Analyse aufgereinigt. Identifizierung von Mutationen durch DNA-Sequenzierung mit der Sanger-Methode16.
  10. Dieses Verfahren ist anwendbar auf mutagenisierte Plasmide, die nach verschiedenen Methoden hergestellt wurden (wie in den Schritten 3.1 und 3.2). Wenn Sie auf bestimmte Proteinregionen abzielen, entwerfen Sie inverse PCR-Primer mit zufälligen Nukleotiden. Nach PCR und Ligation zur Zirkularisierung der Plasmid-DNA wird eine Bibliothek mutagenisierter Plasmide erhalten. Führen Sie spezifische Mutationen mit dem ortsspezifischen Mutagenese-Kit ein.

4. Screening auf γ-Sekretase-Hemmer (GSI) in Hefe

  1. Verwenden Sie das chemische Hochdurchsatz-Screening von GSI, das auf der Grundlage des Hefewachstums oder des β-Galactosidase-Assays entwickelt wurde, wie unten beschrieben.
  2. Führen Sie ein GSI-Screening mit den Hefestämmen γ124, γ126 und γ190 durch (Tabelle 2). GSI-Kandidaten als Verbindungen auswählen, die das Wachstum oder die β-Galactosidase-Aktivität von Wildtyp-γ-Sekretase auf APP (γ124) und/oder Notch (γ126) reduzieren (Tabelle 3).
  3. Wählen Sie substratspezifische APP-schonende oder kerbschonende GSIs aus. Schließen Sie toxische Verbindungen durch Gegenscreening mit der löslichen Gal4-Expression aus. GSI-Kandidaten sollten das Wachstum oder die β-Galactosidase-Aktivität des Gal4-Kontrollstamms (γ190) nicht beeinflussen (Tabelle 3).
  4. Für den Wachstumsassay züchten Sie Stämme in SC-LWHUAde-Medium, die potenzielle GSIs in 384-Well-Platten von OD600 von 0,03 enthalten. Über Nacht bei 30 °C ohne Schütteln inkubieren. Überwachen Sie das Wachstum nach 24 h mit OD600.
  5. Für β-Galactosidase-Assays im 384-Well-Format züchten Sie Stämme bis zu einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml in SC-LWU-Medium, das potenzielle GSIs enthält. Lysieren Sie die Zellen mit dem Beta-Glo-Assay-System und messen Sie die β-Galactosidase-Aktivität mit 6-o-β-Galactopyranosyl-Luciferin als Substrat gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  6. Bei GSI-Kandidaten ist die Aβ-Produktion durch einen in vitro Mikrosomen-Assay zu messen, um die inhibitorische Wirkung zu bestätigen.

5. Screening auf γ-Sekretase-Modulator (GSM) in Hefe

  1. Verwenden Sie das chemische Hochdurchsatz-Screening von GSM, das auf der Grundlage von Hefewachstum oder β-Galactosidase-Assay entwickelt wurde, wie unten beschrieben.
  2. Führen Sie ein GSM-Screening mit den Hefestämmen γ106, γ112 und γ5 durch (Tabelle 2). Wählen Sie GSM-Kandidaten als Verbindungen aus, die das Wachstum oder die β-Galactosidase-Aktivität von FAD PS1 (γ106 und γ112) oder FAD APP-Mutantenstämmen verstärken (Tabelle 4). Schließen Sie unspezifische Reporteraktivatorchemikalien durch Gegenscreening mit dem Stamm ohne γ katalytische Sekretase-Untereinheit aus. GSM-Kandidaten sollten das Wachstum oder die β-Galactosidase-Aktivität des Kontrollstamms ohne PS1 (γ5) nicht beeinflussen (Tabelle 4).
  3. Für den Wachstumsassay werden Stämme in SC-LWHUAde-Medium gezüchtet, die potentielle GSMs in 384-Well-Platten von OD600 von 0,03 enthalten. Über Nacht bei 30 °C ohne Schütteln inkubieren. Überwachen Sie das Wachstum nach 48 h mit OD600.
  4. Für β-Galactosidase-Assays in einem 384-Well-Format züchten Sie Stämme auf eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml in SC-LWU-Medium, das potenzielle GSMs enthält. Lysieren Sie die Zellen mit dem Beta-Glo-Assay-System und messen Sie die β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung von 6-o-β-Galactopyranosyl-Luciferin als Substrat gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  5. Bei GSM-Kandidaten ist die Aβ-Produktion durch einen in vitro Mikrosomen-Assay zu messen, um den modulatorischen Effekt, d.h. die Reduktion der toxischen Aβ-Formen Aβ42 und Aβ43, zu bestätigen.

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Ergebnisse

Mit den bisher beschriebenen Techniken haben wir Gene, Mutationen, Chemikalien und Peptide als Faktoren analysiert, die die Aktivität der γ-Sekretase 10,11,12,13,17,18,19 beeinflussen. Das wachstumsbasierte Screening von Genen und Mutationen ermöglicht die U...

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Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung
Die Rekonstitution der γ-Sekretase in Hefe mit genetischen und biochemischen Methoden ist relativ einfach, aber es gibt einige entscheidende Schritte, um den Erfolg zu gewährleisten.

Während der Hefetransformation (Schritte 1.1, 2.1 und 3.3) sollten mehrere Plasmide eingeführt werden: zwei für die γ-Sekretase-Komponenten und eines für die Substrate. Eine sequenzielle Transformation (eine na...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI-Fördernummer 22K06121 unterstützt. Die Autoren danken den Mitgliedern des Labors für Enzymologie an der Tohoku-Universität für Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antikörper
Anti-AmyloidΒ (N) (82E1) AntikörperIBLKat# 10323
Anti-Aph1a, 245-265 (C-Terminus) AntikörperBioLegendKatze# 823101
Anti-FLAG (M2)-AntikörperSigmaKat# F3165
Anti-Gal4-AntikörperSigmaKat# G9293
Anti-HA (12CA5) AntikörperSigmaKat# 11 583 816 001
Anti-Nicastrin-AntikörperChemiconKat# AB5890
Anti-PGK1 (22C5D8) AntikörperabcamKat# ab197960
Anti-PS1 N-Terminus (G1Nr) oder Loop (GIL) AntikörperTakasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205
Anti Rabbit  IgG, HRP-gebundener AntikörperZellsignalübertragungKat# 7074
Anti-Meerschweinchen-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologieKat# sc-2438
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener AntikörperZellsignalübertragungKat# 7076
Bakterien- und Hefestämme
E. coli DH5αInvitrogenKatze# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4AJames P. et. al., Genetik 144:1425-1436 (1996)
Chemikalien, Peptide, rekombinante Proteine
(3,5-Difluorophenylacetyl)-Ala-phg-OBut (DAPT)PeptidinstitutCat# 3219-v
Amyloid & Beta;-Protein (Mensch, 1-38)PeptidinstitutKat# 4484-v
Amyloid & beta;-protein (Mensch, 1-40)PeptidinstitutKat# 4307-v
Amyloid & Beta;-Protein (Mensch, 1-42)PeptidinstitutKat# 4349-v
Amyloid & beta;-protein (Mensch, 1-43)PeptidinstitutKat# 4370-v
Antischmerz, DihydrochloridPeptidinstitutCat# 4062
AprotininSigmaKatze# A1153
CHAPSODojindoKat# 343-05163
ChymostatinSigmaKat# C7268
Diisopropylfluorphosphat (DIFP)Wako-ChemikalieKat# 049-18921
L685.458PeptidinstitutKat# 4394-v
LeupeptinPeptidinstitutKat# 4041
N-p-Tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon (TPCK)SigmaKatze# T4376
Nα -p-tosyl-L-lysin-chloromethylketon (TLCK)SigmaKat# T7254
o-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG)SigmaKat# N1127
p-Aminobenzamidin (pABA), DihydrochloridSigmaKatze# 857661
Pepstatin ASigmaKat# P5318
Phenanthrolin (PNT)SigmaKatze# P9375
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)SigmaKat# P7626
phosphatidylcholin (PC), Eigelb, Typ XVI-ESigmaKat# P3556
Taq-DNA-PolymeraseTakaraKatze# R001A
ThiolphanSigmaKatze# T6031
kommerzielle Testsets, andere Materialien und Instrumente
Beta-Glo-Assay-SystemPromegaKat# E4720
Bio-Rad Protein-Assay-KitBio-RadKatze# 5000001
Glasperlen, säuregewaschen (425-600 & mu; m)SigmaKat# G8772
ImageQuant LAS4000GE HealthcareImageQuant LAS4000
QuikChange standortgesteuertes Mutagenese-KitAgilentCat# 200518

Referenzen

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